本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于可視化檢測(cè)葡萄糖的雙功能rGO-ZnFe₂O₄納米酶的制備方法。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種常見的代謝性疾病,它嚴(yán)重地威脅著人類的健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)顯示，截至目前，世界上有超過(guò)2.85億人患有糖尿病。據(jù)估計(jì)，到2030年這個(gè)數(shù)字將會(huì)是現(xiàn)在的兩倍或者更多。糖尿病患者一般表現(xiàn)為血糖高，尿糖呈現(xiàn)陽(yáng)性，因此，監(jiān)測(cè)和控制人體內(nèi)的血糖水平對(duì)于糖尿病人是至關(guān)重要的。近年來(lái)，科研工作者一直致力于建立檢測(cè)與糖尿病相關(guān)的葡萄糖含量的方法。目前，人們已經(jīng)建立了多種測(cè)定葡萄糖含量的方法。其中，比色法因其具有簡(jiǎn)單、實(shí)用的特點(diǎn)，引起了研究人員的特別關(guān)注。原則上，優(yōu)異的比色檢測(cè)葡萄糖的方法應(yīng)具有由分析物引起的比色底物顏色變化明顯、靈敏度高、方法簡(jiǎn)單和費(fèi)用低廉等特點(diǎn)。首先，由于比色底物的氧化還原反應(yīng)所引起的生成物的吸光度變化不僅具有好的可靠性，還表現(xiàn)出特定的顏色變化，這可以很容易地通過(guò)肉眼進(jìn)行辨識(shí)，不需要任何昂貴或復(fù)雜的儀器。其次，對(duì)葡萄糖檢測(cè)而言，高靈敏度是十分重要的。盡管人們血液中血糖的含量不是很低(幾到幾十毫摩爾每升)，然而，血清或者血液的組成非常復(fù)雜，會(huì)干擾血糖的測(cè)定。迄今為止，建立能滿足上述要求的檢測(cè)葡萄糖的方法仍存在很大挑戰(zhàn)。

自從Fe₃O₄納米酶被Yan等首次發(fā)現(xiàn)具有類過(guò)氧化物生物酶的催化活性以來(lái)，該納米酶在比色分析中得到了廣泛應(yīng)用。但Fe₃O₄納米酶如果長(zhǎng)時(shí)間放置，很容易被空氣中的氧氣氧化，影響其催化活性及實(shí)際應(yīng)用。盡管人們已制備了一些過(guò)氧化物納米酶，如CeO₂納米顆粒、CuO納米顆粒、CuS納米顆粒、Co₃O₄納米顆粒、V₂O₅納米線、氧化石墨烯(GO)等，并且這些納米酶也在生物免疫分析以及檢測(cè)核苷酸、H₂O₂、葡萄糖、三聚氰胺等方面得到了應(yīng)用。但是上述納米酶中有的催化活性較低、有的無(wú)磁性導(dǎo)致其催化行為完成后不易從溶液中分離，限制了其在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。因此，制備高效能、易分散、易分離的納米酶已成為比色分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法準(zhǔn)確度差，生物酶易氧化，活性低，難分離，適用性窄等技術(shù)缺陷，本發(fā)明公開了一種合成具有類過(guò)氧化物酶性質(zhì)的rGO-ZnFe₂O₄納米酶的新方法。在此基礎(chǔ)上，利用該納米酶的催化性能建立了一種檢測(cè)尿液中葡萄糖含量的可視化新方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

(1)rGO-ZnFe₂O₄納米酶的合成:

A.首先稱取石墨粉于研缽中，加入NaCl固體，研磨后加水進(jìn)行溶解、過(guò)濾、洗滌，然后除去NaCl。

B.將處理過(guò)的石墨粉轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入濃H₂SO₄，室溫條件下攪拌8小時(shí)。再將圓底燒瓶置于冰水浴中，緩慢加入KMnO₄固體，于35-40℃攪拌30分鐘，再于65-80℃攪拌45分鐘。加入水，于98-105℃下繼續(xù)攪拌30分鐘。

C.加入水和30％H₂O₂終止反應(yīng)，溶液顏色變?yōu)榱咙S色。所得到的產(chǎn)品用5％HCl洗滌后，再用超純水洗滌，12000轉(zhuǎn)/分離心，重復(fù)此過(guò)程至無(wú)法通過(guò)離心分離為止。

D.將得到的黃色懸濁液轉(zhuǎn)移到透析袋中，于超純水中透析一周至GO溶液為中性為止。最后將該溶液放于培養(yǎng)皿中，90℃干燥，得到GO固體。將所得的GO固體剪碎，備用。

E.將GO，F(xiàn)eCl₃·6H₂O和ZnCl₂于乙二醇中，超聲至分散完全使各物質(zhì)混合均勻，隨后，加入NaOAc和聚乙二醇，在60℃水浴中攪拌30分鐘，將所得溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，200℃下反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束以后，自然冷卻。待降至室溫時(shí)，將最終所得到的黑色產(chǎn)物用磁鐵進(jìn)行分離，然后用乙醇和去離子水交替洗滌得到rGO-ZnFe₂O₄納米酶。

F.將rGO-ZnFe₂O₄納米酶置于真空干燥箱中于45℃干燥，備用。

(2)用TEM、XPS、FT-IR等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行了表征。

(3)對(duì)pH值、納米酶用量、溫度、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)用量、H₂O₂用量、反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的測(cè)定條件，建立測(cè)定人體尿液中葡萄糖的可視化方法。

(4)尿液中葡萄糖的測(cè)定

(a)將20μL 1.0mg/mL葡萄糖氧化酶與50μL處理過(guò)的尿液樣品在37℃下反應(yīng)30分鐘；(b)將470μL HAc-NaAc緩沖溶液、55μL 20mM TMB、20μL 5mg/mL rGO-ZnFe₂O₄1/2加入到上述反應(yīng)溶液中，混合均勻；(c)將上述溶液于50℃條件下反應(yīng)10分鐘，然后將其從水浴中取出，置于冰水中10分鐘終止反應(yīng)；(d)通過(guò)外加磁場(chǎng)將rGO-ZnFe₂O₄1/2與反應(yīng)液分離；(5)將上述反應(yīng)溶液用去離子水稀釋至3.0mL，在652nm處測(cè)其吸光度。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿液中葡萄糖的含量。

本制備方法操作簡(jiǎn)單、不需要復(fù)雜設(shè)備，所制備的納米酶(rGO-ZnFe₂O₄)催化活性高、反應(yīng)完成后易從溶液中分離、可重復(fù)使用；所建立的測(cè)定人體尿液中葡萄糖的方法選擇性好、靈敏度高、可視化。

附圖說(shuō)明

圖1 GO(a)、rGO-ZnFe₂O₄1/2(b)、rGO-ZnFe₂O₄(c)與rGO-ZnFe₂O₄2(d)的紅外光譜圖。

圖2 rGO-ZnFe₂O₄1/2的X射線光電子能譜圖(插圖為Fe2p和Zn2p的高分辨能譜)。

圖3 rGO-ZnFe₂O₄2(a)、rGO-ZnFe₂O₄(b)與rGO-ZnFe₂O₄1/2(c)的XRD譜圖。

圖4 rGO-ZnFe₂O₄2(a)、rGO-ZnFe₂O₄(b)與rGO-ZnFe₂O₄1/2(c)的掃描電鏡譜圖。

圖5 rGO-ZnFe₂O₄1/2的透射電鏡譜圖。

圖6 rGO-ZnFe₂O₄(a)、rGO-ZnFe₂O₄2(b)與rGO-ZnFe₂O₄1/2(c)的磁滯回線。

圖7反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系(a)TMB+rGO-ZnFe₂O₄、(b)TMB+H₂O₂、(c)TMB+H₂O₂+rGO-ZnFe₂O₄吸光度的影響。

圖8 pH對(duì)rGO-ZnFe2O41/2催化活性(a)與溶液中泄漏鐵離子濃度(b)的影響。

圖9溫度對(duì)rGO-ZnFe₂O₄1/2催化性能的影響。

圖10材料用量rGO-ZnFe₂O₄1/2催化性能的影響。

圖11 TMB濃度對(duì)rGO-ZnFe₂O₄1/2催化性能的影響。

圖12 H₂O₂濃度對(duì)rGO-ZnFe₂O₄1/2催化性能的影響。

圖13 rGO-ZnFe₂O₄1/2納米酶的穩(wěn)定性。

圖14 rGO-ZnFe₂O₄1/2納米酶的重復(fù)利用性。

圖15葡萄糖的響應(yīng)曲線(a)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)(插圖為不同濃度葡萄糖所對(duì)應(yīng)的溶液照片)。

圖16測(cè)定葡萄糖的選擇性。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)rGO-ZnFe₂O₄納米酶的合成

A.首先稱取1.0g石墨粉于研缽中，加入NaCl固體50g，研磨10分鐘后，加水進(jìn)行溶解、過(guò)濾、洗滌，然后除去NaCl。將處理過(guò)的石墨粉轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入23mL濃H₂SO₄，室溫條件下攪拌8小時(shí)。再將圓底燒瓶置于冰水浴中，緩慢加入3.0g KMnO₄固體，于35-40℃攪拌30分鐘，再于65-80℃攪拌45分鐘。然后加入46mL水，于98-105℃下繼續(xù)攪拌30分鐘。最后，加入140mL水和10mL 30％H₂O₂終止反應(yīng)，溶液顏色變?yōu)榱咙S色。所得到的產(chǎn)品用5％HCl洗滌后，再用超純水洗滌，離心(12000轉(zhuǎn)/分)，重復(fù)此過(guò)程至無(wú)法通過(guò)離心分離為止。然后將得到的黃色懸濁液轉(zhuǎn)移到透析袋中，于超純水中透析一周至GO溶液為中性為止。最后將該溶液放于培養(yǎng)皿中，90℃干燥，得到GO固體。將所得的GO固體剪碎，備用。

B.將100mg GO，0.54g FeCl₃·6H₂O和0.136g ZnCl₂于50mL乙二醇中，超聲至分散完全使各物質(zhì)混合均勻，隨后，加入3.6g NaOAc和1.0g聚乙二醇，在60℃水浴中攪拌30分鐘，將所得溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，200℃下反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束以后，自然冷卻。待降至室溫時(shí)，將最終所得到的黑色產(chǎn)物用磁鐵進(jìn)行分離，然后用乙醇和去離子水交替洗滌若干次得到rGO-ZnFe₂O₄納米酶。最后將rGO-ZnFe₂O₄納米酶置于真空干燥箱中于45℃干燥，備用。

實(shí)施例2

A.首先稱取1.0g石墨粉于研缽中，加入NaCl固體50g，研磨10分鐘后，加水進(jìn)行溶解、過(guò)濾、洗滌，然后除去NaCl。將處理過(guò)的石墨粉轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入23mL濃H₂SO₄，室溫條件下攪拌8小時(shí)。再將圓底燒瓶置于冰水浴中，緩慢加入3.0g KMnO₄固體，于35-40℃攪拌30分鐘，再于65-80℃攪拌45分鐘。然后加入46mL水，于98-105℃下繼續(xù)攪拌30分鐘。最后，加入140mL水和10mL 30％H₂O₂終止反應(yīng)，溶液顏色變?yōu)榱咙S色。所得到的產(chǎn)品用5％HCl洗滌后，再用超純水洗滌，離心(12000轉(zhuǎn)/分)，重復(fù)此過(guò)程至無(wú)法通過(guò)離心分離為止。然后將得到的黃色懸濁液轉(zhuǎn)移到透析袋中，于超純水中透析一周至GO溶液為中性為止。最后將該溶液放于培養(yǎng)皿中，90℃干燥，得到GO固體。將所得的GO固體剪碎，備用。

B.將100mg GO，1.08g FeCl₃·6H₂O和0.272g ZnCl₂于50mL乙二醇中，超聲至分散完全使各物質(zhì)混合均勻，隨后，加入3.6g NaOAc和1.0g聚乙二醇，在60℃水浴中攪拌30分鐘，將所得溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，200℃下反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束以后，自然冷卻。待降至室溫時(shí)，將最終所得到的黑色產(chǎn)物用磁鐵進(jìn)行分離，然后用乙醇和去離子水交替洗滌若干次得到rGO-ZnFe₂O₄。最后將rGO-ZnFe₂O₄納米酶置于真空干燥箱中于45℃干燥，備用。

實(shí)施例3

A.首先稱取1.0g石墨粉于研缽中，加入NaCl固體50g，研磨10分鐘后，加水進(jìn)行溶解、過(guò)濾、洗滌，然后除去NaCl。將處理過(guò)的石墨粉轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入23mL濃H₂SO₄，室溫條件下攪拌8小時(shí)。再將圓底燒瓶置于冰水浴中，緩慢加入3.0g KMnO₄固體，于35-40℃攪拌30分鐘，再于65-80℃攪拌45分鐘。然后加入46mL水，于98-105℃下繼續(xù)攪拌30分鐘。最后，加入140mL水和10mL 30％H₂O₂終止反應(yīng)，溶液顏色變?yōu)榱咙S色。所得到的產(chǎn)品用5％HCl洗滌后，再用超純水洗滌，離心(12000轉(zhuǎn)/分)，重復(fù)此過(guò)程至無(wú)法通過(guò)離心分離為止。然后將得到的黃色懸濁液轉(zhuǎn)移到透析袋中，于超純水中透析一周至GO溶液為中性為止。最后將該溶液放于培養(yǎng)皿中，90℃干燥，得到GO固體。將所得的GO固體剪碎，備用。

B.將100mg GO，0.27g FeCl₃·6H₂O和0.068g ZnCl₂于50mL乙二醇中，超聲至分散完全使各物質(zhì)混合均勻，隨后，加入3.6g NaOAc和1.0g聚乙二醇，在60℃水浴中攪拌30分鐘，將所得溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，200℃下反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束以后，自然冷卻。待降至室溫時(shí)，將最終所得到的黑色產(chǎn)物用磁鐵進(jìn)行分離，然后用乙醇和去離子水交替洗滌若干次得到rGO-ZnFe₂O₄。最后將rGO-ZnFe₂O₄納米酶置于真空干燥箱中于45℃干燥，備用。

之后使用TEM、XPS、FT-IR等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行了表征。再對(duì)pH值、納米酶用量、溫度、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)用量、H₂O₂用量、反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的測(cè)定條件，建立測(cè)定人體尿液中葡萄糖的可視化方法。

該rGO-ZnFe₂O₄納米酶可將其制作為試紙或試劑，作為糖尿病患者檢測(cè)和預(yù)防時(shí)使用，通過(guò)顯色現(xiàn)象，可以直觀的判斷患者的條件。從而達(dá)到醫(yī)療目的。

性能對(duì)比：

將實(shí)施例1所得產(chǎn)物記錄為標(biāo)準(zhǔn)rGO-ZnFe₂O₄；實(shí)施例2所得產(chǎn)物標(biāo)記為rGO-ZnFe₂O₄2；實(shí)施例3所得產(chǎn)物標(biāo)記為rGO-ZnFe₂O₄1/2。說(shuō)明書附圖1至說(shuō)明書附圖6為產(chǎn)品物理性質(zhì)譜圖。圖8及圖9說(shuō)明產(chǎn)品最適宜pH值為3—4，使用溫度為40℃—60℃為宜,TMB使用量為200—350μM，H₂O₂最佳使用量為1—4mM。圖10及圖11中可以看出，產(chǎn)品有著極好的穩(wěn)定性以及重復(fù)利用性。實(shí)驗(yàn)效果中，實(shí)施例3中效果最為突出，為最優(yōu)實(shí)施例，F(xiàn)eCl₃·6H₂O與ZnCl₂摩爾比為2:1。

實(shí)施例4

rGO-ZnFe₂O₄納米酶對(duì)于糖尿病的檢測(cè)

(a)將20μL 1.0mg/mL葡萄糖氧化酶與50μL處理過(guò)的尿液樣品在37℃下反應(yīng)30分鐘；(b)將470μL HAc-NaAc緩沖溶液、55μL 20mM TMB、20μL 5mg/mL rGO-ZnFe₂O₄1/2加入到上述反應(yīng)溶液中，混合均勻；(c)將上述溶液于50℃條件下反應(yīng)10分鐘，然后將其從水浴中取出，置于冰水中10分鐘終止反應(yīng)；(d)通過(guò)外加磁場(chǎng)將rGO-ZnFe₂O₄1/2與反應(yīng)液分離；(5)將上述反應(yīng)溶液用去離子水稀釋至3.0mL，在652nm處測(cè)其吸光度。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿液中葡萄糖的含量。

表1尿液樣品中葡萄糖的測(cè)定結(jié)果

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。