本發(fā)明涉及一種O型口蹄疫病毒樣顆粒及其制備方法和用途，屬于農(nóng)業(yè)科學畜牧獸醫(yī)科學技術領域。

背景技術：

動物病毒病的暴發(fā)流行往往嚴重影響整個國家的畜產(chǎn)品生產(chǎn)和出口貿(mào)易，如口蹄疫病毒，其引起的偶蹄動物烈性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病之首，在國家動物疫病防治長期發(fā)展規(guī)劃中確定為首位限期免疫凈化防控的病種。目前國內(nèi)外主要使用全病毒滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗對口蹄疫等病毒性傳染病進行免疫防控，但防疫效果不盡人意。這類疫苗因生產(chǎn)成本較高、疫苗生產(chǎn)過程中或滅活不徹底可能造成散毒的生物安全問題，以及篩選匹配疫苗株周期長等缺點，已不能完全滿足動物疫病防控目標中徹底凈化的要求。因此，研發(fā)新型、安全、高效的基因工程疫苗制劑是目前的當務之急，也符合國家提出的有效防控重大動物疫病、保障畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。

病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)是近年來新出現(xiàn)的一種基因工程亞單位形式，其優(yōu)點包括不含病毒復制所必須的遺傳物質(zhì)，生物安全性優(yōu)越；可以模擬病毒的天然結構而使構象依賴型抗原表位得以正確呈現(xiàn)；能像自然病毒粒子一樣與細胞表面受體結合進入細胞，從而誘導較強的免疫反應；在不影響VLPs結構的基礎上可以根據(jù)需要插入或刪除某些氨基酸序列，對其進行人工改造，從而實現(xiàn)對多種病毒同時免疫的多效性特點等。因此，VLPs作為疫苗，被認為是目前能夠替代全病毒疫苗的最佳候選疫苗形式。

盡管VLPs研究從20世紀五六十年代開始相繼出現(xiàn)報道，但大多VLPs的研究都集中在真核表達系統(tǒng)中，尤其是桿狀病毒/昆蟲表達系統(tǒng)，雖然已出現(xiàn)利用該系統(tǒng)獲得的商品化人類VLPs疫苗，但由于該系統(tǒng)生產(chǎn)成本高、VLPs產(chǎn)率低等因素限制了動物病毒VLPs疫苗的產(chǎn)業(yè)化進程，至今還未出現(xiàn)商品化動物病毒VLPs疫苗。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的O型口蹄疫病毒樣顆粒及其制備方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：

原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)VLPs，其優(yōu)勢是費用低廉，蛋白產(chǎn)率高，容易滿足大規(guī)模生產(chǎn)。鑒于此，本發(fā)明則在前期建立的原核表達組裝技術平臺基礎上，為了進一步提高O型口蹄疫病毒VLPs的蛋白表達效果及組裝率，通過對口蹄疫病毒衣殼蛋白VP3基因的剪切優(yōu)化，進一步提高了O型口蹄疫病毒衣殼蛋白的表達水平，并且經(jīng)測定VP3的改變不影響VLPs的組裝，且其組裝效率高于未缺失VP3的自然VLPs的組裝。并且優(yōu)化后的病毒樣顆粒，能夠保持持久的刺激使動物機體產(chǎn)生特異性抗體以及中和抗體，與未缺失VP3組裝得到的VLPs無顯著差別。

具體的，本發(fā)明的一種O型口蹄疫病毒樣顆粒是由O型口蹄疫病毒的結構蛋白VP0、VP1以及優(yōu)化后的VP3結構蛋白組裝而成，其中VP1的基因序列為SEQ ID NO.1所示，VP0的基因序列為SEQ ID NO.2所示，優(yōu)化后的VP3的基因序列為SEQ ID NO.3所示。

進一步的，本發(fā)明還公開了一種構建O型口蹄疫病毒樣顆粒的方法，包括以下步驟：

(1)小泛素樣修飾蛋白融合表達載體pSMA以及pSMK的構建：

a.以釀酒酵母基因組DNA為模板，以smt3F與smt3R為引物擴增smt3基因，引物序列如下：

smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，

smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，

b.經(jīng)NcoI和BamHI雙酶切后將smt3基因插入到用同樣內(nèi)切酶處理的pET-28a載體中，所得載體為pSMK，將pSMK的卡那霉素抗性基因替換為氨芐青霉素抗性基因，得載體pSMA；

(2)口蹄疫結構蛋白基因重組表達載體的構建

根據(jù)GenBank中公布的登陸號為JN998085.1的O型口蹄疫病毒序列，進行密碼子優(yōu)化并合成結構蛋白基因VP0、VP1及VP3；以合成的基因為模板，用以下引物對分別擴增VP0，VP1以及VP3基因片段：

VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA 3’

VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG 3’

VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC 3’

VP0R：5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC 3’

VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTATCTTCCCGGTGGCGTG 3’

VP3R：5’CGCGGATCCTCATTGCTGACGGGCATCAACC 3’

采用聚合酶鏈式反應的方法，分別用引物VP1F/VP1R、VP3F/VP3R和VP0F/VP0R，擴增獲得VP1、VP0以及VP3基因片段，將擴增得到的VP3基因缺失574-615位的核苷酸序列，即獲得優(yōu)化后的VP3的基因序列，命名為optiVP3；擴增獲得的VP1、VP0以及optiVP3基因片段分別經(jīng)BsmBI/BamH I雙酶切后插入經(jīng)BsaI酶切處理的pSMK或pSMA，所構建重組表達載體分別命名為pSMK/VP0，pSMK/VP1以及pSMA/optiVP3，以pSMK/VP1為模板，以T7BamHI/VP1XhoI為引物擴增獲得含T7啟動子等原核表達元件和VP1基因的DNA片段，經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切后插入用同樣酶切處理的pSMK/VP0中，所得雙表達重組載體命名為pSMK/VP0-VP1；所述T7BamHI/VP1XhoI引物序列為：

T7BamHI：5’GCAATTGGATCCCGTCCGGCGTAGAGGATCGA 3’

VP1XhoI：5’GCGCACCTCGAGTCACAGAGTCTGTTTCTCAGG 3’

(3)衣殼蛋白的表達及純化

將表達載體pSMA/optiVP3與pSMK/VP0-VP1共轉(zhuǎn)化到表達菌BL21(DE3)，用卡那霉素和氨芐青霉素篩選陽性克隆進行蛋白表達和純化；

(4)口蹄疫病毒樣顆粒體外組裝

用小泛素樣修飾蛋白酶酶切融合蛋白，通過His Trap HP除去小泛素樣修飾標簽蛋白，收集含有VP0、VP1以optiVP3的流穿液，在含有500mM NaCl，pH8.0的20mM Tris-HCl組裝緩沖液中，4℃過夜組裝成O型口蹄疫VLPs。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的VP1的基因序列為SEQ ID NO.1所示，VP0的基因序列為SEQ ID NO.2所示，優(yōu)化后的VP3的基因序列為SEQ ID NO.3所示。

更進一步的，本發(fā)明還提出了所述的O型口蹄疫病毒樣顆粒在制備口蹄疫疫苗中的用途。

相較于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明嘗試將口蹄疫病毒VP3的部分區(qū)段進行人工缺失，以期提高目的蛋白的表達量及病毒樣顆粒的組裝效率，為進一步推進病毒樣顆粒疫苗的研究和應用，加速動物疫苗由傳統(tǒng)滅活苗向基因工程苗轉(zhuǎn)化的步伐提供技術支持。結果顯示，VP3基因經(jīng)人工缺失后，VP3目的蛋白的表達量比突變前提高了20％，病毒樣顆粒的組裝效率提高了15％左右，且免疫學檢測發(fā)現(xiàn)反應原性與未缺失VLPs無區(qū)別。本發(fā)明為優(yōu)化口蹄疫VLPs的獲得進行了一次新的嘗試和創(chuàng)新。

附圖說明

圖1為融合蛋白誘導表達及純化；

注：泳道1：Marker；泳道2：未突變誘導后的樣品；泳道3：未突變誘導后的上清；泳道4-7：純化的未突變樣品；泳道8：突變的誘導后樣品；泳道9-11：純化的突變樣品；

圖2為體外組裝的病毒樣顆粒電鏡檢測結果；

圖3為O型口蹄疫VLPs蔗糖密度梯度離心結果；

圖4為第二組豬特異抗體水平檢測結果；

圖5為第二組豬中和抗體水平檢測結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例1 O型口蹄疫病毒樣顆粒的構建

(1)小泛素樣修飾蛋白融合表達載體pSMA以及pSMK的構建：

a.以釀酒酵母基因組DNA為模板，以smt3F與smt3R為引物擴增smt3基因，引物序列如下：

smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，

smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，

b.經(jīng)NcoI和BamHI雙酶切后將smt3基因插入到用同樣內(nèi)切酶處理的pET-28a載體中，所得載體為pSMK，將pSMK的卡那霉素抗性基因替換為氨芐青霉素抗性基因，得載體pSMA；

(2)口蹄疫結構蛋白基因重組表達載體的構建

根據(jù)已公布的O型口蹄疫病毒的序列(GenBank登陸號：JN998085.1)，參考Hoover等的方法(Hoover DM1,Lubkowski J.DNAWorks:an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.Nucl.Acids Res.(2002)30(10):e43.)進行密碼子優(yōu)化并合成結構蛋白基因VP0，VP3和VP1。

以合成的基因為模板，用以下引物對分別擴增VP0，VP1以及VP3基因片段：

VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA 3’

VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG 3’

VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC 3’

VP0R：5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC 3’

VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTATCTTCCCGGTGGCGTG 3’

VP3R：5’CGCGGATCCTCATTGCTGACGGGCATCAACC 3’

采用聚合酶鏈式反應(PCR)方法，分別用引物VP1F/VP1R、VP3F/VP3R和VP0F/VP0R擴增獲得VP1、VP0以及VP3基因片段，所述的VP1的基因序列為SEQ ID NO.1所示，VP0的基因序列為SEQ ID NO.2所示，VP3的基因序列為SEQ ID NO.4所示，將擴增得到的VP3基因的第574-615位的核苷酸缺失，即獲得優(yōu)化后的VP3的基因序列，命名為optiVP3，其序列為SEQ ID NO.3所示；擴增獲得的VP1、VP0以及optiVP3基因片段分別經(jīng)BsmBI/BamH I雙酶切后插入經(jīng)BsaI酶切處理的pSMK或pSMA，所構建重組表達載體分別命名為pSMK/VP0，pSMK/VP1以及pSMA/optiVP3，以pSMK/VP1為模板，以T7BamHI/VP1XhoI為引物擴增獲得含T7啟動子等原核表達元件和VP1基因的DNA片段，經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切后插入用同樣酶切處理的pSMK/VP0中，所得雙表達重組載體命名為pSMK/VP0-VP1；所述T7BamHI/VP1XhoI引物序列為：

T7BamHI：5’GCAATTGGATCCCGTCCGGCGTAGAGGATCGA 3’

VP1XhoI：5’GCGCACCTCGAGTCACAGAGTCTGTTTCTCAGG 3’

同時構建含有未優(yōu)化的VP3的重組質(zhì)粒，命名為pSMA/VP3，作為對照。

(3)衣殼蛋白的表達及純化

將表達載體pSMK/VP0-VP1和pSMA/optiVP3(或者pSMA/VP3)共轉(zhuǎn)化到表達菌BL21(DE3)。用卡那霉素和氨芐青霉素篩選陽性克隆。挑選陽性克隆菌于雙抗性LB培養(yǎng)基中37℃220rpm過夜培養(yǎng)。將上述菌液以1:100接種LB培養(yǎng)基，于37℃、220rpm培養(yǎng)至菌液的OD₆₀₀達0.6左右，以終濃度為1mM IPTG、25℃過夜誘導表達，隨后以5000rpm、30min離心收集菌體沉淀，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

用10-20ml冰浴的緩沖液A(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM Imidazol，pH＝8.4)重懸細菌沉淀，超聲破碎菌體細胞(超聲時間3s,間隔時間3s,共8min，功率200W)。12,000×g離心30min，取上清，棄沉淀，上清與Ni-NTA His·Bind Resins混勻，4℃結合1h左右。用緩沖液A洗去非特異性結合的雜蛋白，用緩沖液B(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，300mM Imidazol，pH＝8.4)洗脫目的蛋白，-70℃保存。SDS-PAGE檢測結果顯示獲得了預期大小的蛋白(如圖1)。結果也顯示，VP3缺失后，其表達量比未缺失的完整VP3的量顯著增加，這說明VP3的缺失有利于口蹄疫病毒蛋白的表達。

(4)口蹄疫病毒樣顆粒的體外組裝

參照Invitrogn的試劑使用說明，用小泛素化修飾蛋白酶酶切融合蛋白，按照如下方法和比例進行：20μg上述純化的融合蛋白，200μL酶切緩沖液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0,0.2％Igepal(NP-40)，1mM DTT)，10μL小泛素化修飾蛋白酶(1U/μL)，37℃酶切30min。將酶切混合物通過HisTrap HP除去小泛素化修飾標簽蛋白，收集含有VP0、VP1和optiVP3(或者VP3)的流穿液在組裝緩沖液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0)中，4℃過夜組裝VLPs。

過夜組裝的VLPs經(jīng)截留分子量100KD的超濾管濃縮后，透射電鏡觀察：將10μL含VLPs的濃縮液加到200目的銅網(wǎng)上，室溫吸附2-3min，用濾紙吸干銅網(wǎng)上剩余的液體后用3％的磷鎢酸染色，用Hitachi,H-7100FA透射電鏡觀察，組裝的VLPs電鏡觀察，如圖2所示，在此條件下組裝的病毒樣顆粒直徑主要分布在20-30nm之間，其形態(tài)完整，大小和自然的病毒粒子相似，說明VP3的缺失并不影響VLPs的組裝。

(5)病毒樣顆粒的分離及組裝率的測定

病毒樣顆粒的蔗糖密度梯度離心法的分離：將1.5ml含病毒樣顆粒的液體(突變和未突變)置于45％-15％濃度的蔗糖梯度上，以38000rpm、4℃離心3.5h,然后用連續(xù)進樣的方法在紫外檢測儀(259nm)檢測，并繪制圖普，依據(jù)峰面積確定VLPs的組裝情況。結果顯示VP3部分缺失(opti VP3)組裝得到的VLPs的峰面積明顯大于對照組，如圖3所示。收集含VLPs的樣品峰，用雙抗夾心ELISA方法進行定量，并最終確定組裝率。VLPs的組裝效率＝含VLPs樣品峰的抗原量/上樣的抗原總量×100％

結果顯示VP3部分缺失(optiVP3)組裝得到的VLPs的組裝率為45％，VP3未缺失的VLPs組裝率為30％。

實施例2 O型口蹄疫病毒樣顆粒的免疫效力檢測

將13只5周齡的豬分為3組，第一組(3只)用PBS免疫作為對照，第二組(5只)用實施例1制備得到的含有optiVP3的VLPs蛋白免疫，第三組(5只)用實施例1制備得到的含有未缺失VP3的VLPs蛋白免疫。免疫前對所有實驗豬進行頸靜脈采血，免疫后第一周開始每周采血，分離血清并檢測抗體水平，具體操作為:在微量血凝板上將豬血清及陰陽性對照血清用PBST 2倍系列稀釋后，加入口蹄疫O型病毒抗原(1:20稀釋)，4℃靜置過夜。將抗原抗體混合液轉(zhuǎn)移至包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，封板，37℃孵育60min。PBST清洗3次，孔板中加入口蹄疫O型豚鼠抗體工作液(50μL)，封板，37℃孵育30min。PBST清洗3遍后，再加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液(50μL)，封板，37℃孵育30min。PBST清洗3次后，50μL底物溶液(OPD，添加3％雙氧水)加于各孔中于37℃孵育15min。然后用50μL終止液加于各孔終止顏色反應，于490nm檢測光密度(OD值)(見圖5)。

血清中和抗體的檢測具體為，以微量中和試驗檢測血清中和抗體滴度。將生理鹽水稀釋的豬血清56℃滅活30分鐘后，在96孔微量細胞培養(yǎng)板上，用DMEM營養(yǎng)液作2倍系列稀釋，每個稀釋度作4孔，每孔加入50μL病毒液(100TCID50)，37℃溫箱中和1h后每孔加入100μL細胞懸液(1×10⁵個/mL)，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，自48h觀察至144h終判。設置陽性和陰性血清對照、病毒回歸試驗、血清毒性對照、正常細胞對照。按照Spearman-Karber方法，計算出能保護50％細胞孔不產(chǎn)生細胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。

圖4為第二組豬特異性抗體水平檢測結果，圖4結果顯示，與PBS對照組相比，VLPs免疫組的豬血清抗體水平持續(xù)升高，在第3周達到了最高峰，并一直持續(xù)到第5周。攻毒后28天，抗體急劇升高。這說明VLPs能夠保持持久的刺激使動物機體產(chǎn)生更多的抗體。與第三組相比，特異性抗體水平無顯著差別(結果未示出)。

圖5為第二組豬中和抗體水平檢測結果，圖5結果顯示，與PBS組相比，口蹄疫病毒VLPs免疫后豬中和抗體水平持續(xù)升高，并在第2周達到最高峰。兩周后，抗體水平下降，但仍有較高的抗體滴度，說明VLPs免疫組能夠引起機體產(chǎn)生特異中和抗體，與第三組相比，中和抗體水平無顯著差別(結果未示出)，進一步證明了口蹄疫病毒VLPs作為疫苗的免疫潛力。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所

<120> 一種O型口蹄疫病毒樣顆粒及其制備方法和用途

<130> KLPI161046

<160> 4

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 639

<212> DNA

<213> VP1

<400> 1

accaccagca cgggcgaatc ggcagatccg gttacggcaa cggtcgaaaa ctacggcggc 60

gaaacgcagg ttcaacgtcg tcatcatacc gatgttagct ttattctgga ccgtttcgtg 120

aaagttacgc cgaaggattc tatcaacgtc ctggacctga tgcagacccc gccgcatacc 180

ctggtgggcg cactgctgcg caccgccacg tattactttg cagatctgga agtcgctgtg 240

aaacacgaag gcgacctgac ctgggtcccg aatggtgcac cggaagcagc actggataac 300

accacgaatc cgacggcata tcataaagct ccgctgaccc gtctggcact gccgtacacg 360

gccccgcacc gtgttctggc aaccgtctat aacggcaatt gcaaatacgc tggcggtagt 420

ctgccgaacg tgcgtggtga tctgcaggtt ctggcccaaa aggcagcttg gccgctgccg 480

accagcttca attatggtgc gattaaagcc acccgtgtga cggaactgct gtatcgtatg 540

aagcgtgcag aaacctactg tccgcgtccg ctgctggcag tccacccgtc cgcagcacgc 600

cataagcaaa aaatcgtcgc cccggtcaaa caaagtctg 639

<210> 2

<211> 909

<212> DNA

<213> VP0

<400> 2

ggtgcgggcc agtcatctcc ggcgacgggt tcccagaatc aatcaggcaa cacgggttcc 60

atcatcaaca actactacat gcaacagtat cagaacagtg tggataccca actgggcgac 120

aacgcggttt caggcggttc gaatgaaggt agtaccgaca ccacgtccac gcataccacg 180

aatacccaga acaatgattg gtttagcaaa ctggcaagct ctgctttttc tggcctgttc 240

ggtgcgctgc tggccgacaa aaagaccgaa gaaaccacgc tgctggaaga tcgtattctg 300

accacgcgca acggccatac cacgagtacc acgcagagtt ccgtcggcat cacgcacggt 360

tacgcgaccg ccgaagattt cgtgtcaggc ccgaatacgt cgggtctgga aacccgtgtg 420

gttcaagccg aacgcttttt caaaacgcac ctgtttgatt gggtgacctc cgacccgttc 480

ggtcgttgct atctgctgga actgccgacg gatcacaagg gcgtttacgg tagcctgacc 540

gactcttatg cgtacatgcg caacggctgg gatgtggaag ttaccgccgt gggtaaccag 600

tttaatggcg gttgcctgct ggttgcaatg gtcctggaac tgtgttctat tgaacgtcgc 660

gaactgttcc agctgaccct gtttccgcat caattcatta acccgcgtac caatatgacg 720

gctcacatca aagttccgtt tgtcggcgtg aaccgctatg atcagtacaa agtccacaag 780

ccgtggaccc tggtcgtgat ggttgtcgca ccgctgaccg ttaatacgga aagcgctccg 840

caaatcaagg tgtatgccaa tatcgccccg acgaatgtcc acgttgctgg tgaatttccg 900

agtaaagaa 909

<210> 3

<211> 618

<212> DNA

<213> optiVP3

<400> 3

ggtatcttcc cggtggcgtg tagcgatggt tacggtggcc tggtgacgac ggacccgaaa 60

acggcagacc cggtgtatgg caaagttttt aacccgccgc gtaatctgct gccgggtcgc 120

ttcaccaacc tgctggatgt tgccgaagca tgcccgacgt ttctgcattt cgatggcgac 180

gtgccgtatg ttaccacgaa aaccgattcg gaccgtgtcc tggcccagtt tgacctgtcc 240

ctggcggcca agcatatgtc aaacaccttc ctggctggcc tggcgcagta ttacacccaa 300

tacagcggta cggtgaatct gcactttatg ttcaccggcc cgacggatgc taaagcgcgc 360

tatatgattg cctacgcacc gccgggtatg gaaccgccaa agaccccgga agcagctgcg 420

cattgcattc acgcggaatg ggacaccggc ctgaacagca aatttacgtt ctctatcccg 480

tatctgagtg ccgcagatta tgcctacacc gcaagtgacg ctgcggaaac cacgaatgtc 540

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gttgatgccc gtcagcaa 618

<210> 4

<211> 660

<212> DNA

<213> VP3

<400> 4

ggtatcttcc cggtggcgtg tagcgatggt tacggtggcc tggtgacgac ggacccgaaa 60

acggcagacc cggtgtatgg caaagttttt aacccgccgc gtaatctgct gccgggtcgc 120

ttcaccaacc tgctggatgt tgccgaagca tgcccgacgt ttctgcattt cgatggcgac 180

gtgccgtatg ttaccacgaa aaccgattcg gaccgtgtcc tggcccagtt tgacctgtcc 240

ctggcggcca agcatatgtc aaacaccttc ctggctggcc tggcgcagta ttacacccaa 300

tacagcggta cggtgaatct gcactttatg ttcaccggcc cgacggatgc taaagcgcgc 360

tatatgattg cctacgcacc gccgggtatg gaaccgccaa agaccccgga agcagctgcg 420

cattgcattc acgcggaatg ggacaccggc ctgaacagca aatttacgtt ctctatcccg 480

tatctgagtg ccgcagatta tgcctacacc gcaagtgacg ctgcggaaac cacgaatgtc 540

cagggttggg tgtgtctgtt tcaaatcacg cacggcaagg ctgaaggtga tgcactggtt 600

gtgatggcgt cggcgggtaa agattttgaa ctgcgtctgc cggttgatgc ccgtcagcaa 660