本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)：

癌癥一直是困擾人類的巨大難題。我國每年新發(fā)腫瘤病例約為312萬例，平均每天8550人意味著每分鐘就有6人就診斷為惡性腫瘤，這些數(shù)據(jù)都表明，癌癥依然是威脅健康的一大殺手。多年來，癌癥治療的方法主要是手術(shù)、化療和放療，對腫瘤患者的臨床治療有效率仍舊很低，據(jù)統(tǒng)計，同一種抗腫瘤藥物的有效率僅為25％。針對同一種腫瘤，用同樣的藥、標(biāo)準(zhǔn)劑量的治療方法，在不同病人身上所起的療效及毒副作用卻有很大的差異。造成這種結(jié)果的主要原因在于，腫瘤是一種多病因、異質(zhì)性的疾病。過去十年來，依賴于患者個體生物標(biāo)志物的腫瘤個性化治療正在逐漸取代依據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗的治療模式，并展現(xiàn)出優(yōu)越的療效和廣闊的前景，如伊馬替尼和曲妥珠單抗。

免疫療法是繼手術(shù)、化療、放療和靶向療法后出現(xiàn)的一種新型療法，被稱為治療癌癥的“第五大療法”。它是利用患者自身免疫系統(tǒng)的力量來抵抗癌癥；癌癥免疫療法主要包括過繼性細(xì)胞治療、免疫調(diào)節(jié)劑、腫瘤疫苗以及免疫結(jié)合點阻斷治療等。雖然有關(guān)免疫治療的研究早在30年前就已開展，最近兩年《細(xì)胞》、《科學(xué)》、《自然》等國際頂級期刊刊出多項該領(lǐng)域的突破研究成果，制藥巨頭也不斷推出此類型的重磅療法。2014年12月6號至9號在舊金山舉行的美國血液學(xué)會年會(ASH)上，癌癥免疫療法可謂是賺足了眼球，CAR-T療法更是備受關(guān)注。

CART的概念是以色列ZeligEshhar博士上世紀(jì)80年代提出的，1989首次開發(fā)出嵌合抗原受體T細(xì)胞。CART療法即嵌合抗原受體T細(xì)胞療法，繞過了PD療法啟動過繼免疫應(yīng)答這一難關(guān)，開創(chuàng)了跨越式發(fā)展的醫(yī)學(xué)史新篇章。CART針對那不怎么靠譜的過繼免疫，引入全新的概念與方法，成功地誘導(dǎo)出抗癌的過繼免疫應(yīng)答。首先CART解決了抗原的難題。既然在自然的狀況下免疫系統(tǒng)找不到抗原，那就人為指定一種抗原?？疾旒毙粤馨虰細(xì)胞白血病的CART療法。淋巴B細(xì)胞表面有一個分化抗原CD19，無論是正常B細(xì)胞還是癌變B細(xì)胞都有表達(dá)。選CD19為靶抗原可以確保沒有漏網(wǎng)之魚。接下來，怎樣確保T細(xì)胞能找到CD19靶抗原？這也是CART的核心技術(shù)。自然的T細(xì)胞肯定不會將CD19當(dāng)作靶抗原的。CD19表達(dá)于正常B細(xì)胞，T細(xì)胞對CD19耐受。CART將一個抗原受體嵌合到T細(xì)胞表面。這抗原受體本質(zhì)是一種抗體，對CD19有很高的親和性。兩者碰到就會結(jié)合，不離不棄。于是，用抗體蛋白聯(lián)接定位，T細(xì)胞就釘住了癌細(xì)胞。所以有一比喻，這抗原受體就像GPS，給T細(xì)胞導(dǎo)航，為找到目標(biāo)提供了保證?？贵w又是怎樣插入進(jìn)T細(xì)胞的？這是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)實現(xiàn)的。這里轉(zhuǎn)染的并不是抗體本身而是編碼抗體的基因，也就是說轉(zhuǎn)染的是DNA。轉(zhuǎn)染的DNA會編碼抗體然后表達(dá)于T細(xì)胞表面?，F(xiàn)有的嵌合抗原受體T細(xì)胞制作不標(biāo)準(zhǔn)，較為繁瑣，不具有流程化操作，為此我們提出了一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法。

本發(fā)明提出的一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

S1，將血液轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋，混合均勻；

S2，將3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，將混合液放入離心管中，并將離心管豎直放置在操作臺上，將稀釋好的血液放入二分之一，并緩慢攪拌，靜止1-2min后，再加入剩余的二分之一血液，緩慢攪拌直至混合均勻；

S3，將S2中加好血液、泛影葡胺與Ficoll溶液的離心管放置在離心機(jī)，在20-30℃的溫度下離心25-45min；

S4，將S3中離心后的離心管移至操作臺，取中間的白膜層即淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板上；

S5，將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h；

S6，將S5中培養(yǎng)后的培養(yǎng)板上加入病毒，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)5-10天；

S7，檢測培養(yǎng)板上的細(xì)胞，并確定T細(xì)胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備。

優(yōu)選地，所述生理鹽水與血液的體積比為1：1-2。

優(yōu)選地，所述生理鹽水與血液的體積比為1：2。

優(yōu)選地，所述泛影葡胺的質(zhì)量體積濃度為340g/L。

優(yōu)選地，所述S3中，將S2中加好血液、泛影葡胺與Ficoll溶液的離心管放置在離心機(jī)，在25℃的溫度下離心35min。

優(yōu)選地，所述S4中，操作臺為超凈操作臺。

優(yōu)選地，所述S5中，培養(yǎng)箱的溫度為36-38℃，培養(yǎng)箱內(nèi)的二氧化碳為4-10％。

優(yōu)選地，所述S5中，培養(yǎng)箱的溫度為37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)的二氧化碳為7％。

本發(fā)明中，先將血液轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋，混合均勻，將泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，并將混合液放入離心管中，將稀釋好的血液放入二分之一，并緩慢攪拌，靜止1-2min后，再加入剩余的二分之一血液，緩慢攪拌直至混合均勻，將加好血液、泛影葡胺與Ficoll溶液的離心管放置在離心機(jī)，在20-30℃的溫度下離心25-45min，將離心后的離心管移至操作臺，取中間的白膜層即淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板上，將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，將培養(yǎng)后的培養(yǎng)板上加入病毒，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)5-10天，檢測培養(yǎng)板上的細(xì)胞，并確定T細(xì)胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備，本發(fā)明制備的嵌合抗原受體T細(xì)胞具有一定的功能活性，可以為腫瘤治療提供技術(shù)方向。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步解說。

實施例一

本發(fā)明提出的一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

S1，將血液轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋，混合均勻；

S2，將3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，將混合液放入離心管中，并將離心管豎直放置在操作臺上，將稀釋好的血液放入二分之一，并緩慢攪拌，靜止1min后，再加入剩余的二分之一血液，緩慢攪拌直至混合均勻；

S3，將S2中加好血液、泛影葡胺與Ficoll溶液的離心管放置在離心機(jī)，在20℃的溫度下離心25min；

S4，將S3中離心后的離心管移至操作臺，取中間的白膜層即淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板上；

S5，將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

S6，將S5中培養(yǎng)后的培養(yǎng)板上加入病毒，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)5天；

S7，檢測培養(yǎng)板上的細(xì)胞，并確定T細(xì)胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備。

實施例二

本發(fā)明提出的一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

S1，將血液轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋，混合均勻；

S2，將3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，將混合液放入離心管中，并將離心管豎直放置在操作臺上，將稀釋好的血液放入二分之一，并緩慢攪拌，靜止1。2min后，再加入剩余的二分之一血液，緩慢攪拌直至混合均勻；

S3，將S2中加好血液、泛影葡胺與Ficoll溶液的離心管放置在離心機(jī)，在22℃的溫度下離心30min；

S4，將S3中離心后的離心管移至操作臺，取中間的白膜層即淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板上；

S5，將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30h；

S6，將S5中培養(yǎng)后的培養(yǎng)板上加入病毒，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)6天；

S7，檢測培養(yǎng)板上的細(xì)胞，并確定T細(xì)胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備。

實施例三

本發(fā)明提出的一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

S1，將血液轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋，混合均勻；

S2，將3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，將混合液放入離心管中，并將離心管豎直放置在操作臺上，將稀釋好的血液放入二分之一，并緩慢攪拌，靜止1.5min后，再加入剩余的二分之一血液，緩慢攪拌直至混合均勻；

S3，將S2中加好血液、泛影葡胺與Ficoll溶液的離心管放置在離心機(jī)，在25℃的溫度下離心35min；

S4，將S3中離心后的離心管移至操作臺，取中間的白膜層即淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板上；

S5，將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h；

S6，將S5中培養(yǎng)后的培養(yǎng)板上加入病毒，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)7天；

S7，檢測培養(yǎng)板上的細(xì)胞，并確定T細(xì)胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備。

實施例四

本發(fā)明提出的一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

S1，將血液轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋，混合均勻；

S2，將3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，將混合液放入離心管中，并將離心管豎直放置在操作臺上，將稀釋好的血液放入二分之一，并緩慢攪拌，靜止1.8min后，再加入剩余的二分之一血液，緩慢攪拌直至混合均勻；

S3，將S2中加好血液、泛影葡胺與Ficoll溶液的離心管放置在離心機(jī)，在28℃的溫度下離心40min；

S4，將S3中離心后的離心管移至操作臺，取中間的白膜層即淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板上；

S5，將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h；

S6，將S5中培養(yǎng)后的培養(yǎng)板上加入病毒，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)8天；

S7，檢測培養(yǎng)板上的細(xì)胞，并確定T細(xì)胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備。

實施例五

本發(fā)明提出的一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

S1，將血液轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋，混合均勻；

S2，將3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，將混合液放入離心管中，并將離心管豎直放置在操作臺上，將稀釋好的血液放入二分之一，并緩慢攪拌，靜止2min后，再加入剩余的二分之一血液，緩慢攪拌直至混合均勻；

S3，將S2中加好血液、泛影葡胺與Ficoll溶液的離心管放置在離心機(jī)，在30℃的溫度下離心45min；

S4，將S3中離心后的離心管移至操作臺，取中間的白膜層即淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板上；

S5，將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；

S6，將S5中培養(yǎng)后的培養(yǎng)板上加入病毒，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)10天；

S7，檢測培養(yǎng)板上的細(xì)胞，并確定T細(xì)胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備。

本發(fā)明制備的嵌合抗原受體T細(xì)胞具有一定的功能活性，可以為腫瘤治療提供技術(shù)方向。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。