本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域，具體涉及osktn80b基因在降低水稻株高方面的用途。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)60年代，矮稈水稻育種的成功，使水稻產(chǎn)量提高了20％-30％，被稱為水稻育種的“綠色革命”。矮化育種不僅提高了水稻的抗倒伏能力，而且對于增加種植密度、改善水稻的綜合性狀都有重要的作用。目前，生產(chǎn)上應(yīng)用的水稻矮桿基因主要是sd1，存在矮稈基因單一和遺傳背景狹窄等缺點(diǎn)，很容易造成遺傳上的脆弱性和局限性。此外，其他已知的矮桿和半矮桿基因大多對水稻農(nóng)藝性狀有負(fù)面影響，即含有這些矮稈基因的水稻品種農(nóng)藝性狀較差，在實(shí)際生產(chǎn)中很難應(yīng)用，因而限制了水稻矮化育種的發(fā)展。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為水稻的矮化育種提供了一種新的途徑。目前，已克隆了20多個矮桿及相關(guān)基因，其中大部分矮桿基因參與赤霉素(ga)的合成、運(yùn)輸及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如sd1(sasakia等，nature,2002,416(416):701-702；monnal等，dnaresearch,2002,9(1):11；wolfgangspielmeyer等，proceedingsofthenationalacademyofscience,2002,99(13):9043-9048)、d1(fujisaway等，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,1999,96(13):7575-7580)、bc12/gdd1(lij等，plantcell，2011,23(2):628-640)、osspy(shimadaa等，plantjournal,2006,48(3):390-402)、d35(itohh等，plantmolecularbiology,2004,54(4):533)、d18(tongh等，plantcell,2014,26(11):4376)、eui1(zhuy等，plantcell,2006,18(2):442-456)、gid1(tanakan等，plantcell&environment，2006，29(4):619-631)和gid2(sasakia等，science，2003，299(5614):1896-1898)等。這些矮桿基因中，除sd1以外，大多具有“一因多效”的遺傳表型，矮化的同時(shí)伴隨著不利的農(nóng)藝性狀，難以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。osktn80b是編碼微管剪切酶蛋白的基因(wanl等.journalofintegrativeplantbiology,2014,56(7):622-634)。crispr/cas9系統(tǒng)是一種準(zhǔn)確、便捷、高效率的生物基因組編輯工具。該系統(tǒng)僅需要短的grna和核酸酶(cas9)就可以進(jìn)行特定的生物靶基因的編輯。目前，crispr/cas9系統(tǒng)已在擬南芥、煙草、水稻、小麥、高粱、玉米等植物中實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因組編輯。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人在蜀恢498背景的ems誘變突變體庫中意外發(fā)現(xiàn)一種小粒突變體材料，通過全基因組重測序和mutmap定位分析，得到5個候選基因，包括編碼微管剪切蛋白p80亞基osktn80b的loc_os04g58130基因；對候選基因osktn80b進(jìn)行crispr/cas9基因編輯敲除后，意外發(fā)現(xiàn)該基因在調(diào)控水稻株高方面的功能。本發(fā)明是在上述意外發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成的，本發(fā)明目的在于提供osktn80b基因在降低水稻株高方面的用途。本發(fā)明另一目的在于提供用于敲除水稻osktn80b基因的靶點(diǎn)序列。本發(fā)明第三目的在于提供上述靶點(diǎn)序列在降低水稻株高方面的用途。本發(fā)明第四目的在于提供用于敲除水稻osktn80b基因的sgrna。本發(fā)明第五目的在于提供上述sgrna在降低水稻株高方面的用途。本發(fā)明第六目的在于提供通過敲除osktn80b基因降低水稻株高的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：osktn80b基因在降低水稻株高方面的應(yīng)用。所述的osktn80b基因由seqidno.1所示的核苷酸序列組成。所述的osktn80b基因，其編碼的蛋白質(zhì)由seqidno.2所示的氨基酸序列組成。所述的osktn80b基因，其基因組序列由seqidno.3所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明還提供了用于敲除水稻osktn80b基因的靶點(diǎn)序列，所述的靶點(diǎn)序列為sg1或sg2，或sg1和sg2的組合；其中所述的sg1由seqidno.4所示的核苷酸序列組成；所述的sg2由seqidno.5所示的核苷酸序列組成；即sg1：5’-cagaaggaactcatgggga-3’(seqidno.4)；sg2：5’-ttgaattgattgggtctac-3’(seqidno.5)。本發(fā)明還提供了上述靶點(diǎn)序列在降低水稻株高方面的應(yīng)用。上述應(yīng)用中所述的靶點(diǎn)序列為sg1或sg2，或sg1和sg2的組合。本發(fā)明還提供了用于敲除水稻osktn80b基因的sgrna，所述的sgrna的靶點(diǎn)序列為sg1或sg2，或sg1和sg2的組合。上述sgrna在降低水稻株高方面的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了通過敲除水稻osktn80b基因降低水稻株高的方法，所述的敲除水稻osktn80b基因是通過crispr/cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。上述方法中所述的crispr/cas9系統(tǒng)中，其sgrna的靶點(diǎn)序列為sg1或sg2，或sg1和sg2的組合，其中所述的sg1由seqidno.4所示的核苷酸序列組成；所述的sg2由seqidno.5所示的核苷酸序列組成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)、與野生型水稻相比，本發(fā)明osktn80b基因敲除的轉(zhuǎn)基因植株的株高降低了13.56％-16.33％，其降低水稻株高的效果好，為水稻矮稈育種提供了一個新的途徑。(2)、本發(fā)明方法不受遺傳背景限制，也不存在與不良性狀連鎖的問題，通過基因工程方法可以將該基因應(yīng)用到水稻矮化育種中，用以獲得水稻理想株型，增加種植密度，提高水稻產(chǎn)量。(3)本發(fā)明osktn80b基因?yàn)樗局旮哌z傳研究提供了很好的研究材料。附圖說明圖1為osktn80b基因crispr/cas9敲除載體質(zhì)粒電泳圖；其中1為osktn80b基因第一個靶位點(diǎn)sg1的crispr/cas9敲除載體；2為osktn80b基因第二個靶位點(diǎn)sg2的crispr/cas9敲除載體；m為trans2kplusdnamarker。圖2為t0代轉(zhuǎn)基因植株潮霉素檢測電泳圖譜；其中m為marker，1-10為靶位點(diǎn)sg1的t0代植株,11-19代表靶位點(diǎn)sg2的t0代植株。圖3為敲除植株包含靶位點(diǎn)一的pcr擴(kuò)增測序的部分電泳圖譜；其中m為marker,1、2、3和4分別代表部分靶位點(diǎn)sg1敲除的植株。圖4為osktn80b基因靶位點(diǎn)sg1敲除突變體的測序比對結(jié)果及測序峰圖譜(其中一種突變方式)。圖5為敲除植株包含靶位點(diǎn)sg2的pcr擴(kuò)增測序的部分電泳圖譜；其中m為marker,1、2、3和4分別代表部分靶位點(diǎn)sg2敲除的植株。圖6為osktn80b基因靶位點(diǎn)sg2敲除突變體的測序比對結(jié)果及測序峰圖譜(其中一種突變方式)。圖7為日本晴和osktn80b基因crispr/cas9敲除的純合突變的轉(zhuǎn)基因水稻t1代植株照片；其中1為日本晴；2為osktn80b-1crispr/cas9編輯osktn80b基因靶位點(diǎn)sg1獲得的純合突變體植株；3為osktn80b-2crispr/cas9編輯osktn80b基因靶位點(diǎn)sg2獲得的純合突變體植株。圖8為日本晴(wt)和osktn80b-1和osktn80b-2兩個敲除突變體水稻植株的株高統(tǒng)計(jì)分析柱形圖；其中1為日本晴；2為osktn80b-1crispr/cas9編輯osktn80b基因靶位點(diǎn)sg1獲得的純合突變體；3為osktn80b-2crispr/cas9編輯osktn80b基因靶位點(diǎn)sg2獲得的純合突變體?！?*”表示根據(jù)ttest統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異極顯著(p≤0.01)。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋和說明。下述實(shí)施例中所述的方法如非特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例1osktn80bcrispr/cas9敲除載體的構(gòu)建本發(fā)明人在蜀恢498背景的ems誘變突變體庫里篩選到一份粒小突變體材料，通過全基因組重測序和mutmap定位分析，得到5個候選基因，包括其中編碼微管剪切蛋白p80亞基osktn80b的loc_os04g58130基因；對候選基因osktn80b進(jìn)行crispr/cas9基因編輯敲除，意外發(fā)現(xiàn)該基因在調(diào)控水稻植株表型方面的功能。采用百格基因crispr/cas載體構(gòu)建試劑盒構(gòu)建cas9敲除載體。(1)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)：在crispr/cas9系統(tǒng)的sgrna在線設(shè)計(jì)軟件網(wǎng)站：http://www.e-crisp.org/e-crisp/designcrispr.html輸入osktn80b基因序列(見seqidno.1)，設(shè)計(jì)并生成grna的靶點(diǎn)序列sg1和sg2。識別序列選擇19bp，該靶點(diǎn)序列分別為：sg1：5’-cagaaggaactcatgggga-3’(seqidno.4)，sg2：5’-ttgaattgattgggtctac-3’(seqidno.5)。(2)分別將19bp的靶點(diǎn)序列sg1和sg2輸入到百格生物技術(shù)在線網(wǎng)站：http://www.biogle.cn/index/excrispr下面的對話框，分別獲得與試劑盒對應(yīng)的攜帶接頭的寡聚靶點(diǎn)接頭分子oligo1和oligo2，以及oligo3和oligo4。oligo1:5’-tgtgtgcagaaggaactcatgggga-3’(seqidno.6)，oligo2:5’-aaactccccatgagttccttctgca-3’(seqidno.7)。oligo3:5’-tgtgtgttgaattgattgggtctac-3’(seqidno.8)，oligo4:5’-aaacgtagacccaatcaattcaaca-3’(seqidno.9)。oligo1、oligo2、oligo3和oligo4序列由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。按照百格基因crispr/cas載體構(gòu)建試劑盒的步驟操作：(3)制備oligo二聚體雙鏈靶點(diǎn)接頭。將合成好的oligo1和oligo2分別加水溶解至10μm，各取1μl加入到18μl0.5×buffer反應(yīng)體系混合后。在pcr儀上進(jìn)行，95℃加熱3分鐘，然后以約0.2℃/秒緩慢降至20℃，移至室溫冷卻完成退火復(fù)性，獲得oligo二聚體的雙鏈靶點(diǎn)接頭target1，命名為a1。重復(fù)上述方法，獲得oligo3和oligo4的二聚體的雙鏈靶點(diǎn)接頭target2，命名為a2。(4)將a1或a2雙鏈靶點(diǎn)接頭連接至cas9/grna載體。按crispr/cas9vector2μl，oligo二聚體1μl，enzymemix1μl，h2o6μl，反應(yīng)體系(10μl)在冰上混合各個組分，混勻后室溫(20℃)反應(yīng)1小時(shí)。取出保存在-80℃的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α，置于冰上進(jìn)行融化，待融化后加入到上述反應(yīng)體系中；輕輕混勻后放在冰上冰浴30min；42℃熱激30s，迅速取出立即置于冰上2min；加入lb液體培養(yǎng)液200μl，放在37℃、200rpm的搖床上培養(yǎng)40-60min；將搖好的菌液涂板到含有kan的lb平板上(在超凈工作臺上操作)。在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜(kan平板一般放置12-16h)。將過夜的平板取出，挑取白色單克隆重懸于有10μlddh2o的小ep管中，用槍吹打混勻(菌液變渾濁)，進(jìn)行編號；吸取2μl編號的菌液進(jìn)行pcr檢測，其中檢測引物為潮霉素引物：hpt-f:5’-tacacaggccatcggtccaga-3’(seqidno.10)，hpt-r:5’-taggagggcgtggatatgtc-3’(seqidno.11)；pcr反應(yīng)體系(20μl):菌液2.0μl,10×buffer2.0μl,dntps2.0μl,引物2.0μl,taq酶0.2μl,ddh2o11.8μl。pcr擴(kuò)增條件為：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃5min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳分離，篩選出有條帶的陽性克隆，將有條帶的陽性克隆剩余菌液加入到5mllb加kan的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，在37℃、200rpm條件下過夜搖菌；吸出過夜的菌液500μl，加等量滅菌50％甘油混勻，液氮速凍后放入-80℃保存；余下的菌液用于提取質(zhì)粒(參照omega試劑盒說明書)，將提取的質(zhì)粒經(jīng)電泳檢測(圖1)后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果正確，顯示獲得了兩個敲除轉(zhuǎn)化載體，分別命名為：c1和c2。實(shí)施例2：osktn80bcas9轉(zhuǎn)化水稻(1)將實(shí)施例1所得的兩個重組質(zhì)粒c1和c2，分別通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株eha105。每100μleha105感受態(tài)細(xì)胞與0.5-1μg(約2μl)質(zhì)粒dna混勻，依次在冰上、液氮和37℃水浴中各放置5min；用新鮮的lb液體培養(yǎng)基稀釋至1ml，于28℃搖床培養(yǎng)2-4小時(shí)；取出200μl涂布于含抗生素kan(50μg/ml)和rif(50μg/ml)的lb平板上，在28℃培養(yǎng)2-3天。從lb平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落接種到3ml含抗生素的lb液體培養(yǎng)基中于28℃搖床培養(yǎng)過夜，第二天按1％接種量轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，在200rpm繼續(xù)振搖培養(yǎng)至od600為0.6至0.8左右時(shí)，將新鮮的農(nóng)桿菌菌液在4℃、5000rpm下離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的ty液體培養(yǎng)基中，獲得含有osktn80b敲除載體的農(nóng)桿菌菌液，分別命名為d1和d2，此時(shí)d1或d2即可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體材料。采用常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻日本晴的成熟胚愈傷組織。(2)將日本晴水稻成熟種子去殼，于75％的酒精浸泡1min，然后用無菌水沖洗3次；加入濃度為50％的次氯酸鈉(naclo)溶液浸泡30min，無菌水洗8-10次，吸去多余水分；接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)箱中在30℃、光照條件下培養(yǎng)7天左右，至愈傷組織長出；將愈傷組織從種子上分離后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，于相同條件下培養(yǎng)1周左右，即可用于農(nóng)桿菌浸染。(3)取步驟(1)中保存于-80℃冰箱的農(nóng)桿菌菌液10μl于5mlyep培養(yǎng)基(kan50mg/l；rif50mg/l)中，在28℃、200rpm條件下培養(yǎng)24-32h，取1ml菌液于50mlty+as培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)2-4h，至od600約0.1-0.2。(4)將步驟(2)中所得的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)入步驟(3)所獲得的d1和d2農(nóng)桿菌懸浮液中，并共孵育30min，用滅菌的濾紙吸除過多的菌液。將浸染后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基msd+s+as中，在22℃、黑暗條件下培養(yǎng)2-3天。篩選培養(yǎng)，用液體的msd培養(yǎng)基清洗從共培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移的愈傷組織，清洗3次，每次10min：用滅菌濾紙吸除多余的培養(yǎng)基，將愈傷組織接入篩選培養(yǎng)基(msd+ch)中，在30℃、光照條件下培養(yǎng)2-3周；將愈傷組織轉(zhuǎn)入新的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5周，開始出現(xiàn)新的抗性小愈傷組織，將這些新的愈傷組織分離出來并轉(zhuǎn)接入分化培養(yǎng)基中，在30℃、光照條件下培養(yǎng)2-3周。將繁殖變大的愈傷組織轉(zhuǎn)入新的分化培養(yǎng)基中，在30℃、光照條件下培養(yǎng)3周，新的抗性愈傷組織在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30天就開始變綠。將再生的轉(zhuǎn)基因幼苗(大概2-5cm高)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，于光照培養(yǎng)箱中在25-30℃，16h光照/8小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)，獲得再生植株。靶位點(diǎn)sg1敲除(農(nóng)桿菌d1浸染愈傷組織)獲得轉(zhuǎn)基因植株，命名為osktn80b-1；靶位點(diǎn)sg2敲除(農(nóng)桿菌d2浸染愈傷組織)獲得轉(zhuǎn)基因植株，命名為osktn80b-2。將獲得的osktn80b-1和osktn80b-2再生植株移栽到大田種植，提取植株葉片總dna，經(jīng)pcr檢測(pcr反應(yīng)體系和程序與實(shí)施例1相同)，osktn80b-1和osktn80b-2的兩個敲除靶位點(diǎn)分別獲得了17株獨(dú)立的t0代陽性轉(zhuǎn)基因株系(見圖2)。實(shí)施例3：轉(zhuǎn)基因水稻基因組dna提取、突變體的pcr檢測及測序按照如下方法進(jìn)行：采用ctab法提取實(shí)施例2獲得的t0代轉(zhuǎn)基因水稻葉片基因組dna；對t0代的轉(zhuǎn)基因植株的敲除位點(diǎn)進(jìn)行pcr測序分析。其中pcr擴(kuò)增體系為：10×bufferforkod-plus2.5μl、kodplus聚合酶(5u/μl)0.25μl、25mmol/lmgso41μl、dntps(2mmol/l)2.5μl、各引物(10μmol/l，cas9-p80-1f與cas9-p80-1r)0.5μl、和(10μmol/l，cas9-p80-2f與cas9-p80-2r)模板dna0.5μl，以超純水補(bǔ)至25μl。反應(yīng)條件為94℃2min；94℃20s、58℃30s，68℃60s，30個循環(huán)；68℃5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳(電泳緩沖液0.5×tbe)，biorad凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相(見圖3和圖5)，并送成都擎科梓熙生物科技有限公司測序。osktn80b敲除位點(diǎn)的測序引物為cas9-osktn80b-1f和cas9-osktn80b-1r：cas9-osktn80b-1f:5’-gcggtagattctgctagcgt-3’(seqidno.12)，cas9-osktn80b-1r:5’-tgtttggcattgttggacag-3’(seqidno.13)；或?yàn)閏as9-osktn80b-2f和cas9-osktn80b-2r：cas9-osktn80b-2f:5’-ttgggcttccttcgtttagtga-3’(seqidno.14)，cas9-osktn80b-2r:5’-agtcgaacagcaaccaatga-3’(seqidno.15)；結(jié)果在osktn80b-1和osktn80b-2的兩個敲除靶位點(diǎn)共獲得了17株獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)基因株系，測序結(jié)果顯示17株轉(zhuǎn)基因苗都被敲除，osktn80b-1分別獲得了缺失cc以及其他突變類型的突變體，osktn80b-2獲得了a/t堿基的插入以及不同堿基長度缺失的突變體，t0代沒有獲得純合的敲除突變體；選擇t0代株系中，osktn80b-1具有cc堿基缺失的水稻植株(見圖4)以及osktn80b-2含有t堿基插入突變水稻植株(見圖6)，這兩種突變方式導(dǎo)致編碼的蛋白分別移碼突變后提前終止。種植t1代(t0代自交產(chǎn)生)，至成熟期，測定t1代純合的敲除突變體植株和非轉(zhuǎn)基因野生型植株的株高、拍照，并利用ttest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析野生型和t1代純合的敲除突變體植株株高差異的顯著性。結(jié)果(見圖7和圖8)以非轉(zhuǎn)基因野生型植株株高作為100％，cas9敲除osktn80b基因水稻植株的株高降低了約13-15％。同時(shí)測定了成熟期水稻植株不同節(jié)間長度。結(jié)果(見表1)顯示osktn80b基因被敲除水稻植株的第一節(jié)間(p1)、第二節(jié)間(p2)、第三節(jié)間(p3)、第四節(jié)間(p4)和第五節(jié)間(p5)均小于非轉(zhuǎn)基因水稻。這些結(jié)果表明，osktn80b基因的功能缺失能夠抑制每一節(jié)間的延伸。表1nip與osktn80b基因敲除突變體的植株節(jié)間長度比較p(cm)p1(cm)p2(cm)p3(cm)p4(cm)p5(cm)nip21.18±1.9439.95±3.3021.84±1.7013.53±1.325.94±1.821.65±0.79osktn80b19.75±0.8834.29±1.9816.89±0.877.69±1.262.26±0.650.59±0.18t檢測**********注：其中nip為野生型日本晴；osktn80b為osktn80b基因敲除突變體水稻植株。綜上所述，本發(fā)明利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)對osktn80b基因進(jìn)行敲除，獲得了多個不同突變方式的突變體，其t1代純合突變的植株都表現(xiàn)為株高降低。說明本發(fā)明方法可用于降低水稻株高，提高水稻的抗倒伏能力，最終提高水稻產(chǎn)量。sequencelisting<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>osktn80b基因在降低水稻株高方面的應(yīng)用<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>2814<212>dna<213>oryzasativa<400>1atgacgaccaacaccaagcgcgcctacaagctccaggagtttgtggcgcattcatccaat60gtcaactgcctcaagattgggaggaagacttcacgagttctcgtgacaggaggagatgac120cataaggttaatctttgggctattgggaagcccaattcaattttgagtttatcagggcac180accagtgctgtggagtctgttaattttgattccacagaagttttcgtggccgcaggagca240gccagtggaacaataaaactatgggatttagaggaggcaaaaattgtccgcacgcttact300ggacataggtcaaactgcatgtcagttgatttccatccttttggagaattctttgcctcg360gggtcactggacacaaatctgaagatatgggatataagaaggaagggctgtatccacacg420tacaaaggccacacaagaggtgtaaatgcaattagattcacacctgatggccgctgggtt480gtgtctggtggtgaagataatgttgtgaagctctgggatctgacagctggaaagttatta540catgatttcaagtgtcatgaaggccagattcagtgcatagatttccatccccatgagttc600cttctggcaacaggttcatccgataaaactgtcaagttttgggatttggagacctttgaa660ttgattgggtctactggacctgagacaacaggtgttcgatccatgacattcaatcctgat720ggaagatctctgttgtgtgggttgcatgaaagtttaaaggttttctcttgggaaccaata780agatgtcatgataccgttgatgtgggatggtctagactgtctgatctaaatgtccacgag840ggaaaacttcttggttgttcatttaatcaaagttgtgttggaatatgggttgtagatcta900acgcgtcttgagccatatgcaacgggtacttcaacaaaattaaatggtcattcagagttg960aaaagttcgtcaagtagcactatgccattacaaaatgacagtggttcaagggctaacatt1020gggcggttatcagttctacaaaattctgagaataacataaagtcttctacaggaagatta1080tcagtttctcaaaattcagactctgcattgaaagagacaaaatcaacaacttcaagcggg1140ttggttccagtcacacctcagagagctggtaatggctccagtaccaaaacagttggaaat1200tcaacctttgcatctagtggcaccaacctgaagagaggttcactgaagagtaacaactct1260tctagtcttcagaattttagcaaaattgatgtggtgcctgtgataataccaagaactagc1320tcaggaccagagctggctactgattctaggagtgatgctgctgatgtgggccctgttctt1380tctaagagtggtagaagaatagagattgcaaatgattctaggaaagaaagttctgatgtg1440gcagcagctgttgttcccagaacaaactctagaacagaaatggcctctgattcagcacct1500gttgttggtcccagagctaacttaagaatggaagtaagcgctgactcggcacctattgtt1560cccaagtcaggcagaaggttagagtcttctgttgaatctaggaaagaaagtactgatgta1620gcatctgctgctgctccgaagactagttcacggatggaagtggccccagattctgcacct1680cttctttctaaggcaggcagaagggtagagtctgctactgattcaaggaaagaaagtgct1740gatgtggcacctgttgttcccagaacaacttctagaatggaaatggctccggattctagg1800agagaaatttctgctggaagaatgtcaccgtttagggtccaatcaagatatagtgaacta1860cgaaagttaaataatgccaaagctgatgcagataaagttgatgcagggagcaaaaacagt1920gaaacagatgattttacttgtcaaatataccttcctcggaggaatggtgttgttcagtct1980ggaatttctgaagaaacccgggaagatgcaaaacctggtgtgattgacaggatgggattt2040ccaagttctgctgaaccaaatacacaccgcagtgagaattatgtttctagaatgcgtaag2100ccaagagataactgctatattgaagtttcaagagcaggaagaacaaggccaactgcttct2160aattgggaaagcagagatcagtcacctggtaatgaagaaccgacaacaagcaattcttct2220tcgatggctcctacaggccgattatattcatctagaggaagcagtcaagctgctgaaact2280ccaacgatagcaagtgatgaggatgttctatctgttctaatggagcagcatgagctattt2340ctaagctcaactcgatctcggttgacaaaattgcagattgttcatcaaatgtggcaaaga2400aatgatatacggggcattattgcagcaatggagaagatgtctgatcatgccgtatctgct2460gatgttgcaagtgttctgatggagaaaagtgaaacaatcacactagatttatgtactgtt2520attctgcccgtccttactgaccttctggagagtaaaactgacaggcacttaggtgtttca2580ctggaattgttggtgaagcttgtcaggacgtttggatcagtaatacattcaacagtatca2640gctggtccctcttctgttggtgtagatctgcaagcagagcaaaggcgggagcgttgcaac2700ctatgctttattgaattggagaaggtcaaaaataagcttccatttctttccagaagaaaa2760ggggcagtcgcaaacacggcacaggagctcagtcttgtcttccaggaagttatg2814<210>2<211>938<212>prt<213>oryzasativa<400>2metthrthrasnthrlysargalatyrlysleuglngluphevalala151015hisserserasnvalasncysleulysileglyarglysthrserarg202530valleuvalthrglyglyaspasphislysvalasnleutrpalaile354045glylysproasnserileleuserleuserglyhisthrseralaval505560gluservalasnpheaspserthrgluvalphevalalaalaglyala65707580alaserglythrilelysleutrpaspleugluglualalysileval859095argthrleuthrglyhisargserasncysmetservalaspphehis100105110propheglygluphephealaserglyserleuaspthrasnleulys115120125iletrpaspileargarglysglycysilehisthrtyrlysglyhis130135140thrargglyvalasnalaileargphethrproaspglyargtrpval145150155160valserglyglygluaspasnvalvallysleutrpaspleuthrala165170175glylysleuleuhisaspphelyscyshisgluglyglnileglncys180185190ileaspphehisprohisglupheleuleualathrglyserserasp195200205lysthrvallysphetrpaspleugluthrphegluleuileglyser210215220thrglyprogluthrthrglyvalargsermetthrpheasnproasp225230235240glyargserleuleucysglyleuhisgluserleulysvalpheser245250255trpgluproileargcyshisaspthrvalaspvalglytrpserarg260265270leuseraspleuasnvalhisgluglylysleuleuglycysserphe275280285asnglnsercysvalglyiletrpvalvalaspleuthrargleuglu290295300protyralathrglythrserthrlysleuasnglyhissergluleu305310315320lysserserserserserthrmetproleuglnasnaspserglyser325330335argalaasnileglyargleuservalleuglnasnsergluasnasn340345350ilelysserserthrglyargleuservalserglnasnseraspser355360365alaleulysgluthrlysserthrthrserserglyleuvalproval370375380thrproglnargalaglyasnglyserserthrlysthrvalglyasn385390395400serthrphealaserserglythrasnleulysargglyserleulys405410415serasnasnserserserleuglnasnpheserlysileaspvalval420425430provalileileproargthrserserglyprogluleualathrasp435440445serargseraspalaalaaspvalglyprovalleuserlyssergly450455460argargilegluilealaasnaspserarglysgluserseraspval465470475480alaalaalavalvalproargthrasnserargthrglumetalaser485490495asp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