本發(fā)明涉及一種可溶性家蠅MdproPO1重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

家蠅是廣布全球的衛(wèi)生害蟲，可以傳播細(xì)菌、病毒和寄生蟲等上百種病原體，但其自身卻能夠良好的生存，這完全得益于家蠅有一個(gè)強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)。

昆蟲缺乏獲得性免疫，對(duì)入侵病原的防御完全依靠先天免疫。昆蟲的先天免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩部分。細(xì)胞免疫主要指血細(xì)胞對(duì)病原的包被、吞噬等作用；體液免疫指抗菌因子如抗菌肽的產(chǎn)生和黑化作用等。其中的黑化作用是由酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase-activated system，proPO系統(tǒng)）完成。proPO系統(tǒng)是昆蟲免疫體系的重要成員，對(duì)病原入侵能做出最快速的免疫應(yīng)答，不僅影響黑色素合成，還影響昆蟲的發(fā)育與壽命，并與抗菌肽產(chǎn)生有關(guān)，在識(shí)別與防御病原中起關(guān)鍵作用。

通過幾個(gè)昆蟲proPO系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)proPO系統(tǒng)的激活是一個(gè)絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)：上游的絲氨酸蛋白酶水解下游酶的酶原，活化的酶再去激活下一個(gè)酶的酶原，最終將酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）激活為酚氧化酶（phenoloxidases，PO）。PO是proPO系統(tǒng)中最后的也是最重要的功能組分，能將酚氧化成苯醌，進(jìn)而形成不溶性的黑色素。一般，PO以無活性的proPO存在于血細(xì)胞里。proPO基因在昆蟲中廣泛存在，如埃及按蚊有10個(gè)，果蠅有3個(gè)，家蠶與煙草天娥各有2個(gè)，而蜜蜂只有1個(gè)。昆蟲proPO基因的多樣與其參與機(jī)體黑化、傷口愈合、血細(xì)胞聚集和表皮鞣化等多種功能有關(guān)。但是，目前對(duì)家蠅有幾個(gè)proPO基因以及這些proPO基因重組的蛋白具有什么樣的功能還不清楚。

通過轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)家蠅有2個(gè)proPO基因，稱其為mdproPO1與mdproPO2，具體見論文[Dianxiang Li，Yongli Liang, Xianwei Wang, Lei Wang, Mei Qi, Yang Yu, Yuanyuan Luan. Transcriptomic analysis of Musca domestica to reveal key genes of the prophenoloxidase-activating system. G3 (Bethesda). 2015;5(9):1827-1841.(SCI)]。mdproPO1基因含有一個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼的MdproPO1蛋白無信號(hào)肽，有典型的保守區(qū)：一個(gè)酪氨酸酶保守區(qū)，一個(gè)硫酯基序保守區(qū)，一個(gè)酚氧化酶原激活酶（proPO-activating enzyme，PAP）裂解位點(diǎn)，兩個(gè)結(jié)合銅離子的保守區(qū)（每個(gè)保守區(qū)都有三個(gè)組氨酸殘基，可與銅離子以共價(jià)鍵結(jié)合，兩個(gè)銅離子與氧原子結(jié)合）。但是，并不清楚MdproPO1蛋白是否具備被蛋白酶水解為活性MdPO1的功能，更不知道其具體的功效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的可溶性家蠅MdproPO1重組蛋白，同時(shí)，提供了其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：擴(kuò)增mdproPO1基因的開放閱讀框（ORF）cDNA片段，構(gòu)建mdproPO1/pET-30a重組表達(dá)載體，表達(dá)MdproPO1重組蛋白，進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用。

表達(dá)載體的構(gòu)建：依據(jù)家蠅mdproPO1基因ORF的兩端序列和載體pET-30a的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物mdproPO1 ExF與mdproPO1 ExR，并在引物的5’端引入Kpn I與Sal I酶切位點(diǎn)，用大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）混合液誘導(dǎo)的家蠅幼蟲的cDNA為模板，PCR釣取mdproPO1片段，利用Kpn I與Sal I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，與pET-30a載體定向連接，構(gòu)建mdproPO1/pET-30a表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序證明該表達(dá)載體中的mdproPO1序列正確。

家蠅MdproPO1完整的核苷酸和推斷的氨基酸序列：

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以上為mdproPO1/pET-30a表達(dá)載體表達(dá)的MdproPO1重組蛋白的核苷酸序列(SEQ ID N0.1)與推斷的氨基酸序列(SEQ ID N0.2)。其中，核苷酸序列總長(zhǎng)2169 bp，包括2055 bp的MdproPO1的ORF、N端114 bp來自載體的帶組氨酸His的標(biāo)簽（，終止密碼子用星號(hào)*表示，KpnI酶切位點(diǎn)。推斷的MdproPO1氨基酸序列中的保守序列有Hemocyanin_N 22-140、Hemocyanin_M 146-412、Hemocyanin_C 421-675三個(gè)血藍(lán)蛋白保守區(qū)；一個(gè)酪氨酸酶（tyrosinase）保守區(qū) 201-418；一個(gè)保守的硫酯基序582-589；一個(gè)酚氧化酶原激活酶（proPO-activating enzyme，PAP）裂解位點(diǎn)^*R⁵¹-^*F⁵²；兩個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)：196-245和357-412。

轉(zhuǎn)化子篩選、發(fā)酵培養(yǎng)與MdproPO1誘導(dǎo)表達(dá)：將構(gòu)建好的mdproPO1/pET-30a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過最佳IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間與溫度等一系列條件的摸索，獲得MdproPO1重組蛋白高表達(dá)的mdproPO1/pET-30a/Rosetta菌株與最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件。

MdproPO1包涵體的純化：將高表達(dá)MdproPO1的菌株接種到含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基里，按最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，用IPTG誘導(dǎo)MdproPO1表達(dá)。將誘導(dǎo)后的發(fā)酵液離心，回收菌體細(xì)胞，冰浴中超聲破碎細(xì)胞，再離心，表達(dá)的MdproPO1重組蛋白全在沉淀里，為包涵體，將其收集。

MdproPO1多克隆抗體的制備：將MdproPO1包涵體進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，切出KCl顯色的MdproPO1目標(biāo)帶，用生理鹽水研磨成糊，再加等量的完全弗氏佐劑研磨至油包水的乳液，給家兔背部皮下分點(diǎn)注射。三周后，用不完全弗氏佐劑與MdproPO1蛋白膠同樣研磨成乳液，給兔子進(jìn)行第二次注射。隔兩周，把MdproPO1蛋白膠研磨成乳液，給兔子進(jìn)行肌肉注射。三天后，用免疫雙擴(kuò)散法檢測(cè)到抗體含量穩(wěn)定時(shí)，取兔子全血制備抗血清。每次給兔子注射的MdproPO1蛋白量約為200 μg/kg。

MdproPO1包涵體的變性與復(fù)性：用Buffer A與B洗凈MdproPO1包涵體，去除雜蛋白。再用Buffer C充分變性并溶解包涵體，離心收上清、棄沉淀。上清與輔助Buffer混合后，先后用Buffer D與Buffer E分別透析兩次，充分復(fù)性目的蛋白。

MdproPO1復(fù)性蛋白的純化與鑒定：離心復(fù)性后的MdproPO1蛋白，留上清，過微孔濾膜后上His-Bind親和柱純化，獲得MdproPO1復(fù)性蛋白。用MdproPO1多克隆抗體進(jìn)行Western blot鑒定MdproPO1復(fù)性蛋白。

MdproPO1復(fù)性蛋白的活性檢測(cè)：將MdproPO1復(fù)性蛋白用家蠅血淋巴或Ca²⁺離子等激活劑激活，激活的MdproPO1復(fù)性蛋白轉(zhuǎn)為了活性的MdPO1,能夠催化L-多巴底物形成黑色素，黑色素越多，樣品的A490越大，MdproPO1復(fù)性蛋白的活性越高。

MdproPO1復(fù)性蛋白的應(yīng)用：MdproPO1復(fù)性蛋白可以受加熱或受乙醇等化學(xué)試劑的激活轉(zhuǎn)為氧化酚類物質(zhì)的MdPO1氧化劑；也可以通過MdPO1催化黑色素形成作為黑化劑使用；還可以通過抗體封閉作為滅蠅劑使用；還可以作為抑制或殺滅病原體、提高個(gè)體免疫力的免疫劑使用。

本發(fā)明的有益效果是：（1）構(gòu)建了mdproPO1/pET-30a原核表達(dá)載體。利用家蠅mdproPO1基因ORF的兩端序列和pET-30a載體多克隆位點(diǎn)中的Kpn I與Sal I酶切位點(diǎn)，使MdproPO1酶蛋白序列的N末端連接了表達(dá)載體上的組氨酸標(biāo)簽（His-tagged）。（2）高量表達(dá)了MdproPO1重組蛋白包涵體。將重組質(zhì)粒mdproPO1/pET-30a轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，篩選出了高表達(dá)MdproPO1的mdproPO1/pET-30a/Rosetta菌株，表達(dá)的MdproPO1重組蛋白占菌體總蛋白的22%，且?guī)ЫM氨酸標(biāo)簽，便于親和純化。（3）制備了MdproPO1多克隆抗體。利用MdproPO1重組蛋白制備了兔多克隆抗體，該抗體可以用于MdproPO1酶蛋白產(chǎn)品的鑒定，還可以用于滅蠅劑的開發(fā)。（4）建立了MdproPO1包涵體變性與復(fù)性的有效方法，獲得了有活性的可溶性MdproPO1重組蛋白，可以通過MdproPO1重組蛋白上的His標(biāo)簽進(jìn)行親和層析純化，獲得更純的產(chǎn)品作氧化劑、黑化劑和免疫劑等開發(fā)應(yīng)用。

該法生產(chǎn)的可溶性MdproPO1重組蛋白具有簡(jiǎn)單方便、高效、易重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為SDS-PAGE檢測(cè)的表達(dá)菌株mdproPO1/pET-30a/Rosetta大量表達(dá)MdproPO1蛋白的結(jié)果。隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的增加，MdproPO1蛋白表達(dá)量在誘導(dǎo)1-5小時(shí)內(nèi)不斷增加，到5小時(shí)達(dá)到最大，約占菌體蛋白的22%。

圖2為用SDS-PAGE與Western blot檢測(cè)的MdproPO1包涵體變性與復(fù)性的結(jié)果。用MdproPO1重組蛋白制備的兔多克隆抗體檢測(cè)，MdproPO1包涵體經(jīng)變性與復(fù)性轉(zhuǎn)變成了可溶性蛋白，其大小同家蠅的MdproPO1天然蛋白。

圖3 是酶標(biāo)儀檢測(cè)MdproPO1復(fù)性蛋白活性的結(jié)果。經(jīng)檢測(cè)，MdproPO1復(fù)性蛋白可以為家蠅血淋巴激活，其MdPO1活性大大增加。

圖4是用酶標(biāo)儀檢測(cè)的MdproPO1抗體封閉家蠅的MdPO1酶活性與家蠅死亡數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果顯示，MdproPO1抗體封閉后，家蠅內(nèi)源MdPO1酶活性下降、死亡率增加。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

MdproPO1重組酶的表達(dá)

主要步驟包括：

用1 mL的無菌注射器針頭蘸取等量混合的大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）活菌液（濃度約3 * 10⁸ cfu/mL），輕刺家蠅三齡幼蟲后腹部，每蟲一針，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中飼養(yǎng)4 h，提取刺激家蠅的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，合成含Kpn I與Sal I內(nèi)切酶位點(diǎn)的正反向引物，引物序列為：

mdproPO1 ExF： 5‘—TAGatcGGTACCATGACTGACAAAAAGAATCTCC—3’ (SEQ ID NO.3)

mdproPO1 ExR：5‘—TAGGTCGAC GCTGGCTGGAGAAAACTTAT—3’ (SEQ ID NO.4)；

經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增出2055 bp的mdproPO1基因的ORF，將其克隆入pET-30a質(zhì)粒(Invitrogen)，構(gòu)建mdproPO1/pET-30a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，挑取陽性單菌落接種于含75 μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基里，37℃ 200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1/100的比例轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)菌至新的含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基里，30℃ 200 rpm振蕩培養(yǎng)2.5 h，加入IPTG至終濃度0.5 mM，繼續(xù)30℃振蕩培養(yǎng)5 h，MdproPO1重組酶的表達(dá)量最大，見圖1。

實(shí)施例2

MdproPO1包涵體的純化、變性與復(fù)性

主要步驟包括：

ⅰ.包涵體的純化：將MdproPO1表達(dá)量達(dá)最大的誘導(dǎo)菌液經(jīng)7000 rpm 離心10 min，收菌體，用l × PBS（140 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM Na₂HPO₄,1.8 Mm KH₂PO₄,pH7.4）重懸，冰浴中超聲波破碎后, 4℃ 12000 rpm離心10 min，分開收集上清與沉淀，表達(dá)的MdproPO1重組蛋白全在沉淀里，為包涵體，大小與預(yù)計(jì)的83.5 kDa相符，包括mdproPO1基因2055 bp的ORF的編碼蛋白，79.3 kDa，和載體上的His標(biāo)簽，約4.2 kDa（圖2）。

ⅱ.包涵體的變性：將離心收集到的MdproPO1包涵體，用Buffer A（50 mM Tris-HCl、5 mM EDTA，pH 8.0）懸起，4℃ 10000 rpm 離心20 min，棄上清，重復(fù)一次，去除可溶性雜蛋白。再用Buffer B（50 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、2 M脲，pH 8.0）將MdproPO1包涵體懸起，4℃ 10000 rpm 離心20 min，棄上清，重復(fù)一次。沉淀再用Buffer C（0.1 M Tris-HCl、10 mM DTT、8 M脲加水溶解，pH 8.0）懸起，37℃快速震蕩1 h，充分變性并溶解包涵體蛋白，4℃ 12000 rpm 離心20 min，棄沉淀，保留上清，為變性的包涵體蛋白。

ⅲ.包涵體的復(fù)性：將MdproPO1包涵體變性蛋白與輔助Buffer（0.5 mM Arg、5 mM Gly、50μM CuCl₂、0.5 mM NaCl、5%甘油）按7:13混合，用Buffer D（0.1 M Tris-HCl、5 mM EDTA、5 mM Cysteine、1 M脲，pH 8.0）4℃透析兩次，再用不含脲的Buffer E（0.1 M Tris-HCl、5 mM EDTA、5 mM Cysteine，pH 8.0）4℃透析兩次，每次透析16 h，充分復(fù)性目的蛋白。

ⅳ.MdproPO1復(fù)性蛋白的純化：MdproPO1復(fù)性蛋白經(jīng)4℃ 12000 rpm 離心20 min，留上清，過0.4 μm微孔濾膜，上His-Bind親和柱純化，當(dāng)可溶的MdproPO1復(fù)性蛋白流經(jīng)Ni²⁺瓊脂糖親和層析柱時(shí)，被Ni²⁺吸附，后用咪唑洗脫，獲得了純MdproPO1酶蛋白。用MdproPO1多克隆抗體對(duì)MdproPO1復(fù)性蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，有陽性帶，大小與預(yù)期的一致（圖2）。

ⅴ.MdproPO1復(fù)性蛋白的活性檢測(cè)：用無菌品準(zhǔn)備三組檢測(cè)樣品：

（1）組為30μl菌刺家蠅的血淋巴。制備方法：用1 mL注射器針頭蘸取等量混合的大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）菌液（濃度約3 × 10⁸ cfu/mL），刺激家蠅三齡幼蟲后腹部，每蟲一針，刺激幼蟲轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中飼養(yǎng)4 h，冰浴下斷頭吸取血淋巴于170 μL抗凝劑中，取混合液30μl為測(cè)試樣品；

（2）組為菌刺家蠅的血淋巴與MdproPO1復(fù)性蛋白的混合液，各15μl；（3）組為30μl MdproPO1復(fù)性蛋白。

把三組樣品按表1配制反應(yīng)液，先將不含L-多巴溶液的反應(yīng)液加入96孔板中，30℃孵育5 min，再加30μL的L-多巴溶液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)10 min內(nèi)的樣品的吸光度A490。結(jié)果顯示：三組樣品都有A490，其中，加了MdproPO1復(fù)性蛋白的家蠅血淋巴樣品較其他兩組樣品的A490明顯增高，證明MdproPO1復(fù)性蛋白能夠被家蠅proPO系統(tǒng)特異性絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)強(qiáng)烈激活，轉(zhuǎn)為了高活性的MdPO1,催化L-多巴底物形成了更多的黑色素，而MdproPO1復(fù)性蛋白的A490也較高，說明MdproPO1復(fù)性蛋白可能為反應(yīng)液里的Ca²⁺離子激活了，但激活力度不如家蠅血淋巴（圖3）。

表1. 180μL反應(yīng)液

實(shí)施例3

MdproPO1復(fù)性蛋白的應(yīng)用

主要包括：

ⅰ.氧化劑：MdproPO1復(fù)性蛋白受加熱或用乙醇等化學(xué)試劑激活轉(zhuǎn)為MdPO1，MdPO1是氧化酚類物質(zhì)的氧化劑，因此，MdproPO1復(fù)性蛋白可以開發(fā)為氧化劑。

ⅱ.黑化劑：MdproPO1復(fù)性蛋白受加熱或Ca²⁺離子等激活形成MdPO1，MdPO1催化黑色素形成，因此，MdproPO1復(fù)性蛋白可以開發(fā)為黑化劑。

ⅲ.滅蠅劑與免疫劑：把家蠅幼蟲分成四組，分別做以下處理：1組，不注射；2組，注射0.4μl （3×10⁸ CFU/mL）大腸桿菌；3組，先注射0.4μl MdproPO1抗血清，30 min后再注射0.4μl大腸桿菌（3×10⁸ CFU/mL）；4組，先注射0.4μl前血清，30 min后再注射0.4μl大腸桿菌（3×10⁸ CFU/mL）。每組3個(gè)重復(fù)，20 h后，計(jì)算各組家蠅的死亡率。結(jié)果顯示，第3組家蠅的死亡數(shù)最高（圖4），證明MdproPO1多克隆抗體封閉了家蠅體內(nèi)的MdproPO1蛋白，減弱了家蠅對(duì)病原菌的免疫力，引起家蠅死亡數(shù)相比菌刺組的明顯增加，因此，MdproPO1多克隆抗體可以開發(fā)為滅蠅劑，而MdproPO1重組蛋白可以開發(fā)為抑制或殺滅病原體的免疫劑。

<110>濟(jì)南大學(xué)

<120>一種可溶性家蠅MdproPO1重組蛋白的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用

<141>

<160> 1

<210> 1

<211> 2169

<212> DNA

<213>家蠅（Musca domestica）

<221>重組酚氧化酶原1

<222> (1)...(2169)

<400>1

1 ATGCACCATC ATCATCATCA TTCTTCTGGT CTGGTGCCAC GCGGTTCTGG TATGAAAGAA

61 ACCGCTGCTG CTAAATTCGA ACGCCAGCAC ATGGACAGCC CAGATCTGGG TACCATGACT

121 GACAAAAAGA ATCTCCTGTT GCTGTTCGAC CGCCCCACCG AACCGGTGTT CATGGGAAAG

181 GGCAAAACAT CGACGGTCTT CGATGTTCCC GACAAGTACT TGACAAAACG TTACGAACGT

241 TTGGGCAATG AAATCCAAAG TCGTTTCGGC GAAAAGGCTG AACAACGTGT ACCGGTTAGG

301 GGAATATCCC TGCCCGATTT ACGTATTCCC ATGTCCTTGG GTCGTGATGA ACAATTCTCA

361 TTGTTCGTGC CACGTCATCG TCGCATTGCG GGTCGCTTGA TTGACATTTT CGTTGGCATG

421 CGCACCGTTG ATGATTTGCT CAGTGTTGCT GTGTATGCCC GTGATCGTGT CAATCCCTAT

481 TTGTTCAATT ATGCCCTCTC GGTGGCTTTG TTGCATCGCG AAGATACCAA GGGTTTGGAT

541 TTGCCCTCGT TTGCCCAGAA TTTCCCCGAT AAGTTTGTGG ATTCCCAGGT CTTCCGTCAG

601 GTGAGAGAGG AAGCCACAGT CGTGCCCGAT GGATCTCGCA TGCCAATTGT AGTTCCTCGT

661 GACTATACCG CTTCCGATTT GGATCCCGAA CATCGTCTGT GGTATTTCCG TGAGGATATG

721 GGCATCAATC TTCATCACTG GCATTGGCAT TTGGTTTATC CTTTCGAGGC TGGGGATCGC

781 CGTATTGTCG AGAAGGATCG TCGCGGTGAA CTTTTCTATT ACATGCATCA ACAGGTCATT

841 GCCCGCTACA ACATGGAACG TTTCAGCAGC AATTTGGCCC GTGTCACTAG ATTCAACAAC

901 TTCCGTGAAC CCATTGCTGA AGGTTATTTC CCCAAGATGG ATTCACTGGT TGCCAGCCGT

961 GCTTGGCCAC CACGTTTCGA TAATACTCCC ATCAAAGATT TGAATCGTGA ATTGGATCAA

1021 ATCAATTTGG ACATTTCAGA CTTGGAAAGA TGGCGTGATC GTATTTTCGA GGCCATCCAT

1081 CAAGGATTTG TGGTCGATGC CAGCGGCAAT CGTATTCCCT TGGATGAACG TCGTGGTATT

1141 GATATTCTGG GTAATATGTT GGAAGCTTCC ATCATTTCAC CCAATCAATC GGTGTATGGT

1201 GATTTCCATA ACATGGGTCA TGTCTTCATT TCCTATGCCC ACGATCCTGA TCATCGCCAT

1261 CTGGAGTCAT TCGGCGTAAT GGGTGATTCA GCCACTGCCA TGCGTGATCC TGTCTTCTAC

1321 AGATGGCATG CCTATATTGA TGATATTTTC CAAGAACACA AGACCCGTCT GACACCCTAC

1381 ACCTTGCCTC AATTGCAATA TGATGGTATA TCCATATCTG GACTCCAGGT TAGCTCTGAG

1441 GGTGGTCAAC CCAATGTTTT GAGCACATTC TGGCAACAAT CGGATGTTGA TTTGTCCCGT

1501 GGCATGGGCT TCGTGCCACG CGGTAATGTC TTTGCCCGTT TCACTCATTT GCAACACACA

1561 CCCTTCACCT ATACCATTAA TGTCAACAAT GACAGTGGCG CCCAACGTTT TGGCACCGTA

1621 CGCATCTTCA TAGCCCCCAA GACCGATGAA CGTGGTCAGC CATGGTTGTT CCGCGATCAA

1681 CGTCTGATGA TGGTGGAGTT GGATAAGTTT GTTGTGCAAT TGAATCCTGG CCAAAACACA

1741 ATTCGCCGCC GTTCAACAGA TTCCAGTGTT ACCATTCCAT TTGAACGTAC CTTCCGCAAC

1801 TTGGAGGTTA ATCGCCCAGC CCAAGGTAGC CCCGAAGAAT TGGAATTCAA TTTCTGCGGC

1861 TGTGGCTGGC CTCAGCATAT GTTGATACCA AAGGGTTTGC CCGGTGGCAT GCGTTGTGAA

1921 CTGTTTGTCA TGGTCTCCAA TTATGAAGAT GATCGGGTTG ATCAAACCCT GGTCGGTGCC

1981 TGCAGTGATG CCGCCTCATA CTGTGGTGTC CGTGATCGTC TCTATCCCGA TCGTCGCGCC

2041 ATGGGTTATC CCTTCGATCG TTTGCCTCGT CAAGGTGTTG ATCGTTTGGT CCAATTCCTA

2101 ACACCCAACA TGAGCATTGT TGATGTATCG ATTCGTCATG ATGCCAACAG AGTTGTAATG

2161 AGACAATAA

<120>一種可溶性家蠅MdproPO1重組蛋白的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用

<141>

<160> 1

<210> 2

<211> 722

<212> A A

<213>家蠅（Musca domestica）

<221>重組酚氧化酶原1

<222> (1)...(722)

<400>2

1 MHHHHHHSSG LVPRGSGMKE TAAAKFERQH MDSPDLGTMT DKKNLLLLFD RPTEPVFMGK

61 GKTSTVFDVP DKYLTKRYER LGNEIQSRFG EKAEQRVPVR GISLPDLRIP MSLGRDEQFS

121 LFVPRHRRIA GRLIDIFVGM RTVDDLLSVA VYARDRVNPY LFNYALSVAL LHREDTKGLD

181 LPSFAQNFPD KFVDSQVFRQ VREEATVVPD GSRMPIVVPR DYTASDLDPE HRLWYFREDM

241 GINLHHWHWH LVYPFEAGDR RIVEKDRRGE LFYYMHQQVI ARYNMERFSS NLARVTRFNN

301 FREPIAEGYF PKMDSLVASR AWPPRFDNTP IKDLNRELDQ INLDISDLER WRDRIFEAIH

361 QGFVVDASGN RIPLDERRGI DILGNMLEAS IISPNQSVYG DFHNMGHVFI SYAHDPDHRH

421 LESFGVMGDS ATAMRDPVFY RWHAYIDDIF QEHKTRLTPY TLPQLQYDGI SISGLQVSSE

481 GGQPNVLSTF WQQSDVDLSR GMGFVPRGNV FARFTHLQHT PFTYTINVNN DSGAQRFGTV

541 RIFIAPKTDE RGQPWLFRDQ RLMMVELDKF VVQLNPGQNT IRRRSTDSSV TIPFERTFRN

601 LEVNRPAQGS PEELEFNFCG CGWPQHMLIP KGLPGGMRCE LFVMVSNYED DRVDQTLVGA

661 CSDAASYCGV RDRLYPDRRA MGYPFDRLPR QGVDRLVQFL TPNMSIVDVS IRHDANRVVM

721 RQ

<160>2

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>引物

<400>3

1 TAG atc GGT ACC ATG ACT GAC AAA AAG AAT

31 CTC C

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>引物

<400>4

1 TAG GTC GAC GCT GGC TGG AGA AAA CTT AT