本發(fā)明涉及一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，因疾病、創(chuàng)傷、人口老齡化等原因?qū)е碌墓菗p傷患者數(shù)量劇增。骨缺損修復(fù)主要采用自體骨或同種異體骨移植以及人工骨替換等方法。其中自體骨移植因其良好的骨誘導性和生物相容性，迄今仍是骨修復(fù)的“金標準”。但由于來源受限、供骨部位易感染等問題，臨床應(yīng)用受到限制；而異體骨則存在不同程度的免疫排異反應(yīng)及潛在的病源傳播風險。盡管目前已經(jīng)有不少骨修復(fù)材料獲得臨床應(yīng)用，但單純材料生物活性普遍不足，嚴重影響了其臨床使用效果。

對骨生長和修復(fù)有促進作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白生長因子的發(fā)現(xiàn)為提高骨修復(fù)材料的活性提供了有效的手段。bmp屬于轉(zhuǎn)化生長因子tgf-β超家族成員，于1965年首次被發(fā)現(xiàn)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)20余種bmp成員。其中bmp-2研究最為廣泛，其誘導成骨作用已得到證實，并且已分別獲美國食品和藥物管理局（fda）和歐洲藥品管理局（emea）批準用于臨床，具有廣闊的應(yīng)用前景。bmp是一種疏水性非膠原酸性糖蛋白，存在于動物骨組織中，但含量極低，每千克鮮骨中僅分離出幾微克bmp，且分離過程繁雜，純度低，重復(fù)性差，質(zhì)量控制困難，難以滿足臨床需求。利用基因重組技術(shù)不僅可以實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，還可以避免免疫排斥反應(yīng)，具有極佳的發(fā)展前景。

目前，bmp-2可以采用真核細胞和原核細胞兩種系統(tǒng)表達。真核細胞表達系統(tǒng)使用哺乳動物細胞，其表達產(chǎn)物可以糖基化，有更好的翻譯后修飾，活性相對較高。目前的國外產(chǎn)品大多采用真核表達體系制備。但真核體系表達量低，因此表達產(chǎn)物回收及純化均困難，導致生產(chǎn)成本很高。目前國外bmp產(chǎn)品的價格十分昂貴，臨床推廣難度很大。與真核表達系統(tǒng)相比，原核細胞表達系統(tǒng)具有表達效率高、對培養(yǎng)環(huán)境耐受性強、易于控制，產(chǎn)物穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，更利于臨床推廣。但其主要問題是較難正確加工和折疊形成有活性的蛋白質(zhì)，特別是可重復(fù)性的復(fù)性和純化的難度很大，致使大部分工作停留在實驗室水平，無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的制備方法。

一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率采用密碼子優(yōu)化軟件初步優(yōu)化hbmp-2的cdna序列，再根據(jù)經(jīng)驗值計算，進一步更換其中部分核苷酸編碼，得到優(yōu)化的hbmp-2基因的dna序列；

（2）全基因合成hbmp-2基因dna序列，酶切后插入載體pbv220，獲得優(yōu)化的hbmp-2表達質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序驗證插入片段與設(shè)計相符；

（3）先以常規(guī)氯化鈣法采用分子克隆技術(shù)制備感受態(tài)表達系統(tǒng)，隨后用所得的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，在抗性平板中挑取單菌落，培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，酶切測序；

（4）挑取重組子，接種于裝有含葡萄糖和抗生素的lb培養(yǎng)液的搖瓶中，在氣浴振蕩器中培養(yǎng)15h，溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r·min，然后冰浴條件下加入無菌甘油，分裝后在80℃冰箱保存，備用；

（5）從含正確表達質(zhì)粒的大腸桿菌抗性平板中挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液搖瓶中；在搖床中培養(yǎng)8h溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r·min，再按體積比為1:10的比例將培養(yǎng)物接種到lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，條件：ph7.0±0.2，溫度30℃，轉(zhuǎn)速180r·min；

（6）隨后升溫至42℃進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)6h；

（7）結(jié)束培養(yǎng)，在（4±2）℃溫度下離心分離（轉(zhuǎn)速7500r·min?1）收集菌體，裂解后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；

（8）將收集的菌體，與te緩沖溶液按1g:10ml的比例混合，再按1g:1mg的比例與溶菌酶混合，采用高壓均質(zhì)法進行菌體破碎，離心分離（轉(zhuǎn)速10000r·min?1）并收集沉淀；

（9）加入洗滌溶液（1g沉淀物/20ml洗滌液），攪拌2h后，在（4±2）℃下離心分離，收集沉淀物；

（10）沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗滌數(shù)次后，加入10mmol·l?1的tris（ph7.5）溶液（1g沉淀物/20mltris），清洗后離心收集沉淀，得包涵體；

（11）包涵體/10ml的比例加入裂解液；

在（4±2）℃下，攪拌裂解8h，然后離心[轉(zhuǎn)速10000r·min?1，溫度（4±2）℃]30min，棄沉淀，取離心上清液加入含復(fù)性助劑的復(fù)性液中，稀釋至蛋白含量為0.1mg·ml?1，復(fù)性7d；

（12）從復(fù)性液中回收有活性的融合蛋白二倍體，然后在30～7℃下凍干，得到目標蛋白。

本發(fā)明所述方法通過截取編碼rhbmp-2羧基端氨基酸肽段的rhbmp-2的cdna制備大腸桿菌rhbmp-2菌株，通過發(fā)酵及工藝優(yōu)化，獲得bmp包涵體，經(jīng)分離純化與復(fù)性，制得成品純度高。

具體實施方式

一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率采用密碼子優(yōu)化軟件初步優(yōu)化hbmp-2的cdna序列，再根據(jù)經(jīng)驗值計算，進一步更換其中部分核苷酸編碼，得到優(yōu)化的hbmp-2基因的dna序列；

（2）全基因合成hbmp-2基因dna序列，酶切后插入載體pbv220，獲得優(yōu)化的hbmp-2表達質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序驗證插入片段與設(shè)計相符；

（3）先以常規(guī)氯化鈣法采用分子克隆技術(shù)制備感受態(tài)表達系統(tǒng)，隨后用所得的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，在抗性平板中挑取單菌落，培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，酶切測序；

（4）挑取重組子，接種于裝有含葡萄糖和抗生素的lb培養(yǎng)液的搖瓶中，在氣浴振蕩器中培養(yǎng)15h，溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r·min，然后冰浴條件下加入無菌甘油，分裝后在80℃冰箱保存，備用；

（5）從含正確表達質(zhì)粒的大腸桿菌抗性平板中挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液搖瓶中；在搖床中培養(yǎng)8h溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r·min，再按體積比為1:10的比例將培養(yǎng)物接種到lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，條件：ph7.0±0.2，溫度30℃，轉(zhuǎn)速180r·min；

（6）隨后升溫至42℃進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)6h；

（7）結(jié)束培養(yǎng)，在（4±2）℃溫度下離心分離（轉(zhuǎn)速7500r·min?1）收集菌體，裂解后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；

（8）將收集的菌體，與te緩沖溶液按1g:10ml的比例混合，再按1g:1mg的比例與溶菌酶混合，采用高壓均質(zhì)法進行菌體破碎，離心分離（轉(zhuǎn)速10000r·min?1）并收集沉淀；

（9）加入洗滌溶液（1g沉淀物/20ml洗滌液），攪拌2h后，在（4±2）℃下離心分離，收集沉淀物；

（10）沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗滌數(shù)次后，加入10mmol·l?1的tris（ph7.5）溶液（1g沉淀物/20mltris），清洗后離心收集沉淀，得包涵體；

（11）包涵體/10ml的比例加入裂解液；

在（4±2）℃下，攪拌裂解8h，然后離心[轉(zhuǎn)速10000r·min?1，溫度（4±2）℃]30min，棄沉淀，取離心上清液加入含復(fù)性助劑的復(fù)性液中，稀釋至蛋白含量為0.1mg·ml?1，復(fù)性7d；

（12）從復(fù)性液中回收有活性的融合蛋白二倍體，然后在30～7℃下凍干，得到目標蛋白。