本申請(qǐng)要求2014年7月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/022,392的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及冷凍細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的方法，用于在冷凍細(xì)胞中使用的建庫(kù)(banking)和冷凍介質(zhì)。

背景技術(shù)：

通過(guò)首先在分批/灌注細(xì)胞培養(yǎng)方法中積累細(xì)胞、然后收獲細(xì)胞用于建庫(kù)來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞庫(kù)。該方法包括三個(gè)階段：細(xì)胞積累、收獲和細(xì)胞濃縮、以及細(xì)胞建庫(kù)。收獲方法步驟用于濃縮最終的細(xì)胞培養(yǎng)液或使用離心從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取細(xì)胞。隨后的匯集和填充方法用于制備用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存的細(xì)胞庫(kù)安瓿。

這些傳統(tǒng)方法可能導(dǎo)致選定細(xì)胞系解凍后不一致或差的生存力。細(xì)胞建庫(kù)方法必要的是在解凍冷凍細(xì)胞后需要高的細(xì)胞生存力。因此，改進(jìn)的用于細(xì)胞建庫(kù)的冷凍細(xì)胞的方法是期待的。在建庫(kù)后解凍時(shí)允許更大細(xì)胞生存力的用于冷凍細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基將是有益的。

本文中出于所有目的引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本文提供了一種改善細(xì)胞庫(kù)的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍用于建庫(kù)的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH或在冷凍之前已經(jīng)調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5的pH。

在另一方面，本文提供了冷凍用于儲(chǔ)存的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍細(xì)胞，其中冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH或在冷凍之前已經(jīng)調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5的pH。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8或約7.5的pH。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基的pH已經(jīng)調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5、約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8、或約7.5。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，在pH調(diào)節(jié)之前和/或之后將細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)與冷凍培養(yǎng)基組合。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)的pH是目標(biāo)pH或測(cè)量pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH之前測(cè)量含有細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基的初始pH的步驟。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括測(cè)量調(diào)節(jié)的冷凍培養(yǎng)基的pH的步驟。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，如果冷凍培養(yǎng)基的測(cè)量pH低于目標(biāo)pH，則所述方法包括重復(fù)調(diào)節(jié)步驟和測(cè)量步驟，直到調(diào)節(jié)的冷凍培養(yǎng)基的pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在本文或上文所述方法的一些實(shí)施方案中，通過(guò)加入堿來(lái)調(diào)節(jié)pH。在一些實(shí)施方案中，堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)下式V_堿＝C_堿*V_p(pH_t-pH_i)通過(guò)向冷凍培養(yǎng)基中加入堿調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中C_堿是堿特異性系數(shù)，V_堿是加入到冷凍培養(yǎng)基中的堿的體積，V_p是冷凍培養(yǎng)基的體積，pH_t是目標(biāo)pH，pH_i是初始pH。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)下式V_Na2CO3＝0.0085V_p(pH_t-pH_i)通過(guò)向冷凍培養(yǎng)基中加入碳酸鈉調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中V_Na2CO3是加入到冷凍培養(yǎng)基中的1M碳酸鈉的體積，V_p是冷凍培養(yǎng)基的體積，pH_t是目標(biāo)pH，pH_i是初始pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH是介于約6.7至約8.5之間、約7.2至約8.3之間或本文所述的任何pH或任何pH范圍內(nèi)的pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為7.5。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合之前，細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)在pH約6.2至約6.6的培養(yǎng)基中。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，低溫防護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜)、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其組合。在一些實(shí)施方案中，冷凍之前冷凍培養(yǎng)基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約12.5％，以體積計(jì)。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)之前冷凍培養(yǎng)基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約10％，以體積計(jì)。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，含有細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基在冷凍前具有約8％至約28％的收集細(xì)胞體積(packed cell volume)(PCV)的細(xì)胞密度。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)與冷凍培養(yǎng)基組合之前、在細(xì)胞收獲和濃縮過(guò)程中冷卻細(xì)胞培養(yǎng)液的步驟。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約20℃的溫度。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約10℃的溫度。

在另一方面，本文提供了冷凍用于儲(chǔ)存的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)或改善細(xì)胞庫(kù)的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括(a)將含有細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至pH約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑；和(b)冷凍細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，將pH調(diào)節(jié)至約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8、或約7.5。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)的pH是目標(biāo)pH或測(cè)量pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為約7.5。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH之前測(cè)量含有細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基的初始pH的步驟。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括測(cè)量冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH的步驟。在一些實(shí)施方案中，如果冷凍培養(yǎng)基的測(cè)量pH低于目標(biāo)pH，則該方法包括重復(fù)調(diào)節(jié)步驟和測(cè)量步驟，直到冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH為約6.7至約8.5、約7.2至約8.3、或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，通過(guò)加入堿來(lái)調(diào)節(jié)pH。在一些實(shí)施方案中，堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)下式V_堿＝C_堿*V_p(pH_t-pH_i)通過(guò)向冷凍培養(yǎng)基中加入堿調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中C_堿是堿特異性系數(shù)，V_堿是加入到冷凍培養(yǎng)基中的堿的體積，V_p是冷凍培養(yǎng)基的體積，pH_t是目標(biāo)pH，pH_i是初始pH。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)下式V_Na2CO3＝0.0085V_p(pH_t-pH_i)通過(guò)向冷凍培養(yǎng)基中加入碳酸鈉調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中V_Na2CO3是加入到冷凍培養(yǎng)基中的1M碳酸鈉的體積，V_p是冷凍培養(yǎng)基的體積，pH_t是目標(biāo)pH，pH_i是初始pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH是約6.7至約8.5、或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為約7.5。

在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合之前，細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)在pH為約6.2至約6.6的培養(yǎng)基中。

在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基中的低溫防護(hù)劑是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其組合。在一些實(shí)施方案中，在冷凍之前含有細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約12.5％，以體積計(jì)。在一些實(shí)施方案中，在冷凍細(xì)胞之前，含有細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約10％，以體積計(jì)。

在一些實(shí)施方案中，含有細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約8％至約28％收集細(xì)胞體積(PCV)的細(xì)胞密度。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)與冷凍培養(yǎng)基組合之前、在細(xì)胞收獲和濃縮過(guò)程中冷卻細(xì)胞培養(yǎng)液的步驟。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約20℃，或等于或低于約10℃的溫度。

在另一方面，本文提供了冷凍用于儲(chǔ)存的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞等)或改善細(xì)胞庫(kù)的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括(a)將冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至pH為約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑；(b)將細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合以形成細(xì)胞池；和(c)冷凍細(xì)胞池中的細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，將pH調(diào)節(jié)至約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8、或約7.5。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)的pH是目標(biāo)pH或測(cè)量pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在一些實(shí)施方案中，該方法還包括測(cè)量冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH的步驟。在一些實(shí)施方案中，如果冷凍培養(yǎng)基的測(cè)量pH低于目標(biāo)pH，則該方法還包括重復(fù)調(diào)節(jié)步驟和測(cè)量步驟，直到冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，通過(guò)加入堿來(lái)調(diào)節(jié)pH。在一些實(shí)施方案中，堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合之前，細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)在具有pH為約6.2至約6.6的培養(yǎng)基中。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基中的低溫防護(hù)劑是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其組合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞池中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約12.5％，以體積計(jì)，或約5％至約10％，以體積計(jì)。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞池含有細(xì)胞密度為約8％至約28％收集細(xì)胞體積(PCV)的細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)。

在上述或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)與冷凍培養(yǎng)基組合之前、在細(xì)胞收獲和濃縮過(guò)程中冷卻細(xì)胞培養(yǎng)液的步驟。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約20℃的溫度。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約10℃的溫度。

在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NS0鼠骨髓瘤細(xì)胞、人細(xì)胞或雜交瘤。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)包含編碼多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，多肽是治療性蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)選自抗體、抗體片段、酶和受體融合蛋白。

在另一方面，本文提供用于冷凍細(xì)胞的真核細(xì)胞池(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞池或昆蟲(chóng)細(xì)胞池)，其包含緩沖溶液、低溫防護(hù)劑和包含編碼多肽的核酸的真核細(xì)胞，其中培養(yǎng)基在冷凍細(xì)胞之前具有約6.7至約8.5或約7.2至約8.3的pH(或本文所述的任何pH或任何pH范圍)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NS0鼠骨髓瘤細(xì)胞、人細(xì)胞或雜交瘤。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)包含編碼多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，多肽是治療性蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)選自抗體、抗體片段、酶和受體融合蛋白。

另一方面，本文提供了包含多個(gè)容器的細(xì)胞庫(kù)，每個(gè)容器含有(a)包含緩沖液和低溫防護(hù)劑的冷凍介質(zhì)，和(b)包含編碼多肽的核酸的真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)，其中冷凍培養(yǎng)基在冷凍細(xì)胞之前具有約6.7至約8.5或約7.2至約8.3的pH(或本文所述的任何pH或任何pH范圍)。在一些實(shí)施方案中，容器是安瓿。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NS0鼠骨髓瘤細(xì)胞、人細(xì)胞或雜交瘤。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)包含編碼多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，多肽是治療性蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)選自抗體、抗體片段、酶和受體融合蛋白。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的各種實(shí)施方案的一種、一些或所有性質(zhì)可以組合以形成本發(fā)明的其它實(shí)施方案。本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了細(xì)胞建庫(kù)方法流程的示例。

圖2A-2B顯示了在初始pH6.6或6.3的pH調(diào)節(jié)池中產(chǎn)生的細(xì)胞庫(kù)的解凍傳代第1天生存力(圖2A)和第4天生長(zhǎng)(PCV)(圖2B)的結(jié)果。

圖3A-3F顯示了解凍傳代第1天生存力(圖3A、3C和3E)和PCV的整體生長(zhǎng)率(圖3B、3D和3F)相對(duì)建庫(kù)pH，和將pH調(diào)節(jié)至一個(gè)目標(biāo)pH范圍對(duì)九個(gè)CHO細(xì)胞系(每個(gè)產(chǎn)生不同的抗體(抗體1-9))的影響。

圖4A-4B顯示了解凍傳代活細(xì)胞密度(VCD)或活細(xì)胞計(jì)數(shù)(VCC)(圖4A)和生存力(％)(圖4B)趨勢(shì)，其證明了從初始池pH 6.3調(diào)節(jié)pH至7.5相對(duì)無(wú)pH調(diào)節(jié)的影響。

圖5顯示了在合并過(guò)程中活收集細(xì)胞體積(VPCV)與活細(xì)胞計(jì)數(shù)(VCC)的比率，其是估計(jì)細(xì)胞大小的間接方法。數(shù)據(jù)顯示了冷凍介質(zhì)(FM)添加和pH調(diào)節(jié)至pH 7.3、7.6或8.0對(duì)細(xì)胞大小的影響。較大的比率表示較大的細(xì)胞大小。

圖6A-6B顯示了在t0(圖6A)和t2(2小時(shí))(圖6B)時(shí)、在初始pH 6.4(目標(biāo)6.2)或6.6(目標(biāo)6.7)的pH調(diào)節(jié)池產(chǎn)生的細(xì)胞庫(kù)的PCV解凍傳代整體生長(zhǎng)率結(jié)果。

詳細(xì)說(shuō)明

本文提供了改善細(xì)胞庫(kù)的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍用于建庫(kù)的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH。

本文還提供了冷凍用于儲(chǔ)存的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍細(xì)胞，其中冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH。

本文還提供了冷凍用于儲(chǔ)存的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)或改善細(xì)胞庫(kù)的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括(a)將含有細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至pH約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑；和(b)冷凍細(xì)胞。

本文還提供了冷凍用于儲(chǔ)存的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)或改善細(xì)胞庫(kù)的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括(a)將冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至pH約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑；(b)將細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合以形成細(xì)胞池；和(c)在細(xì)胞池中冷凍細(xì)胞。

本文還提供了用于冷凍真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)的真核細(xì)胞池，其包含緩沖溶液、低溫防護(hù)劑和包含編碼多肽的核酸的真核細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基在冷凍細(xì)胞之前具有約6.7至約8.5的pH。

本文還提供了包含多個(gè)容器的細(xì)胞庫(kù)，每個(gè)容器包含(a)包含緩沖液和低溫防護(hù)劑的冷凍培養(yǎng)基，和(b)包含編碼多肽的核酸的真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)，其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍細(xì)胞之前具有約6.7至約8.5的pH。

定義

術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”和“細(xì)胞培養(yǎng)基”是指用于維持細(xì)胞的溶液。培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含用于生長(zhǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)源。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，營(yíng)養(yǎng)源可以包含細(xì)胞用于生長(zhǎng)和/或存活所需的成分，或者可以包含有助于細(xì)胞生長(zhǎng)和/或存活的成分。維生素、必需或非必需氨基酸和微量元素是培養(yǎng)基組分的實(shí)例。

“基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基”是指包含細(xì)胞生長(zhǎng)和存活所需的基本營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基?；A(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的實(shí)例包Eagle氏最低必須培養(yǎng)基(Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM))和Dulbecco改良的Eagle氏培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))。

“化學(xué)上確定的細(xì)胞培養(yǎng)基”或“CDM”是具有確定組合物的培養(yǎng)基，其不含來(lái)源于動(dòng)物或植物的產(chǎn)物，如，例如動(dòng)物血清和植物蛋白胨。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，CDM可以用于多肽生產(chǎn)過(guò)程，其中細(xì)胞與CDM接觸并將多肽分泌到CDM中。因此，應(yīng)當(dāng)理解，組合物可以含有CDM和多肽產(chǎn)物，并且多肽產(chǎn)物的存在不會(huì)使CDM在化學(xué)上不確定。

“化學(xué)上不確定的細(xì)胞培養(yǎng)基”是指其化學(xué)組分不能被確定并且可以包含一種或多種源自動(dòng)物或植物來(lái)源的產(chǎn)物的培養(yǎng)基，例如動(dòng)物血清或植物蛋白胨。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，化學(xué)上不確定的細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有來(lái)源于動(dòng)物或植物的產(chǎn)物作為營(yíng)養(yǎng)源。

“冷凍培養(yǎng)基”、“細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基”或“用于冷凍的細(xì)胞培養(yǎng)基”是指含有低溫防護(hù)劑的緩沖溶液。冷凍培養(yǎng)基可用于冷凍包含在冷凍培養(yǎng)基中的細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)。本文所用的“緩沖溶液”是指水基、等滲的pH緩沖鹽溶液，其用于保持細(xì)胞膜的完整性，并用作一種或多種低溫防護(hù)劑的載體。冷凍培養(yǎng)基還可以含有細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的額外組分。緩沖液的實(shí)例可包括碳酸氫鹽緩沖液、PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)、TEST(TES/TRIS組合)、及其組合。培養(yǎng)基的實(shí)例可包括Eagle氏最低必須培養(yǎng)基(EMEM)和Dulbecco改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)。低溫防護(hù)劑保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷，并且可以分類(lèi)為能夠穿過(guò)質(zhì)膜的“滲透型”(例如甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇等)或“非滲透型”(例如大分子、糖等)。

“培養(yǎng)”細(xì)胞是指在適合細(xì)胞存活和/或生長(zhǎng)和/或增殖的條件下使細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸。

“批次培養(yǎng)”是指在培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)始時(shí)將用于細(xì)胞培養(yǎng)的所有組分(包括細(xì)胞和所有培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物)供應(yīng)到培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)。

本文所用的短語(yǔ)“補(bǔ)料批次細(xì)胞培養(yǎng)”是指批次培養(yǎng)，其中最初供應(yīng)細(xì)胞和培養(yǎng)基到培養(yǎng)容器中，并且在培養(yǎng)終止之前、在培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)地或離散增量地向培養(yǎng)中補(bǔ)料額外的培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物，有或沒(méi)有周期性細(xì)胞和/或產(chǎn)物收獲。

“灌注培養(yǎng)”是通過(guò)例如過(guò)濾、包封、錨定到微載體上等將細(xì)胞限制在培養(yǎng)物中的培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基連續(xù)或間歇地引入并從培養(yǎng)容器中取出。

“細(xì)胞建庫(kù)”或“建庫(kù)”是將細(xì)胞冷凍至低于零度(sub-zero)的溫度(冷凍保存)以停止酶/化學(xué)反應(yīng)、從而將細(xì)胞保持在活的狀態(tài)用于以后使用的方法。冷凍細(xì)胞可以在低于約0℃(例如，-20℃、-70℃、-80℃或更低)下儲(chǔ)存用于以后使用。例如，細(xì)胞可以?xún)?chǔ)存在安瓿中，以氣相放置在-196℃的包含液氮的冷凍器中。

“培養(yǎng)容器”是指用于培養(yǎng)細(xì)胞的容器。培養(yǎng)容器可以是任何大小，只要其可用于培養(yǎng)細(xì)胞。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“滴度”是指通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組表達(dá)的多肽的總量除以給定量的培養(yǎng)基體積。效價(jià)通常以每毫升培養(yǎng)基的多肽毫克數(shù)為單位表示。

如本文可互換使用的“核酸”是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或其類(lèi)似物，或可以通過(guò)DNA或RNA聚合酶或通過(guò)合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其類(lèi)似物。如果存在，可以在聚合物組裝之前或之后賦予核苷酸結(jié)構(gòu)修飾。

“分離的核酸”是指在其通常環(huán)境之外或與之分離的并包括非天然存在的、重組的或天然存在的序列。分離的核酸分子不是其在自然界中存在的形式或設(shè)置。因此，分離的核酸分子不同于存在于天然細(xì)胞中的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括在通常表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞中包含的核酸分子，例如其中該核酸分子存在于與天然細(xì)胞不同的染色體位置。

“分離的”蛋白質(zhì)(例如分離的抗體)是已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分中鑒定和分離和/或回收的蛋白質(zhì)。其天然環(huán)境的污染物組分是干擾蛋白質(zhì)的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。分離的蛋白質(zhì)包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位蛋白質(zhì)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)天然環(huán)境的至少一種組分將不存在。然而，通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備分離的蛋白質(zhì)。

“純化的”多肽是指多肽的純度已經(jīng)提高，使得其以比在其天然環(huán)境中存在和/或在實(shí)驗(yàn)室條件下最初產(chǎn)生時(shí)和/或合成時(shí)和/或擴(kuò)增時(shí)更純的形式存在。純度是相對(duì)術(shù)語(yǔ)，并不一定意味著絕對(duì)純度。

“污染物”是指不同于所需多肽產(chǎn)物的物質(zhì)。污染物包括但不限于：宿主細(xì)胞材料，如宿主細(xì)胞蛋白；核酸；所需多肽的變體、片段、聚集體或衍生物；另一種多肽；內(nèi)毒素；病毒污染物；細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)組分等。污染物還可以包括通過(guò)純化過(guò)程引入的物質(zhì)，如過(guò)濾的蛋白A。

術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語(yǔ)還包括已經(jīng)天然修飾或通過(guò)干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其它操作或修飾，如與標(biāo)記組分的綴合。還包括在定義內(nèi)的是，例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類(lèi)似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本領(lǐng)域已知的其它修飾。包含在本文定義內(nèi)的多肽的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物蛋白，如腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和β；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，如β-內(nèi)酰胺酶；DNase；IgE；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白A或D；類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-b；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；尋靶受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整合素如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2，HER3或HER4受體；免疫粘附素；以及任何上述列出的蛋白質(zhì)的片段和/或變體，以及與蛋白質(zhì)(包括例如任何上述蛋白質(zhì))結(jié)合的抗體，包括抗體片段。

本文中的術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣泛的含義使用，并且特別涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展示所需的生物活性?？贵w可以是人、人源化的和/或親和力成熟的。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即包含各抗體的群體是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突變。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以被未被其它抗體污染的合成。修飾語(yǔ)“單克隆”不應(yīng)解釋為需要通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)多種技術(shù)制備，包括例如雜交瘤方法(例如，Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling等人,在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中)，在細(xì)菌、真核動(dòng)物或植物細(xì)胞中的重組DNA方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567))；噬菌體展示技術(shù)(參見(jiàn)例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)和用于在動(dòng)物中產(chǎn)生人或人樣抗體的技術(shù)，所述動(dòng)物具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因(參見(jiàn)例如WO1998/24893；WO1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。

術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”是指這樣形式的制劑，其允許活性成分的生物活性是有效的，并且其不含有施用該制劑的受試者不可接受的毒性的額外成分。這樣的制劑是無(wú)菌的。

“藥學(xué)上可接受的”載體、賦形劑或穩(wěn)定劑是對(duì)以所采用的劑量和濃度暴露于其中的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無(wú)毒的那些載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences(第20版)，A.Gennaro編輯，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。通常生理學(xué)上可接受的載體是水性pH緩沖溶液。生理學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括緩沖液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑，如Tween^TM、聚乙二醇(PEG)和Pluronics^TM。

如本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中所使用的，除非內(nèi)容另有明確規(guī)定，否則單數(shù)形式“a”、“an”和“the(該)”包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提及“化合物(a compound)”任選地包括兩種或更多種這樣的化合物的組合等。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的本發(fā)明的方面和實(shí)施方案包括“包含”、“由...組成”和“基本上由...組成”的方面和實(shí)施方案。

本文中對(duì)“約”某值或某參數(shù)的引用包括(描述)涉及該值或該參數(shù)本身的實(shí)施方案。例如，涉及“約X”的描述包括“X”的描述。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。

在馬庫(kù)什組或其它替代物組的方面描述本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓桨笗r(shí)，本發(fā)明不僅包括作為整體列出的整個(gè)組，還單獨(dú)地包括該組的每個(gè)成員和主組的所有可能的亞組，還包括缺少一個(gè)或多個(gè)組成員的主組。本發(fā)明還設(shè)想在所要求保護(hù)的發(fā)明中明確排除任何組成員中的一個(gè)或多個(gè)。

II.本發(fā)明的方法和用途

本文提供在細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基中冷凍用于培養(yǎng)或儲(chǔ)存的細(xì)胞的方法。本文還提供改善細(xì)胞庫(kù)的解凍復(fù)蘇的方法。方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍細(xì)胞的步驟，其中冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中含有細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5或約6.7至約8.3的pH值。該方法可以進(jìn)一步包括將冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5或約6.7至約8.3的步驟。本文提供的方法可用于制備主細(xì)胞庫(kù)(MCB)和工作細(xì)胞庫(kù)(WCB)。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法改善解凍后的細(xì)胞生存力和/或細(xì)胞生長(zhǎng)。

用于冷凍和建庫(kù)方法中的真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法包括細(xì)胞培養(yǎng)和濃縮方案制備。方法可以包括細(xì)胞建庫(kù)之前的細(xì)胞積累、收獲和細(xì)胞濃縮。細(xì)胞積累可通過(guò)幾種方法發(fā)生。一個(gè)實(shí)例可以使用過(guò)程控制的生物反應(yīng)器用于細(xì)胞積累；然而，也可以使用其它方法/培養(yǎng)容器(例如T-燒瓶、搖瓶、滾瓶、旋轉(zhuǎn)容器等)。收獲和細(xì)胞濃縮可以通過(guò)離心以及隨后將細(xì)胞沉淀物重懸于冷凍培養(yǎng)基中進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)例中，可以通過(guò)中空纖維過(guò)濾器(HFF)在單一步驟中收獲和濃縮細(xì)胞。也可以通過(guò)使用替代性灌注膜/裝置從細(xì)胞培養(yǎng)液中除去培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)細(xì)胞濃縮(例如漂浮灌注膜、細(xì)胞沉淀器、連續(xù)循環(huán)離心機(jī)等)。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，將收獲和細(xì)胞濃縮過(guò)程或收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約20℃(例如，等于或低于約19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃和10℃)。

然后，在冷凍細(xì)胞之前，可以將沉淀或濃縮的細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合。在一些實(shí)施方案中，沉淀的細(xì)胞可以重懸于冷凍培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方案中，可將含有濃縮的低溫防護(hù)劑的冷凍培養(yǎng)基加入到收獲和濃縮的細(xì)胞中，或者可將收獲和濃縮的細(xì)胞加入到含有濃縮的低溫防護(hù)劑的冷凍培養(yǎng)基中用于細(xì)胞建庫(kù)。冷凍培養(yǎng)基可以包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中的緩沖液可以包含兩性離子緩沖液。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中的緩沖液可以包含選自碳酸氫鹽緩沖液、PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)、TEST(TES/TRIS組合)及其組合的緩沖液。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞之前冷凍培養(yǎng)中的緩沖液濃度為約10mM至約50mM。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞之前冷凍培養(yǎng)基含有約10mM至約35mM碳酸氫鈉(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM或約35mM，包括在這些值之間的任何濃度)。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞之前冷凍培養(yǎng)基含有約10mM至約50mM HEPES(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM或約50mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞之前冷凍培養(yǎng)基含有約10mM至約12mM PBS(例如約10mM、約11mM或約12mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞之前冷凍培養(yǎng)基含有約10mM至約20mM MOPS(例如約10mM、約12mM、約15mM、約18mM或約20mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞之前冷凍培養(yǎng)基含有約10mM至約30mM TES(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM或約30mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞之前冷凍培養(yǎng)基含有約10mM至約30mM TRIS(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM或約30mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞之前冷凍培養(yǎng)基含有約10mM至約30mM TEST(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM或約30mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實(shí)施方案中，低溫防護(hù)劑是滲透劑或非滲透劑。在一些實(shí)施方案中，低溫防護(hù)劑是選自甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇和糖的試劑。在一些實(shí)施方案中，添加到收獲和濃縮細(xì)胞中的冷凍培養(yǎng)基是濃縮的冷凍培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，含有濃縮的低溫防護(hù)劑的冷凍培養(yǎng)基可以含有20-30％(v/v)二甲基亞砜(DMSO)或甘油。在一些實(shí)施方案中，將濃縮的冷凍培養(yǎng)基(例如，1份冷凍培養(yǎng)基(含有濃縮的低溫防護(hù)劑)體積：3份細(xì)胞培養(yǎng)液)倒入收獲和濃縮細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，在冷凍細(xì)胞之前含有細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基含有約5％至約12.5％的DMSO或甘油。

在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的額外組分。在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基可以含有Eagle氏最低必須培養(yǎng)基(EMEM)或Dulbecco改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)。

在一些實(shí)施方案中，制備用于冷凍的細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的方法可以進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基或包含濃縮的低溫防護(hù)劑的冷凍培養(yǎng)基的pH的步驟，其中在沉淀的細(xì)胞或濃縮的細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基或含有濃縮的低溫防護(hù)劑的冷凍培養(yǎng)基組合之前，將pH調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5。在一些實(shí)施方案中，制備用于冷凍的細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的方法還包括調(diào)節(jié)含有細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的pH的步驟，其中冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)的pH是目標(biāo)pH或測(cè)量pH。

在某些實(shí)施方案中，在冷凍之前通過(guò)收集細(xì)胞體積(PCV)測(cè)量細(xì)胞密度。在一些實(shí)施方案中，包含待建庫(kù)細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有8％至28％(例如，約8％、10％、15％、20％、25％或28％中的任一)PCV的細(xì)胞密度。在一些實(shí)施方案中，冷凍之前冷凍培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度可以為約21％PCV。

在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基中的細(xì)胞在冷凍之前分配到安瓿或一次性袋中。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，該方法包括：使用高壓滅菌自填充注射器將細(xì)胞懸液分配到置于濕冰上的高壓滅菌的玻璃安瓿中，密封安瓿，進(jìn)行完整性測(cè)試，并在速率控制的冷凍器中冷凍安瓿，然后將安瓿轉(zhuǎn)移到液氮冷凍器中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用本文所述的方法改善解凍后的細(xì)胞生存力。在一些實(shí)施方案中，與在pH 6.7或更低的冷凍培養(yǎng)基中冷凍和/或在收獲過(guò)程和解凍期間不冷卻收獲細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞生存力相比，細(xì)胞生存力增加至少約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或85％中的任意。

pH調(diào)節(jié)

根據(jù)本文所述的方法，可以調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基(含有或不含細(xì)胞)的pH，例如通過(guò)向培養(yǎng)基中加入堿。在一些實(shí)施方案中，將冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至高于約6.7的pH。在一些實(shí)施方案中，將冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約6.7和約8.5之間的pH(目標(biāo)pH或測(cè)量pH)。在一些實(shí)施方案中，將冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約6.8至約8.3之間、約6.9至約8.3之間、約7.0至約8.3之間、約7.1至約8.3之間、約7.2至約8.3之間、約7.3至約8.3之間、約7.4至約8.3之間，約7.5至約8.3之間、約7.6至約8.3之間、約7.7至約8.3之間、或約7.8至約8.3之間。在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約7.2至約7.8之間的pH(目標(biāo)pH或測(cè)量pH)。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH或測(cè)量pH為約7.2至約8.3。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH或測(cè)量pH為約7.2至約7.8(例如約7.5的pH)。在一些實(shí)施方案中，如果第一pH調(diào)節(jié)不足以將pH增加至目標(biāo)pH范圍(例如，pH為約7.3至約7.7)，則進(jìn)行第二pH調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行多于一次pH調(diào)節(jié)。

加入以調(diào)節(jié)pH的堿可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何堿，但是在示例性實(shí)施方案中，堿是碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉或氫氧化鉀。

可以在冷凍之前的任何點(diǎn)測(cè)量冷凍介質(zhì)的pH，并且可以在冷凍之前的任何時(shí)間調(diào)節(jié)pH。在一些實(shí)施方案中，在與待建庫(kù)的細(xì)胞組合之前測(cè)量和/或調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH。在其它實(shí)施方案中，在與待建庫(kù)的細(xì)胞組合之后測(cè)量和/或調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH。在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基的pH被測(cè)量和/或調(diào)節(jié)多于一次。在一些實(shí)施方案中，在冷凍之前測(cè)量和/或調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH兩次、三次或更多次。在其它實(shí)施方案中，在與待建庫(kù)的細(xì)胞組合之前和之后測(cè)量和/或調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)以下公式調(diào)節(jié)pH：V_堿＝C_堿*V_p(pH_t-pH_i)，其中C_堿是堿特異性系數(shù)，V_堿是加入到冷凍培養(yǎng)基的堿的體積，V_p是冷凍培養(yǎng)基的體積，pH_t是目標(biāo)pH，pH_i是初始pH。如本文所用，初始pH是含有細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的pH(即其與細(xì)胞組合之后)，但是在調(diào)節(jié)pH用于冷凍之前的pH。C_堿表示取決于為了pH調(diào)節(jié)選擇的堿的類(lèi)型和濃度的特異性系數(shù)?？梢愿鶕?jù)堿的選擇獲得C_堿系數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，其中堿為1M碳酸鈉，根據(jù)下式1進(jìn)行pH調(diào)節(jié)：

公式1：計(jì)算用于pH值調(diào)節(jié)添加的堿的體積

V_Na2CO3＝0.0085·V_p·(pH_t-pH_i)

其中V_Na2CO3是添加到冷凍培養(yǎng)基中的1M碳酸鈉的體積，V_p是冷凍培養(yǎng)基的體積，pH_t是目標(biāo)pH，pH_i是初始pH。初始pH是含有細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的pH(即其與細(xì)胞組合之后)，但在調(diào)節(jié)pH用于冷凍之前。冷凍培養(yǎng)基的目標(biāo)pH可以是高于生理pH的pH，例如高于7.2的pH。在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基的目標(biāo)pH在7.2和8.3之間。在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基的目標(biāo)pH在7.2和7.8之間。在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基的目標(biāo)pH為7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2和8.3中的任意。

可以使用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)量冷凍培養(yǎng)基的pH。例如，培養(yǎng)基的pH可以在400(Nova Biomedical)或 FLEX(Nova Biomedical)分析儀上測(cè)量。如本文所用，本申請(qǐng)中對(duì)pH的所有提及，包括測(cè)量pH、目標(biāo)pH、調(diào)節(jié)的pH和初始pH，是指在樣品溫度調(diào)節(jié)至約37℃(例如，36℃至38℃之間或35℃至39℃之間)時(shí)測(cè)量的pH。

III.冷凍介質(zhì)

本文提供的細(xì)胞冷凍介質(zhì)可用于方法(例如，冷凍真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)中；和/或改善包含真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的細(xì)胞庫(kù)的解凍復(fù)蘇的方法和組合物(例如，包含緩沖溶液、低溫防護(hù)劑和真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)的細(xì)胞池)中。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑。在一些實(shí)施方案中，緩沖液包含兩性離子緩沖液。在一些實(shí)施方案中，緩沖液包括PBS、HEPES、TES、TRIS和TEST。

冷凍培養(yǎng)基可以包含本領(lǐng)域已知的和本文所述的任何低溫防護(hù)劑，如DMSO、甘油、乙二醇、不滲透的大分子、糖等。在一些實(shí)施方案中，在與待建庫(kù)的細(xì)胞組合之后在細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基中DMSO或甘油的濃度為5％-12.5％(v/v)，以體積計(jì)。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)將含有濃縮緩沖液和/或低溫防護(hù)劑的冷凍培養(yǎng)基加入到濃縮細(xì)胞中來(lái)提供冷凍培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基濃縮低溫防護(hù)劑可以含有約20％至約30％(v/v)DMSO或甘油。

在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基可以包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的額外組分。在一些實(shí)施方案中，可以向本文所述的冷凍培養(yǎng)基中加入適于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Ham's F10(Sigma)、最低必需培養(yǎng)基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle氏培養(yǎng)基([DMEM]，Sigma)用于冷凍哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此外，可以如本文詳述地補(bǔ)充或修飾在Ham和Wallace,Meth.Enz.,58:44(1979),Barnes和Sato,Anal.Biochem.,102:255(1980),Vijayasankaran等人,Biomacromolecules.,6:605:611(2005),Patkar等人,J Biotechnology,93:217-229(2002),美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,767,704；4,657,866；4,927,762或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)Re.30,985；或美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,122,469中描述的任何介質(zhì)，所有這些專(zhuān)利的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，本文詳述的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基可以包含可用于細(xì)胞培養(yǎng)或冷凍的其它組分。例如，應(yīng)當(dāng)理解，培養(yǎng)基可以包含額外的組分，如氨基酸(例如谷氨酰胺、精氨酸或天冬酰胺)，維生素(包括但不限于B族維生素，如維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6、維生素B7、維生素B9或維生素B12)，過(guò)渡金屬(包括但不限于鎳、鐵(例如三價(jià)鐵或亞鐵)或鋅)和其它介質(zhì)組分。本文提供的任何介質(zhì)也可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)，離子(例如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)和葡萄糖或等效能量源。在一些方面，本文提供的冷凍培養(yǎng)基含有源自植物或動(dòng)物的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本文提供的冷凍培養(yǎng)基不含源自植物或動(dòng)物的蛋白質(zhì)。也可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)濃度包括任何其它必需的補(bǔ)充物。

如本文所述的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基(細(xì)胞池)可以進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)待建庫(kù)的細(xì)胞。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，這些細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞。可用于本文所述方法的示例性細(xì)胞類(lèi)型包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NS0鼠骨髓瘤細(xì)胞、人細(xì)胞和雜交瘤。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，這些細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是包含編碼多肽(例如治療性蛋白質(zhì))的異源核酸的重組細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，這些細(xì)胞可以進(jìn)一步包含重組質(zhì)?；蚱渌杏玫纳锘衔?。在一些實(shí)施方案中，待建庫(kù)的細(xì)胞可用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)和生物產(chǎn)品，如抗體、抗體片段、酶、受體融合蛋白或其片段。

IV.真核細(xì)胞和細(xì)胞庫(kù)

本文還提供了包含多個(gè)容器的細(xì)胞庫(kù)，每個(gè)容器含有包含真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)的冷凍培養(yǎng)基，所述真核細(xì)胞包含編碼多肽的核酸(例如異源核酸)，其中所述培養(yǎng)基在冷凍細(xì)胞之前具有約6.7至約8.5的pH。細(xì)胞庫(kù)可以是前庫(kù)(Prebank)、主細(xì)胞庫(kù)(MCB)或工作細(xì)胞庫(kù)(WCB)。前庫(kù)(Prebank)可以包含含有產(chǎn)生特定多肽的細(xì)胞的冷凍(例如，儲(chǔ)存在液氮冷凍器中)容器(例如，安瓿)，從其制備MCB。MCB可以包含含有衍生自Prebank次培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物的冷凍(例如，儲(chǔ)存在液氮冷凍器中)容器(例如安瓿)，從其獲得所有用于生產(chǎn)的后續(xù)細(xì)胞。MCB根據(jù)cGMP產(chǎn)生和儲(chǔ)存，并可用于生產(chǎn)多肽產(chǎn)物。WCB可以包含含有源自MCB次培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物的冷凍(例如，儲(chǔ)存在液氮冷凍器中)容器(例如安瓿)。WCB根據(jù)cGMP產(chǎn)生和儲(chǔ)存，并可用于生產(chǎn)多肽產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，容器是安瓿。

如本文所述可以在冷凍培養(yǎng)基中冷凍并保存的真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等)可以包括可以培養(yǎng)和/或可用于產(chǎn)生多肽的任何真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。CHO細(xì)胞可包括但不限于DHFR-CHO細(xì)胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))，例如 CRL-9096^TM；和CHO-K1( CRL-61^TM)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的其它實(shí)例包括但不限于由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(293或293細(xì)胞亞克隆用于在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34)；大鼠(buffalo rat)肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細(xì)胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝癌細(xì)胞系(Hep G2)。其它有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括骨髓瘤細(xì)胞系，如NS0和Sp2/0。對(duì)于適合于抗體生產(chǎn)的某些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述，參見(jiàn)例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，248(B.K.C.Lo，編輯，Humana Press，Totowa，N.J.，2003)，第255-268頁(yè)。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞系，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)包含編碼多肽的核酸(例如異源核酸)，并且所述細(xì)胞可用于產(chǎn)生多肽。在一些實(shí)施方案中，將核酸引入細(xì)胞中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的用于將核酸引入細(xì)胞中的任何方法。例如，可以用包含一種或多種編碼多肽的核酸的載體(例如，表達(dá)載體)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是穩(wěn)定的細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，多肽選自抗體、抗體片段、酶和受體融合蛋白。

多肽的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物蛋白，如腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，如β-內(nèi)酰胺酶；DNase；IgE；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白A或D；類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-b；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；尋靶受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整合素如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2，HER3或HER4受體；免疫粘附素；以及任何上述列出的蛋白質(zhì)的片段和/或變體，以及與蛋白質(zhì)(包括例如任何上述蛋白質(zhì))結(jié)合的抗體，包括抗體片段。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)包含編碼抗體的核酸。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，并且不應(yīng)解釋為需要通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)多種技術(shù)制備，包括例如雜交瘤方法(例如,Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版 1988)；Hammerling等人,在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中),重組DNA方法(參見(jiàn),例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567),噬菌體展示技術(shù)(參見(jiàn)，例如,Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004),和在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中產(chǎn)生人或人樣抗體的技術(shù)(參見(jiàn)，例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和 5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；和Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。在一些實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、源自文庫(kù)的抗體或多特異性抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是其抗原結(jié)合片段?？乖Y(jié)合片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；雙抗體；直連抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。Fab片段含有重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同在于通過(guò)在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加幾個(gè)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH是本文對(duì)Fab'的命名，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基帶有游離巰基。F(ab')₂抗體片段最初作為Fab'片段對(duì)產(chǎn)生，在Fab'片段對(duì)之間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的?！癋v”是含有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。通常，scFv多肽還包含VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使得scFv能夠形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述，參見(jiàn)，例如，Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol 113，Rosenburg and Moore編輯，(Springer-Verlag，New York，1994)，第269-315頁(yè)中。用于純化上述抗體的許多方法可以適合于純化抗原結(jié)合抗體片段。

在一些實(shí)施方案中，由細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中的核酸編碼的抗體，包括治療性和診斷性抗體。在本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體包括但不限于：抗HER2抗體，包括曲妥珠單抗(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,725,856)；抗-CD20抗體，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,736,137中的嵌合抗-CD20“C2B8”如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,721,108B1中的2H7抗體的嵌合或人源化變體，或Tositumomab抗IL-8(St John等人，Chest，103：932(1993)和國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 95/23865)；抗-VEGF抗體，包括人源化和/或親和力成熟的抗-VEGF抗體，如人源化抗-VEGF抗體huA4.6.1(Kim等人,Growth Factors,7:53-64(1992)，國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 96/30046和WO 98/45331，1998年10月15日公開(kāi))；抗-PSCA抗體(WO01/40309)；抗-CD40抗體，包括S2C6及其人源化變體(WO00/75348)；抗-CD11a(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,622,700，WO98/23761，Steppe等人，Transplant Intl.4：3-7(1991)和Hourmant等人，Transplantation 58：377-380(1994))；抗-IgE(Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993)和國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 95/19181)；抗-CD18(1997年4月22日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利5,622,700，或1997年7月31日公開(kāi)的WO 97/26912)；抗-IgE(包括E25，E26和E27；1998年2月3日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,714,338或1992年2月25日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,091,313，1993年3月4日公開(kāi)的WO 93/04173，或1998年6月30日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US98/13410，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,714,338)；抗-Apo-2受體抗體(1998年11月19日公開(kāi)的WO 98/51793)；抗-TNF-α抗體，包括cA2CDP571和MAK-195(參見(jiàn)1997年9月30日公布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,672,347，Lorenz等人，J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)和Dhainaut等人，Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗組織因子(TF)(1994年11月9日授權(quán)的歐洲專(zhuān)利號(hào)0 420 937B1)；抗人α₄β₇整聯(lián)蛋白(1998年2月19日公開(kāi)的WO 98/06248)；抗-EGFR(如1996年12月19日公開(kāi)的WO 96/40210中的嵌合或人源化225抗體)；抗-CD3抗體如OKT3(1985年5月7日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,515,893)；抗-CD25或抗-tac抗體如CHI-621和(參見(jiàn)1997年12月2日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,693,762)；抗-CD4抗體如cM-7412抗體(Choy等人，Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；抗-CD52抗體如CAMPATH-1H(Riechmann等人，Nature 332：323-337(1988))；抗-Fc受體抗體，如Graziano等人，J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的針對(duì)Fc.gamma.RI的M22抗體；抗癌胚抗原(CEA)抗體如hMN-14(Sharkey等人，Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995))；針對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的抗體，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等人，Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等人，Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；結(jié)合結(jié)腸癌細(xì)胞的抗體如C242(Litton等人，Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗-CD38抗體，例如AT 13/5(Ellis等人，J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗-CD33抗體如Hu M195(Jurcic等人，Cancer Res 55(23Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗-CD22抗體如LL2或LymphoCide(Juweid等人，Cancer Res 55(23Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗-EpCAM抗體如17-1A抗-GpIIb/IIIa抗體如abciximab或c7E3Fab抗RSV抗體如MEDI-493抗-CMV抗體如抗-HIV抗體如PRO542；抗肝炎抗體如抗-Hep B抗體抗-CA 125抗體OvaRex；抗獨(dú)特型GD3表位抗體BEC2；抗αvβ3抗體抗人腎細(xì)胞癌抗體如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗體(3622W94)；抗人結(jié)腸直腸腫瘤抗體(A33)；針對(duì)GD3神經(jīng)節(jié)苷脂的抗人黑素瘤抗體R24；抗人鱗狀細(xì)胞癌(SF-25)；和抗人白細(xì)胞抗原(HLA)抗體如Smart ID10和抗HLA DR抗體Oncolym(Lym-1)。本文抗體的優(yōu)選靶抗原是：HER2受體、VEGF、IgE、CD20、CD11a和CD40。

提供以下實(shí)施例以說(shuō)明而非限制本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1：池pH、保持溫度和保持時(shí)間對(duì)解凍的細(xì)胞生存力的影響

堿添加方法控制建庫(kù)pH(小規(guī)模研究#1)

進(jìn)行研究以測(cè)量從最壞情況進(jìn)行簡(jiǎn)單的pH調(diào)節(jié)和典型池條件(目標(biāo)初始pH分別為6.2和6.7)增強(qiáng)解凍復(fù)蘇的可行性。研究了幾個(gè)pH調(diào)節(jié)目標(biāo)以確定最佳的建庫(kù)pH。使用400(Nova Biomedical)儀器，溫度設(shè)置為37℃測(cè)量pH。類(lèi)似地，使用公式1的pH計(jì)算基于37℃的樣品溫度。

通過(guò)離心使細(xì)胞沉淀。通過(guò)將細(xì)胞在消耗培養(yǎng)基(spent media)中重懸浮至100×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，為每個(gè)測(cè)試條件產(chǎn)生細(xì)胞池。將細(xì)胞池在37℃下攪拌，具有或不具有用于CO₂/O₂交換的氣體滲透膜，以將pH驅(qū)動(dòng)至初始pH條件(6.2或6.7)。在達(dá)到初始pH目標(biāo)時(shí)，將池快速冷卻至<10℃，并加入20％(v/v)DMSO冷凍介質(zhì)(1:3份細(xì)胞培養(yǎng)液)。使用公式1計(jì)算所需的將pH調(diào)節(jié)到目標(biāo)pH 6.9、7.1和7.3的1M碳酸鈉的體積，并進(jìn)行最終離線pH測(cè)量以確認(rèn)在模擬庫(kù)生成之前pH的適當(dāng)增加(實(shí)際建庫(kù)pH為6.9、7.1/7.2和7.5)。

解凍結(jié)果顯示出高達(dá)68％的第1天生存力的顯著改善(對(duì)于從pH6.2調(diào)整至7.5，從24％至92％)(圖2A)，并且第4天PCV的改善高達(dá)0.64％(對(duì)于從pH 6.2調(diào)整至7.5，從0.17％至0.81％)(圖2B)。

公式1：計(jì)算為了pH調(diào)節(jié)添加的堿體積

V_Na2CO3＝0.0085·V_p·(pH_t-pH_i)

其中V_Na2CO3＝加入的1M碳酸鈉的體積，V_p＝池的體積，

pH_t＝目標(biāo)pH，pH_i＝初始pH，

堿添加方法控制建庫(kù)pH(附加的小規(guī)模pH研究)

按照上述類(lèi)似步驟，進(jìn)行幾個(gè)研究以研究pH調(diào)節(jié)對(duì)其它細(xì)胞系的影響。

選擇涵蓋多種細(xì)胞類(lèi)型(DP12，CHO-K1)的總共9個(gè)CHO細(xì)胞系。在建庫(kù)之前的幾天，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案維持細(xì)胞。通過(guò)離心使細(xì)胞沉淀，對(duì)于每個(gè)測(cè)試條件通過(guò)在消耗培養(yǎng)基中重懸至28％收集細(xì)胞體積(PCV)，產(chǎn)生約60-90mL的模擬池。在37℃下攪拌池，具有或不具有用于CO₂/O₂交換的氣體滲透膜，以將pH驅(qū)動(dòng)至初始pH條件(6.2或6.7)。選擇這兩個(gè)初始pH設(shè)定點(diǎn)以模擬在中空纖維過(guò)濾器濃縮期間和之后經(jīng)歷的潛在最壞情況和典型條件。在達(dá)到初始pH目標(biāo)時(shí)，將池快速冷卻至<10℃，并加入20％(v/v)DMSO冷凍介質(zhì)(1:3份細(xì)胞培養(yǎng)液)，達(dá)到21％的最終PCV。在使用公式1計(jì)算調(diào)整至pH 7.0、7.3、7.6或8.0所需加入的1M碳酸鈉的體積之后，進(jìn)行pH調(diào)整。進(jìn)行最終離線pH測(cè)量以確認(rèn)在細(xì)胞庫(kù)產(chǎn)生之前pH的適當(dāng)增加。

所有情況一式兩份解凍，一個(gè)安瓿解凍到每個(gè)容器中。結(jié)果表明，之前暴露于較低pH的所有細(xì)胞類(lèi)型在建庫(kù)前調(diào)節(jié)至高于7.3的pH值時(shí)可以恢復(fù)。每個(gè)細(xì)胞系表現(xiàn)出對(duì)建庫(kù)pH的不同敏感性。在大多數(shù)情況下，調(diào)節(jié)至約7.5的pH導(dǎo)致第1天解凍生存力高于80％(圖3A-3F和圖4A-4B)。解凍后的生長(zhǎng)率僅在所測(cè)試的pH范圍的較低端受到影響。有趣的是，測(cè)試的pH范圍的較高端(接近8.0-8.2)沒(méi)有負(fù)面影響解凍復(fù)蘇，盡管其顯著大于正常生理pH。

擴(kuò)大研究(測(cè)試CHO-K1細(xì)胞類(lèi)型)以獲得關(guān)于長(zhǎng)期暴露于高pH的更多信息。這些研究測(cè)試了在(t0)pH調(diào)節(jié)之后即刻冷凍的模擬建庫(kù)(類(lèi)似于所有以前的小規(guī)模測(cè)試情況)和在兩個(gè)小時(shí)后的第二時(shí)間點(diǎn)(t2)冷凍的模擬建庫(kù)。在保持2小時(shí)的期間，將微型池(每個(gè)情況約10mL)保持在浸沒(méi)于濕冰中的管中。在保持步驟中存在輕微的pH漂移，導(dǎo)致高達(dá)0.2pH單位的變化。這些研究結(jié)果表明，在本研究中暴露于測(cè)試的pH范圍兩小時(shí)沒(méi)有影響(圖6A-6B中顯示了一個(gè)實(shí)例)。

收獲期間冷凍細(xì)胞培養(yǎng)液的方法

采用“慢泵收獲”方法與冷卻熱交換器組合以將冷卻能力引入傳統(tǒng)的細(xì)胞建庫(kù)方法中。具體來(lái)說(shuō)，“慢泵收獲”方法需要將典型的收獲流速?gòu)募s4L/分鐘降低到600mL/分鐘以匹配對(duì)于傳統(tǒng)細(xì)胞建庫(kù)生產(chǎn)運(yùn)行所記錄的收獲速率。將冷卻熱交換器管線，大小15'長(zhǎng)度的15號(hào)鉑固化硅膠管完全浸沒(méi)在濕冰中，插入收獲流路中。在用水模擬運(yùn)行期間獲得的溫度趨勢(shì)表明“冷卻收獲方法”能夠在中空纖維過(guò)濾器濃縮之前的最初30分鐘內(nèi)將培養(yǎng)溫度降低至約12℃。基于10℃的數(shù)據(jù)，這種冷卻能力可能暫停細(xì)胞代謝并防止低pH漂移。

方法確認(rèn)研究結(jié)果

細(xì)胞建庫(kù)方法。通過(guò)首先在批次/灌注細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中積累懸浮-適應(yīng)的CHO細(xì)胞、然后收獲細(xì)胞用于建庫(kù)來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞的初始來(lái)源是來(lái)自MCB(用于WCB代)。該方法包括三個(gè)階段：細(xì)胞積累、收獲和細(xì)胞濃縮、以及細(xì)胞建庫(kù)。細(xì)胞積累步驟的目的是在單一批次中產(chǎn)生生產(chǎn)全尺寸MCB或WCB(分別為420×1mL或10mL安瓿)所需的細(xì)胞數(shù)。在初始放大期間和在搖擺生物反應(yīng)器過(guò)程期間，在選擇性接種培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞。收獲過(guò)程步驟用于通過(guò)中空纖維過(guò)濾器(HFF)將最終細(xì)胞培養(yǎng)液濃縮至用于建庫(kù)所需的細(xì)胞密度。隨后的匯集和填充過(guò)程用于制備細(xì)胞庫(kù)安瓿用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存。匯集過(guò)程保持在濕冰上，使得保持一定的溫度范圍(約5-10℃)。該過(guò)程的處理流程如圖1所示。

使用中空纖維濾筒進(jìn)行收獲和細(xì)胞濃縮過(guò)程。離線pH趨勢(shì)顯示“冷卻收獲方法”在細(xì)胞濃縮過(guò)程中有效降低pH下降約0.35pH單位(對(duì)于原始和“冷凍”過(guò)程分別從至6.66)。在pH調(diào)節(jié)后，在早(0分鐘)和晚(120分鐘)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生冷卻的細(xì)胞庫(kù)，以檢查細(xì)胞池保持pH的瞬時(shí)影響。

評(píng)估所得細(xì)胞庫(kù)在原代培養(yǎng)中的性能。使用系列1:250稀釋(1:10，然后1:25)將細(xì)胞庫(kù)安瓿解凍至搖瓶而不是生物反應(yīng)器中。解凍結(jié)果成功地證明了目前的方法(冷卻收獲和pH調(diào)節(jié))能夠遞送具有可接受的解凍性能的庫(kù)。然而，從原始過(guò)程產(chǎn)生的細(xì)胞庫(kù)經(jīng)歷了生存力的下降，這些新的細(xì)胞庫(kù)是一致的，并且在第1天生存力范圍為79.1-85.3％(約65％改善)。當(dāng)細(xì)胞隨時(shí)間保持在升高的pH下時(shí)，沒(méi)有觀察到不利影響。

分析顯示來(lái)自調(diào)節(jié)至較高pH的池的細(xì)胞尺寸較小(圖5)。這種觀察到的尺寸改變可能指示較高的pH引起細(xì)胞脫水(可能來(lái)自增加的滲透壓或允許細(xì)胞收縮的增加的細(xì)胞膜彈性，或兩者)。

結(jié)論

確定建庫(kù)pH對(duì)解凍后性能是最關(guān)鍵的，影響第1天解凍生存力高達(dá)65％。因此，設(shè)計(jì)對(duì)收獲和建庫(kù)步驟有促進(jìn)作用的方法以減緩細(xì)胞暴露于低pH并改善對(duì)建庫(kù)pH的控制。最終，對(duì)該方法引入了兩種促進(jìn)作用，包括：1)在收獲期間用硅膠管熱交換器冷卻細(xì)胞培養(yǎng)液；和2)使用pH調(diào)節(jié)步驟增加建庫(kù)pH至7.5。