本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種快速、高效構(gòu)建tale重復(fù)序列載體的方法。

背景技術(shù)：

對基因組特定位點進(jìn)行定向修飾是科研工作者長久以來的夢想。雖然鋅指核酸酶(zincfingernuclease)的出現(xiàn)大大促進(jìn)了基因組編輯領(lǐng)域的發(fā)展，但是篩選出能高效、特異結(jié)合特定dna序列的鋅指蛋白是非常困難的技術(shù)難題，并且這項技術(shù)耗時、費力、成本較高。來自于植物病原體xanthomonas的類轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptionactivator-likeeffector，tale)能夠特異地識別特定的dna序列。研究表明，tale的dna識別結(jié)構(gòu)域主要由1到33個長度為33-35個氨基酸殘基的重復(fù)單元串聯(lián)后，再加上末尾的一個含有20個氨基酸殘基的半重復(fù)單位構(gòu)成。在單個重復(fù)單元中，第12、13位氨基酸殘基決定了tale識別dna的特異性，被稱為重復(fù)可變二殘基(repeatvariabledi-residue，簡稱rvd)位點；其它位點的氨基酸殘基則高度保守。不同的rvd能夠分別特異識別a、t、c、g四種堿基(bochetal.,2009)。由于tale蛋白識別dna是基于一種氨基酸：核苷酸特異對應(yīng)識別的模式，可以預(yù)期其在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究、臨床治療及藥物研發(fā)，以及農(nóng)林牧漁業(yè)經(jīng)濟物種遺傳改造等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。將tale的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其它功能性的結(jié)構(gòu)域融合后，可以得到各種衍生的融合蛋白，由此，在理論上能對基因組的特定位點進(jìn)行多種不同的特定修飾。比如，與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合后，能夠特異增強靶基因的表達(dá)(zhangetal.,2011a)；與組蛋白去甲基化酶融合后，可以改變特定基因座(genomelocus)的表觀遺傳狀態(tài)(mendenhalletal.,2013)；與foki核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域融合形成的蛋白稱為tale核酸酶(talenuclease，簡稱talen)，能夠?qū)蚪M的特定靶位點進(jìn)行定向切割，從而實現(xiàn)基因打靶(milleretal.,2011)。目前，tale技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因組修飾領(lǐng)域，而關(guān)鍵步驟是要構(gòu)建識別特異dna序列的tale載體。為保證tale蛋白識別的特異性并減少脫靶效應(yīng)，人工合成的tale蛋白通常含有15個以上的重復(fù)單元。由于tale序列的高度保守性，tale串聯(lián)重復(fù)序列的構(gòu)建不能用常規(guī)的分子克隆方法來完成，這成為tale應(yīng)用的最大障礙。目前，構(gòu)建tale串聯(lián)重復(fù)序列的主要方法包括人工合成全長的tale序列，基于goldengate的載體克隆技術(shù)，基于同尾酶的載體克隆技術(shù)，基于t4dna聚合酶的不依賴連接酶(ligation-independentcloning,lic)的載體克隆技術(shù)，以及基于user酶的ultimate技術(shù)。goldengate技術(shù)主要利用iis類限制性內(nèi)切酶的特性：識別位點和切割位點不在同一位置；因此，當(dāng)把含有切割位點的接頭加在5’和3’端時，通過酶切反應(yīng)產(chǎn)生的黏性末端如果互補，就可以通過連接反應(yīng)將這些dna片段連接在一起，并且正確連接的片段將不再有對應(yīng)的識別位點。未連接的產(chǎn)物由于具有識別位點會再次被切割，最終正確連接的產(chǎn)物越來越多?；谶@種方法的tale載體構(gòu)建已經(jīng)廣泛報道(cermaketal.,2011；zhangetal.,2011b)。基于同尾酶的tale構(gòu)建原理如下：其采用了“替代重復(fù)單元”(或稱“旁重復(fù)單元”,alternativerepeatunit),從而能夠利用氨基酸密碼的簡并性在這種重復(fù)單元的兩端設(shè)計一對同尾酶(5′端speⅰ和3′端nheⅰ)的酶切位點，再加上一個輔助性的hindⅲ位點,這樣就可以用相同的酶切策略、通過酶切-連接的循環(huán)操作構(gòu)建任意長度的重復(fù)序列(huangetal.,2011)?；趖4dna聚合酶的不依賴連接酶(ligation-independentcloning,lic)的tale構(gòu)建原理如下：在只有一種dntp情況下利用t4dna聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性產(chǎn)生固定長度的互補尾部。該酶以3’-5’方向切除核苷酸直至其遇到與反應(yīng)混合物中加入的那種dntp相同的核苷酸。此時，由于dntp的摻入，t4dna聚合酶的聚合酶活性取代了核酸外切酶活性。由于這些互補尾部較長，因此不需要額外的dna連接酶就可以被連接起來(schmid-burgketal.,2013)。ultimate原理如下：這種方法需要先構(gòu)建3個單體所有可能組和的載體庫，然后利用user酶特異識別并切割脫氧尿嘧啶核苷酸殘基(du)的特性，使dna片段產(chǎn)生獨特的單鏈dna突出末端，從而達(dá)到組裝tale的目的(yangetal.,2013)。

直接合成法最大的缺點在于價格非常昂貴，而且對于發(fā)片段的合成容易出錯。基于goldengate的方法技巧性較強，反應(yīng)條件需要反復(fù)摸索和調(diào)整，而且效率相對較低。lic和ultimate的方法需要構(gòu)建大量的質(zhì)粒庫，過程比較繁瑣。

固相合成法：這種方法使通過親和素-鏈霉素系統(tǒng)將tale重復(fù)單元和磁珠偶聯(lián)，通過不斷地添加和洗脫達(dá)到構(gòu)建任意長度tale重復(fù)序列的目的。但是這種方法比較昂貴且耗時，工作量大(reyonetal.,2012)。

目前的技術(shù)在高通量文庫的構(gòu)建方面存在技術(shù)復(fù)雜，工作量大等方面的缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前構(gòu)建tale高通量文庫的方法工作量大且復(fù)雜，不利于tale技術(shù)的推廣的問題。本發(fā)明提供了一種通過一步克隆反應(yīng)即可得到完整的tale載體的方法，極大地簡化了高通量文庫的構(gòu)建。

本發(fā)明提供了一種構(gòu)建tale重復(fù)序列載體的方法，所述方法包括：

1)以含有tale二聚體的核苷酸序列為模板進(jìn)行pcr擴增；

2)以bsai酶切步驟1)得到的擴增產(chǎn)物，將所述酶切獲得的含tale的片段連接形成talen重復(fù)序列載體。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，步驟1)中所述tale二聚體的單體具有如seqidno:1所示的通式：

seqidno:1ltpeqvvaiasx1x2ggkqaletvqrllpvlcqx3hg；

其中，x1x2選自nh、ni、hd和ng中的一個組合；x3為a或d。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，編碼所述單體的核苷酸序列為seqidno:2。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述含有tale二聚體的序列是通過包含下述步驟的方法得到的：

首先，以包含seqidno:2的核苷酸序列為模板，使用引物f9/r9和f10/r10分別用q5dna聚合酶pcr擴增得到第一個tale單體和第二個tale單體；然后使用引物f9/r10通過重疊pcr將所述第一個和第二個tale單體拼接起來；其中，所述引物f9為seqidno:19；引物r9為seqidno:20；引物f10為seqidno:21；引物r10為seqidno:22。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述步驟1)中pcr所使用的二聚體擴增引物選自下述組合中一組或多組：

以seqidno:3為上游引物，seqidno:4為下游引物；

以seqidno:5為上游引物，seqidno:6為下游引物；

以seqidno:7為上游引物，seqidno:8為下游引物；

以seqidno:9為上游引物，seqidno:10為下游引物；

以seqidno:11為上游引物，seqidno:12為下游引物；

以seqidno:13為上游引物，seqidno:14為下游引物；

以seqidno:15為上游引物，seqidno:16為下游引物；

或以seqidno:17為上游引物，seqidno:18為下游引物；

優(yōu)選地，所述二聚體擴增的反應(yīng)條件為：98℃反應(yīng)30秒，98℃反應(yīng)10秒,55℃反應(yīng)10秒,72℃反應(yīng)20秒；30個循環(huán)后，72℃延伸2min，產(chǎn)物于4℃保存。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，步驟2)是通過包括下述步驟的方法實現(xiàn)的：

將步驟1)中得到的pcr回收片段、talen骨架載體、bsai酶、dna連接酶、cutsmart緩沖液、atp混勻，置于pcr儀中，反應(yīng)條件為：37℃反應(yīng)5分鐘，20℃反應(yīng)5分鐘，20個循環(huán)；50℃反應(yīng)5分鐘，80℃反應(yīng)5分鐘；優(yōu)選地，所述talen骨架載體選自ptalen-ni、ptalen-nn、ptalen-ng或ptalen-hd；；優(yōu)選地，所述dna連接酶為t4連接酶或t7連接酶。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述pcr回收片段為多種不同的片段；優(yōu)選地，每一種pcr回收片段與talen骨架載體的質(zhì)量比為1：10。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種含有tale二聚體的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是通過包括下述步驟的方法得到的：

首先，以seqidno:2為模板，使用引物f9/r9和f10/r10分別用q5dna聚合酶pcr擴增得到第一個tale單體和第二個tale單體；然后使用引物f9/r10通過重疊pcr將所述第一個和第二個tale單體拼接起來；然后，通過ecorⅰ/bamhⅰ酶切，得到tale二聚體單元；最后，將所述tale二聚體單元克隆到pegfp-n1載體中，即得；其中，所述引物f9為seqidno:19；引物r9為seqidno:20；引物f10為seqidno:21；引物r10為seqidno:22。

另一方面，本發(fā)明具有以下有益效果：

盡管現(xiàn)有技術(shù)中存在利用user克隆快速、簡便地構(gòu)建tale相關(guān)質(zhì)粒的方法，但是該方法需要兩步反應(yīng)才能得到完整的tale載體，而且在第一步反應(yīng)時涉及到載體連接，需要轉(zhuǎn)化、搖菌、鑒定及提取質(zhì)粒，客觀上提高了工作量，耗費了時間，不利于高通量構(gòu)建tale相關(guān)載體。基于此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種可以一步快速構(gòu)建tale相關(guān)載體的方法，非常適合高通量tale文庫的構(gòu)建。

本發(fā)明方法為了達(dá)到一步能夠完成載體構(gòu)建的目的，在工作量和起始tale重復(fù)單元的數(shù)量之間取得平衡，發(fā)明人在研究中：發(fā)現(xiàn)如果選用tale單體作為起始模板只需要構(gòu)建4個起始質(zhì)粒，但需要將十幾個單體一次性連接起來，難度大、效率低；如果選用tale三聚體作為起始模板則需要構(gòu)建64個起始質(zhì)粒(4×4×4)，需要的質(zhì)粒過多，工作量較大，但相對比較容易將片段連接起來。最優(yōu)選地以tale二聚體作為起始的模板，這樣涉及的載體數(shù)量不會太多，也比較有可能將8個片段一次性連接起來。

相對于現(xiàn)有技術(shù)中構(gòu)建talen的方法，本發(fā)明操作更加簡單，需要的載體數(shù)量和工作量更少，并且能夠通過pcr的方式進(jìn)行擴增，大大提高了工作效率。

附圖說明

圖1為一步法構(gòu)建talen的方法的示意圖。其中，每個tale二聚體兩側(cè)各包含一個bsai識別位點。pcr產(chǎn)物經(jīng)bsai酶切后產(chǎn)生各不相同的粘性末端，然后被連接成完整的talen載體。

圖2為tale二聚體單元的構(gòu)建步驟。該圖為talen結(jié)構(gòu)示意圖，包含一個氨基端保守結(jié)構(gòu)域，一個胸腺嘧啶識別結(jié)構(gòu)域和一系列的重復(fù)單元以及融合foki結(jié)構(gòu)域的羧基端保守序列；tale二聚體pcr和菌落pcr鑒定結(jié)果。

圖3為利用一步法構(gòu)建talen質(zhì)粒。a為pcr擴增對應(yīng)的1-8位tale二聚體；b為分別利用t4；c為t7dna連接酶構(gòu)建talen質(zhì)粒的菌落pcr鑒定結(jié)果。

圖4為通過flash法構(gòu)建talen載體的步驟示意圖。

圖5為通過lic法構(gòu)建talen載體的步驟示意圖；其中，a為將tale單體組裝成五聚體的示意圖；b為將五聚體組裝進(jìn)載體的示意圖；c為將五聚體組裝成完整talen載體的示意圖。

圖6為其它構(gòu)建talen載體的常見方法，其中，a為利用三聚體文庫構(gòu)建完整talen載體的示意圖；b為利用此法構(gòu)建talen的流程圖；c為利用此法構(gòu)建的talen體內(nèi)切割活性檢測實例。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，實施例僅用于進(jìn)一步說明和闡釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明。

除非特殊指明，本發(fā)明所使用的試劑和材料均可通過商業(yè)途徑獲得。

實施例1一步法構(gòu)建talen的方法

1.按照talen位點選取原則在基因外顯子區(qū)域選擇16bptale結(jié)合位點。

2.利用二聚體擴增引物(如表1所示)pcr擴增tale結(jié)合位點對應(yīng)位置的tale二聚體，并純化回收pcr產(chǎn)物。

3.選取對應(yīng)位置的二聚體pcr回收片段各10ng,talen骨架載體100ng，加入bsai、t4/t7dna連接酶、cutsmart緩沖液、atp等混勻，于pcr儀中按如下反應(yīng)操作：37℃反應(yīng)5分鐘，20℃反應(yīng)5分鐘，20個循環(huán)；50℃反應(yīng)5分鐘，80℃反應(yīng)5分鐘。

4.反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，第二天挑單克隆搖菌，利用菌落pcr鑒定陽性克隆。

表1二聚體擴增引物

表中下劃線處表示bsai酶切位點。

實施例2tale二聚體起始質(zhì)粒的構(gòu)建

由于tale重復(fù)序列的性質(zhì)，為了使pcr能夠順利地擴增tale二聚體，利用密碼子的簡并性發(fā)明人對編碼前后兩個tale單體的dna序列做了優(yōu)化，同時將第二個單體的倒數(shù)第三個氨基酸由a變成d。首先以包含seqidno:2的核苷酸序列為模板，使用引物f9/r9和f10/r10分別用q5dna聚合酶pcr擴增第一和第二個tale單聚體，然后使用引物f9/r10通過重疊pcr將第一個和第二個tale單聚體拼接起來；再用ecori/bamhi雙酶切，將tale二聚體單元克隆進(jìn)pegfp-n1載體中，測序后提取質(zhì)粒。

seqidno:2ctcaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacatcgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggattgacgcccgcacaagtagttgcaattgcgagcaacatcgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcccgttttatgtcaggaccatggc

f9：seqidno:195'cgcgaattcctcaccccagagcaggtcgtgg3'

r9：seqidno:205’ctacttgtgcgggcgtcaatccgtgcgcttggcacagca3’

f10：seqidno:215’tgctgtgccaagcgcacggattgacgcccgcacaagtag3’

r10：seqidno:225'ggcggatccgccatggtcctgacataaaac3'

實施例3tale一步法構(gòu)建talen載體

首先驗證pcr能否擴增出tale二聚體條帶。利用表1所示的擴增引物進(jìn)行pcr擴增，電泳條帶顯示對應(yīng)1-8個二聚體均能夠被擴增(圖3)。然后回收pcr產(chǎn)物并利用實施例1中的方法驗證是否能夠得到正確組裝的陽性克隆。圖3中b和c分別利用t4或者t7dna連接酶來連接，發(fā)現(xiàn)用這兩種酶都能得到正確組裝的talen載體。

比較例4tale一步法與flash法的比較

圖4為flash法構(gòu)建talen載體的步驟示意圖，其步驟為：

flash法主要是將tale重復(fù)單元與生物素偶聯(lián)，利用生物素-親和素系統(tǒng)不斷地純化、回收連接的片段，最終合成預(yù)定長度的片段并將其插入talen表達(dá)載體中。

具體可參見reyonetal,2012；natbiotechnol。

與flash法相比，本發(fā)明的tale一步法更加簡單、快速，并且僅需要更少的工作量即可完成。

比較例5tale一步法與lic法的比較

圖5為lic法構(gòu)建talen載體的步驟示意圖，其步驟為：

lic法主要利用t4dna聚合酶的3’-5’外切酶活性形成粘性末端，在退火反應(yīng)中具有同源序列的載體和插入基因會連接起來；帶缺口和突出端的dna復(fù)合物在細(xì)菌中能有效被修復(fù)。通過這種克隆方法可以同時將多個tale重復(fù)單元連接起來，從而得到完整的talen載體。

具體可參見schmid-burgketal,2013；natbiotechnol。

與lic法相比，本發(fā)明的tale一步法具有需要載體量和工作量更少的優(yōu)點。

比較例6tale一步法與其它方法的比較

圖6為另一種常見的構(gòu)建talen載體的步驟示意圖，其步驟為：

這種方法主要是利用goldengate克隆法首先構(gòu)建一個tale三聚體的載體庫，再根據(jù)需要從這個載體庫中選擇對應(yīng)的tale三聚體通過一輪goldengate反應(yīng)得到完整的talen載體。

具體可參見kimetal.,2013；natbiotechnol。

與該方法相比，本發(fā)明的tale一步法需要的載體量少、工作量更少，并且本發(fā)明的tale一步法可以通過pcr的方法實現(xiàn)，更加快捷簡便。

盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各個條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。