本發(fā)明涉及一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d及其在提高棉花抗逆性中的應用。屬于植物基因工程領域。

背景技術：

棉花是世界上最重要的天然纖維，干旱、低磷等非生物脅迫影響棉花的生長，最終導致棉花產量降低。在耕地面積只減不增的情況下，一些地方出現(xiàn)了糧棉爭地的現(xiàn)象。在人類文明發(fā)展的長河中，穿衣和吃飯同等重要。解決糧棉爭地的最好辦法是培育抗逆性較強的優(yōu)良棉花品種，及高效開發(fā)利用干旱區(qū)、鹽堿地或土壤貧瘠化土地。

非特異性磷脂酶C，主要以磷脂酰膽堿為底物，生成二酰甘油和磷酸膽堿。擬南芥中，非特異性磷脂酶C基因家族有6個成員(Nakamura et al.2005)。2005年至今，相繼有文獻報導植物非特異性磷脂酶C參與植物激素的信號轉導以及抗逆過程(Nakamura et al.2005；Peters et al.2010；Wimalasekera et al.2010；Kocourkova et al.2011；Pokotylo et al.2013；Nakamura 2014；Peters et al.2014；et al.2015；Pejchar et al.2015；Hong et al.2016)。然而，研究對象大多是模式生物擬南芥，其他物種中非特異性磷脂酶C的功能研究甚少。為了更好地了解植物非特異性磷脂酶C的功能，對棉花非特異性磷脂酶C基因家族進行研究是非常必要的，但檢索發(fā)現(xiàn)迄今為止，沒有任何棉花非特異性磷脂酶C的相關報導。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d及其在提高棉花抗逆性中的應用。

本發(fā)明所述的陸地棉非特異性磷脂酶C基因，其特征在于：該基因命名為陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d，該基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明首次克隆出陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d，實驗分析證實：GhNPC6d基因定位在D07染色體上，氨基酸的數(shù)目為509，含有3個外顯子，2個內含子。MEME分析發(fā)現(xiàn)，GhNPC6d有16個motif。對得到的motif進一步去ExPASy中分析，發(fā)現(xiàn)有6個motif注釋為磷酸酯結構域。用NCBI Conserved Domain search和SMART在線分析GhNPC6d的保守結構域，發(fā)現(xiàn)GhNPC6d含有磷酸酯結構域。對GhNPC6d進行啟動子順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)GhNPC6d的啟動子中含有與脅迫相關或激素相關的順式作用元件。包括HSE(熱脅迫相關)，MBS(干旱脅迫相關)，TC-rich repeats(防御與脅迫相關)，ARE(厭氧誘導相關)，和TCA-element(水楊酸相關)。

對GhNPC6d進行不同器官的表達譜分析，實時熒光定量PCR結果表明，GhNPC6d主要在根中表達。對四葉期棉花分別進行低磷(5μM)、鹽(200mM NaCl)、干旱(20％PEG6000)和ABA(200μM)的脅迫處理，分別在處理0，1，2，3，6，9和12h時進行取材，取材部位為根部。提取RNA并反轉為cDNA，實時熒光定量PCR結果表明，低磷脅迫和鹽脅迫處理下，GhNPC6d表達水平下調；干旱脅迫下，GhNPC6d表達水平上調，12h時表達水平表現(xiàn)出下調的現(xiàn)象。ABA脅迫處理1h時，GhNPC6d表達水平上調3.7倍，1h后GhNPC6d的表達水平表現(xiàn)出波動現(xiàn)象，但是整體來說GhNPC6d基因的表達受ABA的脅迫誘導。GhNPC6d基因的表達受干旱和ABA的脅迫誘導。

本發(fā)明還提供了一種含有上述陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d的植物表達載體pCAMBIA1300-GhNPC6d-EPSP。

本發(fā)明所述陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d在提高棉花抗逆性中的應用。

本發(fā)明所述植物表達載體pCAMBIA1300-GhNPC6d-EPSP在提高棉花抗逆性中的應用。

其中：所述抗逆性是指抗旱。所述棉花品種是春棉、夏棉、常規(guī)棉或雜交棉。

在構建GhNPC6d過表達結構時，將GhNPC6d的cDNA核苷酸序列插入到植物表達載體pCAMBIA1300-EPSP中，獲得質粒pCAMBIA1300-GhNPC6d-EPSP。酶切鑒定正確后，將質粒導入根瘤農桿菌AGL1或LBA4404中，用于植物遺傳轉化。

通過農桿菌介導的轉基因方法，以棉花的莖尖分生組織細胞為受體將目標基因轉入棉花細胞中，即獲得轉基因植株。通過分子檢測和植株抗逆性測定選出目的基因穩(wěn)定表達且植株抗性明顯提高的轉基因植株。通過盆栽試驗和大田抗逆性測定試驗，即可篩選出抗逆性明顯提高的轉基因育種材料。獲得的優(yōu)異材料有望用于棉花育種或生產實踐。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明首次從陸地棉中克隆出非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d。該基因的表達受干旱和ABA脅迫誘導。同時本發(fā)明成功構建了pCAMBIA1300-GhNPC6d-EPSP植物表達載體，將該植物表達載體轉化到棉花中證實，本發(fā)明所述基因可以顯著提高轉基因棉花的抗逆特性。預示，GhNPC6d基因應用于培育抗逆轉基因農作物具有極大的潛力。

附圖說明

圖1：質粒pCAMBIA1300-GhNPC6d-EPSP的的結構示意圖。

圖2：GhNPC6d基因組織特異性分析

其中：TR，主根；LR，側根；SM，莖；CL，子葉；SL，衰老葉片；EL，幼嫩葉片；ST，莖尖；BR，苞片；PE，花瓣；OV，胚珠。

圖3：GhNPC6d基因在非生物脅迫下的表達模式分析。

具體實施方式

以下敘述本發(fā)明的實施例。需說明的是，本發(fā)明的實施例只對本發(fā)明起說明作用而沒有限制作用。如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

實施例1.高保真PCR擴增GhNPC6d目的基因

取陸地棉中9807四葉期幼嫩的葉片和根，參照植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)說明書，提取植物總RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit(TaKaRa，大連)反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA。以特異引物進行高保真PCR擴增。特異引物序列如下：

GhNPC6d-F：TCTAGAATGGAGCGCTCATTTTCCTT

GhNPC6d-R：CGAGCTCTTACGGATTCGAAGATCTCGT

PCR反應總體積為25μL，反應體系為：5μL 5×PS Buffer，2μL dNTP，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，0.25μL Prime STARase，1μL稀釋十倍的cDNA模板，ddH2O補齊至25μL。

PCR擴增條件，預變性95℃3min，35個循環(huán)：98℃，10sec；56℃，5sec；72℃，90sec，最后72℃延伸6min。

將PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收(TIANGEN，北京)純化后，連接到pEASY-Blunt Cloning vector(TRANSGEN，北京)上。然后轉化大腸桿菌TransT1(TRANSGEN，北京)，進行測序分析。通過上述步驟，獲得了陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d的cDNA核苷酸序列。

GhNPC6d基因cDNA核苷酸序列克隆的結果如下：

通過高保真酶擴增獲得GhNPC6d基因的cDNA核苷酸序列為1530bp，編碼509個氨基酸，GhNPC6d的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼的GhNPC6d蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

實施例2.GhNPC6d基因生物信息學分析

使用ExPASy proteomics server database估算GhNPC6d分子量、等電點等信息；使用Gene Structure Display Server 2.0分析GhNPC6d基因結構；使用MEME分析GhNPC6d的保守motif，并用ExPASy中的ScanProsite工具對獲得的motif進行注釋；使用NCBI Conserved Domain search和SMART在線分析GhNPC6d的保守結構域，使用Plant CARE分析GhNPC6d的啟動子。

經(jīng)過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)GhNPC6d基因，定位在D07染色體上，氨基酸的數(shù)目為509，GhNPC6d的理論分子量為56.80kD，理論等電點為6.74。含有3個外顯子，2個內含子。MEME分析發(fā)現(xiàn)，GhNPC6d有16個motif。對得到的motif進一步去ExPASy中分析，發(fā)現(xiàn)有6個motif注釋為磷酸酯結構域。用NCBI Conserved Domain search和SMART在線分析GhNPC6d的保守結構域，發(fā)現(xiàn)GhNPC6d含有磷酸酯結構域。對GhNPC6d進行啟動子順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)GhNPC6d的啟動子中含有與脅迫相關或激素相關的順式作用元件。包括HSE(熱脅迫相關)，MBS(干旱脅迫相關)，TC-rich repeats(防御與脅迫相關)，ARE(厭氧誘導相關)，和TCA-element(水楊酸相關)。

實施例3.GhNPC6d組織特異性分析

陸地棉(品種為中9807)種子經(jīng)消毒后種植在溫室中，生長條件為：30℃/25℃，相對濕度為60-70％，光照14h，黑暗10h，光子通量密度為800μmol m^-2s^-1。生長至四葉期時，取主根、側根、莖、莖尖、子葉、衰老葉片和幼嫩葉片于液氮中，-80℃保存；生長至開花期，取開花第一天時的苞片、花瓣和胚珠于液氮中，-80℃保存。分別提取植物總RNA，并反轉錄得到cDNA，稀釋10倍后用于實時熒光定量PCR分析。陸地棉Histone基因(GenBank accession number NC_006639)為內標。熒光定量PCR反應試劑盒為TAKARA的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，反應在96 System熒光定量儀中進行，進行3次生物學重復，實驗結果用相對定量2^ΔCt法計算GhNPC6d基因的表達量(Schmittgen and Livak 2008)。引物序列為：

QGhNPC6d-F:GGCATAAACCCAACCATCAAT

QGhNPC6d-R:ATGCATAAATAGGGACAGCTTCTGGTC

結果：GhNPC6d主要在根中表達(圖1)。

實施例4.GhNPC6d基因在非生物脅迫下的表達模式分析

陸地棉(品種為中9807)種子經(jīng)消毒后種植在溫室中，生長條件為：30℃/25℃，相對濕度為60-70％，光照14h，黑暗10h，光子通量密度為800μmol m^-2s^-1。生長至四葉期時，分別進行低磷(5μM)、鹽(200mM NaCl)、干旱(20％PEG6000)的脅迫處理，分別在處理0，1，2，3，6，9和12h時進行取材，取材部位為根部。提取總RNA并反轉為cDNA，稀釋10倍后用于實時熒光定量PCR分析。陸地棉Histone基因(GenBank accession number NC_006639)為內標。熒光定量PCR反應試劑盒為TAKARA的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，反應在96 System熒光定量儀中進行，進行3次生物學重復，實驗結果用相對定量2^-ΔΔCt法計算GhNPC6d基因的表達量(Schmittgen and Livak 2008)。引物序列為：

QGhNPC6d-F:GGCATAAACCCAACCATCAAT

QGhNPC6d-R:ATGCATAAATAGGGACAGCTTCTGGTC

結果表明，低磷脅迫和鹽脅迫處理下，GhNPC6d表達水平下調；干旱脅迫下，GhNPC6d表達水平上調，12h時表達水平表現(xiàn)出下調的現(xiàn)象。ABA脅迫處理1h時，GhNPC6d表達水平上調3.7倍，1h后GhNPC6d的表達水平表現(xiàn)出波動現(xiàn)象，但是整體來說GhNPC6d基因的表達受ABA的脅迫誘導。GhNPC6d基因的表達受干旱和ABA的脅迫誘導。

實施例5.轉GhNPC6d基因創(chuàng)造棉花抗逆材料

一：pCAMBIA1300-GhNPC6d-EPSP植物表達載體的構建

在構建GhNPC6d過表達結構時，將GhNPC6d的cDNA核苷酸序列插入到植物表達載體pCAMBIA1300-EPSP中，獲得質粒pCAMBIA1300-GhNPC6d-EPSP。酶切鑒定正確后，將質粒導入根瘤農桿菌AGL1或LBA4404中，用于植物遺傳轉化。

二：棉花轉基因植株的獲得

棉花種子經(jīng)硫酸脫絨后，用70％乙醇浸泡1min、0.1％的升汞浸泡15min，然后用無菌水洗滌5遍。消毒后種子放入鋪有三層濾紙的無菌瓶中，加入適量無菌水，于28℃溫箱中萌發(fā)。2～3天后下胚軸長到1～2cm，將萌發(fā)種子插到MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，株高7～10cm時用于轉化。

將帶有載體(質粒pCAMBIA1300-GhNPC6d-EPSP帶有除草劑抗性基因EPSP和目的基因GhNPC6d)的根瘤農桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細菌處于對數(shù)生長期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2MS改良液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/L乙酰丁香酮的1/2MS改良液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5～20倍用于轉化。在轉化試驗中，加入1％的表面活性劑Silwet L-77(Lehle Seeds，USA)或Tween80。

當種皮脫落或快脫落時，去掉種皮和一片子葉，裸露出小苗莖尖。若苗端已有小葉出現(xiàn)，則用鑷子剝去。輕輕劃傷頂端分生組織后，將蘸有農桿菌菌液的棉球(由滅菌脫脂棉制備)放到小苗頂端，持續(xù)24h后取下棉團，用無菌濾紙吸去感染部位的殘留菌液。小苗浸染時置于真空干燥器中，輔以0.5×10⁵Pa的負壓處理。浸染過的幼苗于21℃左右暗培養(yǎng)3天，然后在光下培養(yǎng)2～3天后移栽入花盆?；ㄅ柘虏繛橥寥溃喜繛?～8cm厚的蛭石，隔天澆灌1/2MS改良無機鹽溶液。

三：轉化植株篩選與定植

待轉化植株長出3片真葉后，噴灑1.6～1.8‰除草劑草甘膦(轉基因選擇標記基因為EPSP)水溶液，以未轉化植株為對照。噴灑量以植株掉液滴為宜。未轉化植株在噴灑后3天停止生長，7～10天左右開始死亡。轉化處理后的植株，一些個體的變化與對照植株相似，另一些個體則持續(xù)生長，無明顯變化。植株長到4～5葉期，將其定植到田間。

四：轉基因植株的鑒定和利用

轉基因植株開花后自交或姊妹交結實。種子播種在大田或溫室，在植株四葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術檢測子代植株是否攜帶外源基因GhNPC6d，并統(tǒng)計外源基因在子代中的分離比例。

結果表明，以無菌苗莖尖分生組織為轉基因受體組織，能有效獲得轉基因植株。并且，在部分轉基因株系后代中，外源基因遺傳方式符合孟德爾定律，及在傳代中穩(wěn)定。轉基因純合系經(jīng)田間性狀選擇和抗性測定，選出保持受體品種基本特性且抗逆性有明顯提高的轉基因株系，并用于棉花品種改良。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。

序列表

<110>山東大學

<120>一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d及其應用

<141>2016-12-7

<160>2

<210>1

<211>1530

<212>cDNA

<213>棉花（Gossypiumspp）

<221>陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d的cDNA核苷酸序列

<222>（1）…（1530）

<400>1

atggagcgct cattttcctt cattttcttg ctgtttatct taccatttgt agtatcccaa 60

gagtcaccca ttaagacaat agtggttttg gtaatggaaa acagatcctt tgatcacatg 120

gttggttgga tgaaacaagg cataaaccca accatcaatg gtgtaactgg taatgaatgt 180

aaccccattt caaccaaaac cccaaaccca aaatccattt gtttcactaa tgatgctcag 240

ttcgtagatc cagatccagg tcattctttt gaagctgttg aacaacaggt atttggttca 300

actccctcct cattcccttc catgtctggt tttgtagaac aagccttctc aatctcccca 360

aacatgtctg aaacagtcat gaaaggtttc agaccagaag ctgtccctat ttatgcatca 420

ttagttaaag aatttgctgt gtttgatcgt tggttttcat caatccctgg tccaacacaa 480

cctaatagac tctttgttta ttcagctact tcccatggtt caactagcca tgtcaaaaaa 540

caattagcgc aagggtaccc tcaaaaaaca atctttgatt cacttcatga aaatggtaaa 600

gattttgggg tttatttcca aaatataccc acaactttgt tttatagaaa ccttaggaaa 660

ctcaaatatg tgtttaagtt ccatcaattt gatttgaagt ttaaaaaaga tgccttgaat 720

ggcaagttac ctagcttgag tgtgattgaa ccaaggtatt ttgatcttaa agggttacct 780

gctaatgatg atcatccatc acatgatgtg gctaatggtc aaaagttggt caaagaagtg 840

tatgagacat tgagggcaag ccctcaatgg aacgaaacat tgttggtgat tacttatgat 900

gaacatggtg ggttttatga tcatgttaag acaccatttg ttaatgttcc aaaccctgat 960

gggaacactg gtcctgctcc ttctttcttc aagtttgata gacttggtgt tcgtgttcct 1020

actattatgg tctctccttg gatcaagaaa ggcactgtga taagtggtcc aaaaggacca 1080

acaccaaact cagaatttga gcactcatca atccctgcaa caataaagaa aatcttcaac 1140

ctttcttcca atttcttaac tcacagagat gcttgggccg gcacttttga agatgttgtt 1200

tcccacttaa cttccccaag aactgattgt ccagaaacat tgccagatgt tgtacctttg 1260

aggacaactg aagcaaaaga agatgctgct ctgtctgagt ttcaaagtga ggttgttcaa 1320

ctagctgctg ttcttaacgg tgaccatttc ttgagcagtt ttcccgatga gatgagcaag 1380

aaaatgacgg tgaaagaagc tcatgagtac accaaagggg ccgtttcccg gttcatacga 1440

gcaagtaaag aggccctcaa gttgggagct gccgaatctg ccattgtaga tatgcgatca 1500

tcgcttacaa cgagatcttc gaatccgtaa 1530

<210>2

<211>509

<212>PRT

<213>人工序列

<221>陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC6d編碼的氨基酸序列

<222>（1）…（509）

<400>2

MERSFSFIFL LFILPFVVSQ ESPIKTIVVL VMENRSFDHM VGWMKQGINP TINGVTGNEC 60

NPISTKTPNP KSICFTNDAQ FVDPDPGHSF EAVEQQVFGS TPSSFPSMSG FVEQAFSISP 120

NMSETVMKGF RPEAVPIYAS LVKEFAVFDR WFSSIPGPTQ PNRLFVYSAT SHGSTSHVKK 180

QLAQGYPQKT IFDSLHENGK DFGVYFQNIP TTLFYRNLRK LKYVFKFHQF DLKFKKDALN 240

GKLPSLSVIE PRYFDLKGLP ANDDHPSHDV ANGQKLVKEV YETLRASPQW NETLLVITYD 300

EHGGFYDHVK TPFVNVPNPD GNTGPAPSFF KFDRLGVRVP TIMVSPWIKK GTVISGPKGP 360

TPNSEFEHSS IPATIKKIFN LSSNFLTHRD AWAGTFEDVV SHLTSPRTDC PETLPDVVPL 420

RTTEAKEDAA LSEFQSEVVQ LAAVLNGDHF LSSFPDEMSK KMTVKEAHEY TKGAVSRFIR 480

ASKEALKLGA AESAIVDMRS SLTTRSSNP 509