本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋生物細胞的復蘇及傳代方法。
背景技術(shù)：
細胞培養(yǎng)技術(shù)也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對于整個生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細胞培養(yǎng)都是一個必不可少的過程，細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)?？寺 ＜毎囵B(yǎng)技術(shù)可以由一個細胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術(shù)必不可少的環(huán)節(jié)，而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。通過細胞培養(yǎng)得到大量的細胞或其代謝產(chǎn)物。因為生物產(chǎn)品都是從細胞得來，所以可以說細胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。
細胞培養(yǎng)技術(shù)具有以下優(yōu)點：能長期傳代，保持活性，便于監(jiān)控檢測結(jié)構(gòu)功能和生命活動。培養(yǎng)條件可以人為的控制便于研究細胞代謝、物理、化學、生物因素的影響?？捎糜诟鞣N觀察和檢測手段研究活細胞的變化（變異、分化），可從細胞水平開展亞細胞結(jié)構(gòu)和代謝分子的表達。研究范圍和細胞來源廣泛，選擇性廣。不同代次細胞可長期保存，既可開展同代次不同條件和方法研究，又可觀察不同代次的動態(tài)變化。耗資少、經(jīng)濟、成本低、可大量培養(yǎng)，利于生物制品的生產(chǎn)。
因此，海洋生物的研究也越來越多的用到細胞培養(yǎng)技術(shù)，在實際操作中，細胞經(jīng)常要經(jīng)歷凍存、復蘇、傳代等操作。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述問題，本發(fā)明正是提供一種海洋生物細胞的復蘇及傳代方法。
一種海洋生物細胞的復蘇及傳代方法，包括如下步驟：
（1）細胞的復蘇：
將凍存的細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴，在1分鐘內(nèi)解凍；在超凈工作臺里，用75%的酒精將凍存管外壁消毒；另將3.5mL RPMI1640培養(yǎng)液、0.5mL血清加入細胞培養(yǎng)瓶中，再將1mL凍存管中的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，逐滴加入并不時的搖動培養(yǎng)瓶使其均勻；12h后給細胞換液，除去細胞凍存液中的DMSO。
（2）細胞的傳代：
待細胞長滿80%細胞培養(yǎng)瓶時即細胞處于對數(shù)生長期，傾去細胞培養(yǎng)液，加入少量的胰酶蕩洗一次，再加入1.5mL胰酶消化，顯微鏡下觀察，當細胞間質(zhì)回縮，細胞間隙清晰時，棄去胰酶，加入4mL Ham’sF-12K/DMEM/RPMI1640培養(yǎng)液充分吹打至顯微鏡下觀察為單細胞懸液；分裝懸液細胞于若干培養(yǎng)瓶中，含10%血清的Ham’sF-12K/DMEM/RPMI1640，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
本發(fā)明的海洋生物細胞復蘇及傳代方法，操作簡單方便，對細胞的損傷小，污染幾率降低，細胞的生長狀態(tài)良好。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
一種海洋生物細胞的復蘇及傳代方法，包括如下步驟：
（1）細胞的復蘇：
將凍存的細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴，在1分鐘內(nèi)解凍；在超凈工作臺里，用75%的酒精將凍存管外壁消毒；另將3.5mL RPMI1640培養(yǎng)液、0.5mL血清加入細胞培養(yǎng)瓶中，再將1mL凍存管中的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，逐滴加入并不時的搖動培養(yǎng)瓶使其均勻；12h后給細胞換液，除去細胞凍存液中的DMSO。
（2）細胞的傳代：
待細胞長滿80%細胞培養(yǎng)瓶時即細胞處于對數(shù)生長期，傾去細胞培養(yǎng)液，加入少量的胰酶蕩洗一次，再加入1.5mL胰酶消化，顯微鏡下觀察，當細胞間質(zhì)回縮，細胞間隙清晰時，棄去胰酶，加入4mL Ham’sF-12K/DMEM/RPMI1640培養(yǎng)液充分吹打至顯微鏡下觀察為單細胞懸液；分裝懸液細胞于若干培養(yǎng)瓶中，含10%血清的Ham’sF-12K/DMEM/RPMI1640，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。