本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)和分子、細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種用于分離滋養(yǎng)層細(xì)胞的核酸適配體、利用該核酸適配體分離滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法以及利用上述方法分離獲得的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行染色體拷貝數(shù)變異分析的方法。
背景技術(shù):
:獲取衍生自胎兒的細(xì)胞可以獲得有關(guān)胎兒的遺傳信息,利用這些遺傳信息便可以進(jìn)行人類(lèi)胎兒基因水平拷貝數(shù)異常的分析。長(zhǎng)期以來(lái),利用有創(chuàng)的方法是進(jìn)行染色體拷貝數(shù)異常如13號(hào)染色體、18號(hào)染色體、21號(hào)染色體的三體性的金標(biāo)準(zhǔn)。然而,這些方法不僅會(huì)對(duì)目標(biāo)人群的心理造成影響,還存在一定程度的風(fēng)險(xiǎn)。常用手段如羊膜穿刺術(shù):專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員將針頭插入胎兒羊膜囊,取羊水20-30ml,然后對(duì)其中的胎兒細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn),通常在妊娠16周進(jìn)行;絨毛膜取樣:專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員獲取胎盤(pán)的少量生物活檢樣本并進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)分析,通常在8-12周進(jìn)行。傳統(tǒng)無(wú)創(chuàng)的方法有超聲檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)等,這些方法雖對(duì)胎兒無(wú)潛在危害,但靈敏度和特異性較差,例如利用血清學(xué)方法進(jìn)行21號(hào)染色體三體性檢查的統(tǒng)計(jì)表明,約有1/10的懷孕婦女屬于高風(fēng)險(xiǎn)人群,而通過(guò)其他手段確定的真實(shí)拷貝數(shù)異常的比例通常只有其中的1%-2%。近年來(lái),隨著以高通量、自動(dòng)化為顯著特征的二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,基于該技術(shù)的胎兒無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)迅速得以開(kāi)展并取得了顯著的成效。該技術(shù)以母體外周血中穩(wěn)定存在約5%-15%的胎兒來(lái)源的游離dna的理論為基礎(chǔ),從樣品中抽提純化獲得血漿游離dna模板后,可輕易實(shí)現(xiàn)同時(shí)針對(duì)百萬(wàn)級(jí)以上單分子多拷貝pcr克隆陣列的檢測(cè),準(zhǔn)確率雖比較高,但對(duì)設(shè)備和技術(shù)專(zhuān)業(yè)性要求極高、耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)、受親本來(lái)源的dna干擾較大、價(jià)格高昂,并且對(duì)目標(biāo)核酸染色體異常的檢測(cè)范圍較狹窄,目前仍難以大規(guī)模推廣。研究證實(shí),在早孕期5-8周,包蛻膜和真蛻膜尚未融合時(shí),一定比例的滋養(yǎng)細(xì)胞會(huì)穿過(guò)包蛻膜到達(dá)子宮腔,部分脫落到子宮下段,或者通過(guò)絨毛退化并脫落至子宮下段或?qū)m頸處,并逐漸積聚。所以若使用一種微創(chuàng)或無(wú)創(chuàng)的方法采集此處細(xì)胞,并有效分離其中的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞,便可直接獲得胎兒的基因信息從而判斷拷貝數(shù)的異常情況,這無(wú)疑是一種極具吸引力的方法。子宮頸存在的胎盤(pán)脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞可通過(guò)以下方案獲得:吸引術(shù)、細(xì)胞刷(或拭子)、子宮頸內(nèi)灌洗等方式回收滋養(yǎng)層。未經(jīng)純化的子宮頸細(xì)胞受母體細(xì)胞干擾的風(fēng)險(xiǎn)較大,需要先進(jìn)行胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離,方案主要有組織塊培養(yǎng)法和密度梯度離心法,文獻(xiàn)(胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞分離培養(yǎng)研究進(jìn)展。動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33(3):97-100)和(人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離和鑒定。中國(guó)婦幼保健,2008,23(18):2567-2569)等對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行了比較詳細(xì)的描述和論證。近年發(fā)展的基于免疫磁珠法的技術(shù)將滋養(yǎng)層細(xì)胞的純化效果不斷提升(fetalgenomeprofilingat5weeksofgestationafternoninvasiveisolationoftrophoblastcellsfromtheendocervicalcanal,sciencetranslationalmedicine,2016,363(8):1-8;trophoblastretrievalandisolationfromthecervix(tric)fornoninvasiveprenatalscreeningat5to20weeksofgestation.fertilityandsterility,2014,102(1):135-142)。因此,利用滋養(yǎng)層細(xì)胞中的核酸為樣本進(jìn)行早期胚胎的拷貝數(shù)變異分析是理想的選擇。然而,由于采集到的樣本中存在大量的親本細(xì)胞,目標(biāo)滋養(yǎng)層細(xì)胞所占的比例僅約1/2000,含量比例偏低嚴(yán)重制約對(duì)于目標(biāo)滋養(yǎng)層細(xì)胞的基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè),并且特異性難以控制,通過(guò)常規(guī)的分離手段很難達(dá)到目的。滋養(yǎng)層細(xì)胞中共23條染色體,與親本細(xì)胞一致。但其中21染色體、18染色體、13染色體、16染色體容易發(fā)生變異,出現(xiàn)拷貝數(shù)異常的情況。公開(kāi)文件cn101358241(一種用有核紅細(xì)胞進(jìn)行唐氏綜合征產(chǎn)前基因篩查的方法和試劑盒)及公開(kāi)文件cn104846103(多重?cái)?shù)字pcr技術(shù)在染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用)等資料分別采用一定的技術(shù)手段對(duì)目標(biāo)染色體的異常進(jìn)行檢測(cè)分析。所采用的拷貝數(shù)檢測(cè)手段為波動(dòng)性非常差的熒光定量pcr技術(shù),并且通過(guò)引入大量的引物和探針進(jìn)行多重pcr導(dǎo)致系統(tǒng)誤差的風(fēng)險(xiǎn)增加,干擾檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。數(shù)字pcr技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)于目標(biāo)基因或序列的絕對(duì)定量,在拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量方面具有極大的優(yōu)勢(shì)。然而數(shù)字pcr對(duì)于引物和探針設(shè)計(jì)方面的要求較高,不合格的引物和探針序列對(duì)于數(shù)字pcr擴(kuò)增效率影響較大,通過(guò)常規(guī)的引物探針難以準(zhǔn)確評(píng)定滋養(yǎng)層細(xì)胞的拷貝數(shù)變異。綜上可知,目前對(duì)于滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離存在操作復(fù)雜、效率較低、純化效果較差等問(wèn)題,因此嚴(yán)重影響了對(duì)染色體拷貝數(shù)變異進(jìn)行分析的高效性和準(zhǔn)確性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種從極低比例樣本中分離胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法,并針對(duì)易發(fā)生拷貝數(shù)變異的染色體設(shè)計(jì)引物、探針,同時(shí)在不發(fā)生拷貝數(shù)變異的染色體上設(shè)計(jì)參照基因,然后利用數(shù)字pcr技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)染色體拷貝數(shù)的檢測(cè),通過(guò)兩者的比值范圍確定拷貝數(shù)變異特征。具體地,先從宮頸脫落細(xì)胞中分離和純化胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞,以滋養(yǎng)層細(xì)胞為起始樣本提取胎兒來(lái)源的核酸,并利用數(shù)字pcr技術(shù)對(duì)目標(biāo)易變?nèi)旧w上某特定單拷貝基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量,同時(shí)選擇一條參比染色體對(duì)某特定單拷貝基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量,然后通過(guò)分析兩者比值來(lái)確定目標(biāo)易變?nèi)旧w的拷貝數(shù)變異特征。與傳統(tǒng)方法相比,本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便高效、快速準(zhǔn)確。為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明首先提供了一種用于分離滋養(yǎng)層細(xì)胞的核酸適配體,所述核酸適配體為一段能夠與細(xì)胞表面蛋白特異性結(jié)合的cdna序列,一端標(biāo)記有特定的生物大分子,其采用seqidno:1所示的核苷酸序列,具體序列為:5’-ctcctatgactgtaaccacgcgtgtcgcctacgtacgaacacttacctcgcacgtctggccaggcgtgtcccgtgcgtgcgcataggttg-3’在上述核酸適配體的5’端結(jié)合生物大分子作為標(biāo)記物,所述生物大分子標(biāo)記物能夠與另一種生物大分子特異性結(jié)合,具體地,所述生物大分子標(biāo)記物為生物素、藻紅蛋白等,而另一種生物大分子則為鏈霉親和素、生物素抗體或藻紅蛋白抗體等,其中生物素需要與鏈霉親和素或生物素抗體特異性搭配,藻紅蛋白需要與藻紅蛋白抗體特異性搭配,或者其它能夠特異性搭配的生物大分子組合。其次,本發(fā)明還提供了利用上述核酸適配體分離滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法,包括如下步驟:(1)在上述核酸適配體的5’端結(jié)合生物大分子作為標(biāo)記物;(2)在免疫磁珠上偶聯(lián)與步驟(1)中的生物大分子能夠特異性搭配的另一生物大分子;(3)在步驟(2)的磁珠中加入步驟(1)的核酸適配體進(jìn)行孵育,得到結(jié)合核酸適配體的磁珠,待用;(4)采集來(lái)源于哺乳動(dòng)物胎盤(pán)的宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞,適當(dāng)處理后制成單細(xì)胞懸液;(5)將步驟(3)中獲得的磁珠加入到步驟(4)所述的單細(xì)胞懸液中孵育;(6)在步驟(5)洗滌后的單細(xì)胞懸液中加入dnaseⅰ進(jìn)行處理,用以消化核酸適配體,切斷磁珠與細(xì)胞的連接,磁分離后收集上清細(xì)胞,即得分離富集后的目標(biāo)滋養(yǎng)層細(xì)胞。采用該方法能夠從大量親本細(xì)胞樣本中分離出極少量的滋養(yǎng)層細(xì)胞用于后續(xù)分析,所述親本細(xì)胞為來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的宮頸上皮細(xì)胞和宮頸中的其它細(xì)胞,所述滋養(yǎng)層細(xì)胞為來(lái)源于胚胎脫落至宮頸的目標(biāo)細(xì)胞。其中步驟(2)所述免疫磁珠為能夠與另一生物大分子相互偶聯(lián)的具有磁性的顆粒,能夠適用于細(xì)胞的分選,具體地,所述免疫磁珠為鏈霉親和素磁珠、抗生物素磁珠、抗藻紅蛋白磁珠等。步驟(4)中的滋養(yǎng)層細(xì)胞為采集自哺乳動(dòng)物的宮頸細(xì)胞樣本,所述哺乳動(dòng)物為人、小鼠等,優(yōu)選的哺乳動(dòng)物為人;所述宮頸細(xì)胞樣本的采集方法包括吸引術(shù)、細(xì)胞刷、棉花拭子、子宮頸內(nèi)灌洗等;所述單細(xì)胞懸液的處理方法為多次輕柔吹打,短暫離心去除組織碎片后收集上清。具體地,上述免疫磁珠法分離富集滋養(yǎng)層細(xì)胞的流程為:向50μl偶聯(lián)有與所標(biāo)記的適配體能夠特異性搭配的生物大分子的磁珠中加入上述帶標(biāo)記的核酸適配體,室溫孵育5-30分鐘,用pbe溶液洗滌磁珠3次,重懸于50μlpbe溶液。將結(jié)合核酸適配體的磁珠加入到步驟(4)所述單細(xì)胞懸液,室溫孵育5-30分鐘,標(biāo)記后的單細(xì)胞懸液用pbe溶液洗滌3次,細(xì)胞重懸于1mlpbe溶液中,加入磁珠用pbe溶液洗滌3次,重懸于100μlpbe溶液中,然后用dnasei溶液室溫處理5-20分鐘用以消化cdna核酸適配體,切斷磁珠與細(xì)胞的連接,去除磁珠后收集溶液即為富集的目標(biāo)細(xì)胞。所述pbe溶液的成分為:2.5mmedta,0.5%bsa,135mmnacl,4.7mmkcl,10mmna2hpo4,2mmnah2po4,ph7.4。所述dnasei溶液的成分為10mmtris-hcl(ph7.5),2.5mmmgcl2,0.1mmcacl2,1udnasei。此外,本發(fā)明還提供了利用上述分離獲得的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行染色體拷貝數(shù)變異分析的方法,其包括如下步驟:(a)采集來(lái)源于哺乳動(dòng)物胎盤(pán)的宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞,利用核酸適配體-免疫磁珠法進(jìn)行分離富集,得到純化的胚胎來(lái)源的滋養(yǎng)層細(xì)胞;(b)獲取滋養(yǎng)層細(xì)胞的dna作為分析的起始模板;(c)選擇一條易發(fā)生拷貝數(shù)變異的染色體為目標(biāo)染色體,選擇一條穩(wěn)定的染色體為參比染色體,各自分別選擇一段特定單拷貝dna序列,保證選擇的特定序列只存在于目標(biāo)染色體和參比染色體上,并針對(duì)該序列分別設(shè)計(jì)引物和探針;(d)分別對(duì)目標(biāo)染色體上序列的拷貝數(shù)以及參比染色體上序列的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè);(e)數(shù)據(jù)分析與目標(biāo)染色體的拷貝數(shù)變異判別。上述步驟(b)dna模板的獲取即滋養(yǎng)層細(xì)胞dna的提取,方法包括酚-氯仿法、柱純化法、磁珠法等。上述步驟(c)中的易發(fā)生拷貝數(shù)變異的染色體為在胚胎中容易發(fā)生拷貝數(shù)異常的染色體,所述拷貝數(shù)異常是由染色體上基因組dna發(fā)生重排引起的基因組大片段增加或減少。所述目標(biāo)染色體和參比染色體上的基因序列的篩選原則為僅特定染色體上存在的單拷貝基因。對(duì)于本發(fā)明而言,優(yōu)選哺乳動(dòng)物為人,此時(shí)所述目標(biāo)染色體為21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體。本發(fā)明還提供了一組用于檢測(cè)人21號(hào)、18號(hào)、13號(hào)染色體拷貝數(shù)異常的特異性引物和探針,同時(shí)提供一條穩(wěn)定的參比染色體的特異性引物和探針,所述參比染色體用于校正目標(biāo)染色體的拷貝數(shù),來(lái)去除步驟(b)所述提取方法獲得的核酸模板初始濃度的差異。所述引物和探針的核苷酸序列如下:21號(hào)染色體上游引物采用seqidno:2所示的核苷酸序列,具體是:gatgtttcgccaacttctgagc21號(hào)染色體下游引物采用seqidno:3所示的核苷酸序列,具體是:cacagagctatggcacaaacct21號(hào)染色體探針采用seqidno:4所示的核苷酸序列,具體是:cctttcccaaactctcctgccctg18號(hào)染色體上游引物采用seqidno:5所示的核苷酸序列,具體是:ccccagctggtacttggaag18號(hào)染色體下游引物采用seqidno:6所示的核苷酸序列,具體是:ctgtcgtatgtggagccaaca18號(hào)染色體探針采用seqidno:7所示的核苷酸序列,具體是:ctcagtgcctgcctggttccc13號(hào)染色體上游引物采用seqidno:8所示的核苷酸序列,具體是:ctcacctatccacaatgcaatgc13號(hào)染色體下游引物采用seqidno:9所示的核苷酸序列,具體是:ccaatgggattcaagcgaattaaca13號(hào)染色體探針采用seqidno:10所示的核苷酸序列,具體是:cccatgatgcacctctgcttgct參比染色體上游引物采用seqidno:11所示的核苷酸序列,具體是:ctccatagctctccccactca參比染色體下游引物采用seqidno:12所示的核苷酸序列,具體是:gttcggctttcaccagtctgt參比染色體探針采用seqidno:13所示的核苷酸序列,具體是:tgttgagcatcatcttccacatggcag上述引物和探針的衍生序列也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi),所述衍生序列包括引物序列的互補(bǔ)鏈序列,也包括向兩端移動(dòng)一至數(shù)個(gè)堿基得到的序列。優(yōu)選地,所述目標(biāo)染色體探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為fam,熒光淬滅基團(tuán)為bhq;所述參比染色體探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為vic,熒光淬滅采用mgb方式。三種目標(biāo)染色體基因探針的熒光染料標(biāo)記類(lèi)型均為fam標(biāo)記,參比染色體基因探針的熒光染料為vic標(biāo)記。檢測(cè)時(shí)一種目標(biāo)染色體序列的引物/探針與參比染色體序列的引物/探針為一組進(jìn)行雙重pcr擴(kuò)增,在一次反應(yīng)中檢測(cè)目標(biāo)和參比基因的拷貝數(shù)。上述步驟(d)中的拷貝數(shù)檢測(cè)是指利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因序列準(zhǔn)確拷貝數(shù)定量的方法,如數(shù)字pcr技術(shù)、熒光定量pcr技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)等,優(yōu)選地,拷貝數(shù)定量的方法為數(shù)字pcr技術(shù)。所述拷貝數(shù)檢測(cè)采用一種目標(biāo)染色體和參比染色體同時(shí)檢測(cè)的方式,如步驟(c)所述目標(biāo)染色體采用fam作為熒光報(bào)告基團(tuán),參比染色體采用vic作為熒光報(bào)告基團(tuán)。本發(fā)明所公開(kāi)的3種目標(biāo)染色體的拷貝數(shù)變異需要通過(guò)3次試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)實(shí)施例中優(yōu)選的quantstudio3ddigitalpcrsystem(appliedbiosystems),其主要操作流程為:將dna模板、引物/探針、pcr反應(yīng)緩沖液混勻后均勻刷在特制數(shù)字pcr芯片上,然后將芯片放在數(shù)字pcr擴(kuò)增儀上完成擴(kuò)增步驟,最后將擴(kuò)增后的芯片放入數(shù)字pcr閱讀儀上讀取各拷貝數(shù)的數(shù)據(jù)。上述步驟(e)中的數(shù)據(jù)分析是指將步驟(d)所測(cè)得的目標(biāo)染色體序列的拷貝數(shù)(記為a)與參比染色體序列的拷貝數(shù)(記為b)進(jìn)行對(duì)比。具體判別方法是:設(shè)置a/b的比值為s,當(dāng)s=1±0.05(考慮到儀器檢測(cè)本身的小范圍波動(dòng)性,將誤差設(shè)置為±0.05,下同)時(shí),則表明所檢測(cè)目標(biāo)染色體無(wú)拷貝數(shù)異常;當(dāng)s>1.05時(shí),則表明所檢測(cè)目標(biāo)染色體存在拷貝數(shù)異常;當(dāng)s<0.95時(shí),表明實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果異常。綜上,與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明取得的有益效果:1)本發(fā)明將核酸適配體作為中間體來(lái)特異性結(jié)合滋養(yǎng)層細(xì)胞,利用免疫磁珠法的優(yōu)勢(shì),提高對(duì)低濃度滋養(yǎng)層細(xì)胞的捕獲效率,極大縮短樣本的處理時(shí)間;2)本發(fā)明利用富集的滋養(yǎng)層細(xì)胞為樣本,通過(guò)其dna進(jìn)行目標(biāo)染色體拷貝數(shù)變異的分析,其優(yōu)勢(shì)在于:滋養(yǎng)層細(xì)胞為容易獲取的早期胚胎細(xì)胞,針對(duì)胚胎細(xì)胞核酸的拷貝數(shù)分析直接反應(yīng)胚胎狀況;3)本發(fā)明提供的一組21、18、13染色體特異性引物和探針與數(shù)字pcr系統(tǒng)相匹配,提高對(duì)拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的流程示意圖;圖2為免疫磁珠分離得到滋養(yǎng)層細(xì)胞的圖示;圖3為提取所得dna樣本的電泳圖;圖4為數(shù)字pcr測(cè)定結(jié)果的原始點(diǎn)分布圖。具體實(shí)施方式為更好地明確本發(fā)明的具體流程,下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例和附圖,以體外培養(yǎng)的人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞(htr-8)為目標(biāo)細(xì)胞,以體外培養(yǎng)的人子宮頸上皮細(xì)胞(humancervix)為背景細(xì)胞,分別檢測(cè)人類(lèi)21號(hào)、18號(hào)和13號(hào)三條目標(biāo)染色體,并進(jìn)行拷貝數(shù)異常的檢測(cè)和分析,詳細(xì)對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅為說(shuō)明性驗(yàn)證,并非限制性條件。實(shí)施例1免疫磁珠法分離富集str-8細(xì)胞的提取流程本發(fā)明的實(shí)施例涉及的免疫磁珠法進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞分離和富集主要包括兩種,即常規(guī)基于抗體的免疫磁珠法和本發(fā)明基于核酸適配體的免疫磁珠法。1.常規(guī)的細(xì)胞分離方法基于美天旎(德國(guó)miltenyibiotecgmbh)anti-biotin磁珠(貨號(hào):130-090-485)和ms細(xì)胞分離柱(貨號(hào):130-042-401)的經(jīng)典免疫磁珠法細(xì)胞分選方案。具體流程為:向制備的單細(xì)胞懸液中加入2μlhla-g抗體,置于4℃孵育10分鐘;用pbs溶液(135mmnacl,4.7mmkcl,10mmna2hpo4,2mmnah2po4,ph7.4)洗滌磁珠3次,每次1ml,300xg離心10分鐘收集細(xì)胞,重懸于80μl上述pbe溶液中;向細(xì)胞懸液中加入20μlanti-biotin磁珠,輕柔吹打混勻后,置于4℃孵育15分鐘;加入1mlpbe溶液輕柔混勻后300xg離心10分鐘收集細(xì)胞,重懸于500μlpbe溶液中;將ms細(xì)胞分離柱置于macs磁分離器上,用500μlpbe潤(rùn)洗ms柱一次,將標(biāo)記磁珠的細(xì)胞懸液通過(guò)ms柱,用500μlpbe溶液洗滌細(xì)胞3次,最后取下ms分離柱加入500μlpbe溶液,用活塞輕輕推出溶液得到純化的細(xì)胞懸液。2.本發(fā)明的細(xì)胞分離方法本發(fā)明采用高特異性的核酸適配體結(jié)合免疫磁珠法進(jìn)行細(xì)胞分選,具體流程為:20μl鏈霉親和素磁珠(海貍生物,貨號(hào):22305)分散于500μlpbe溶液中,加入2μl生物素標(biāo)記的核酸適配體,混勻后室溫孵育10分鐘;用pbe洗滌3次,每次500μl去除殘留核酸適配體,標(biāo)記的磁珠重懸于20μlpbe溶液中;向溶液中加入待分離的單細(xì)胞懸液,混勻后室溫孵育15分鐘,用500μlpbe溶液洗滌細(xì)胞3次,加入100μldnasei溶液(10mmtris-hcl(ph7.5),2.5mmmgcl2,0.1mmcacl2,1udnasei)室溫處理10分鐘,磁分離后收集上清細(xì)胞,加入100μlpbe溶液重懸純化的細(xì)胞用于后續(xù)操作。根據(jù)所述方法的流程和具體的操作統(tǒng)計(jì)結(jié)果,分別測(cè)得兩種方案的耗時(shí),統(tǒng)計(jì)如下表1示。表1常規(guī)的細(xì)胞分離法和本發(fā)明的細(xì)胞分離法的時(shí)間消耗對(duì)比時(shí)間消耗對(duì)比常規(guī)的細(xì)胞分離法本發(fā)明的細(xì)胞分離法磁珠與標(biāo)記物結(jié)合—10min細(xì)胞與標(biāo)記物結(jié)合10min—游離中間體的洗滌46min6min細(xì)胞捕獲15min15min背景細(xì)胞去除20min6min細(xì)胞與磁珠分離—12min總時(shí)間91min49min對(duì)上表進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明核酸適配體進(jìn)行免疫磁珠法分離細(xì)胞大大縮短了游離中間體洗滌以及背景細(xì)胞去除的時(shí)間,使得耗時(shí)較常規(guī)的方法減少了一半,因此,本發(fā)明的方法大大提高了操作效率。實(shí)施例2核酸適配體對(duì)于htr-8細(xì)胞的特異性參考文獻(xiàn)developmentofcoldswitchablednaaptamersforisolationofcellsthatexpressleukemiainhibitoryfactorreceptor利用cell-selex的方法進(jìn)行htr-8核酸適配體的篩選,流程如下:1、設(shè)計(jì)隨機(jī)核酸文庫(kù),用結(jié)合緩沖液(0.45%葡萄糖,5mmmgcl2,0.1mg/ml鮭魚(yú)精,pbs),95℃震蕩5min,迅速冷卻,然后混入htr-8細(xì)胞中冰上孵育1h;2、洗滌緩沖液(0.45%葡萄糖,5mmmgcl2,pbs)沖洗細(xì)胞一次,刮取少量細(xì)胞于無(wú)菌水中,沸水加熱10min,13000xg離心5min取上清,獲得特異性核酸適配體文庫(kù);3、取50μl核酸適配體文庫(kù)進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增,引物為上游:ctcctctgactgtaaccacg;下游:ggcttctggactacctatgc;擴(kuò)增條件為:98℃5min,98℃15s、56℃20s、72℃10s35個(gè)循環(huán),72℃1min,然后用生物素標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物;4、用鏈霉親和素磁珠固定上述生物素標(biāo)記的dna雙鏈,pbs洗滌2次后,用200mmnaoh解離雙鏈dna,收集洗脫液,然后用除鹽柱脫鹽,收集dna單鏈文庫(kù);5、將單鏈文庫(kù)與非靶細(xì)胞(如cervix細(xì)胞)在冰上孵育1h,收集上清;6、將得到的上清代替步驟3中的適配體文庫(kù),然后重復(fù)4-5操作,得到特異性的核酸適配體單鏈文庫(kù);7、將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物代替步驟4的文庫(kù),重復(fù)5-6操作,得到特異性極高的適配體文庫(kù);8、將得到的產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序分析,得到富集程度最高的一條cdna序列信息,合成cdna序列并在5’端進(jìn)行生物素修飾。本發(fā)明公開(kāi)的htr-8核酸適配體cdna序列為:ctcctatgactgtaaccacgcgtgtcgcctacgtacgaacacttacctcgcacgtctggccaggcgtgtcccgtgcgtgcgcataggttg本實(shí)施例中共選擇5種細(xì)胞系進(jìn)行特異性測(cè)試,包括宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞系(htr-8)、人絨毛膜癌細(xì)胞系(jeg-3)、人腎上皮細(xì)胞系(hek-293)、人宮頸上皮細(xì)胞系(cervix)、宮頸癌細(xì)胞系(hela),測(cè)試時(shí)投入的細(xì)胞總數(shù)量分為兩組,第一組投入2000個(gè)細(xì)胞,第二組投入4×106個(gè)細(xì)胞,均懸浮于500μlpbe溶液中,細(xì)胞分選的流程參照實(shí)施例1中本發(fā)明的細(xì)胞分離方法進(jìn)行,同時(shí)對(duì)回收細(xì)胞和上清中殘留的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì),基于本發(fā)明方法分離的htr-8細(xì)胞如附圖2所示,其中編號(hào)1為用于滋養(yǎng)層細(xì)胞捕獲的免疫磁珠,編號(hào)2為捕獲得到的滋養(yǎng)層細(xì)胞。測(cè)試結(jié)果如下表所示:表2利用本發(fā)明的核酸適配體進(jìn)行htr-8細(xì)胞分選的特異性測(cè)試結(jié)果結(jié)果顯示,本發(fā)明的核酸適配體對(duì)于宮頸滋養(yǎng)層htr-8細(xì)胞具有極強(qiáng)的特異性,對(duì)于目標(biāo)樣本的背景細(xì)胞cervix具有很低的非特異性結(jié)合,對(duì)于另外幾種常用細(xì)胞也具有很低的非特異性。從而有力的證明了本發(fā)明的核酸適配體對(duì)于極低濃度的目標(biāo)細(xì)胞依然保持高效的特異性吸附作用。實(shí)施例3兩種滋養(yǎng)層細(xì)胞分離方法的捕獲效率對(duì)比以2000個(gè)htr-8細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞,以4×106個(gè)cervix細(xì)胞作為背景細(xì)胞,保持兩者的比例為1:2000混合用于模擬真實(shí)樣本中滋養(yǎng)層細(xì)胞的含量狀況,重懸于500μlpbe溶液中,細(xì)胞分選的流程參照實(shí)施例1中常規(guī)細(xì)胞分離的流程和本發(fā)明的細(xì)胞分離方法同時(shí)進(jìn)行,并對(duì)回收細(xì)胞和上清中殘留的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì),重復(fù)3次,測(cè)試結(jié)果如下表所示:表3常規(guī)的細(xì)胞分離法與本發(fā)明的細(xì)胞分離法進(jìn)行htr-8細(xì)胞分選的對(duì)比結(jié)果顯示,利用本發(fā)明的核酸適配體進(jìn)行htr-8細(xì)胞的分選和富集作用效果非常好,對(duì)于低至1:2000的目標(biāo)細(xì)胞的分選回收效率高、非特異性低(即結(jié)合雜細(xì)胞的性能低)、穩(wěn)定性強(qiáng)。而對(duì)應(yīng)的常規(guī)分離方法明顯非特異性極度嚴(yán)重,并且捕獲效率也難以確定,在本優(yōu)選實(shí)施例的條件下利用本發(fā)明的方法具有顯著的優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例4htr-8細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用于拷貝數(shù)異常陽(yáng)性樣本的模擬根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的三組目標(biāo)染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)的引物/探針序列,其所對(duì)應(yīng)的21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體上的目標(biāo)序列信息為:21號(hào)染色體序列:gctagcctcacctatccacaatgcaatgccgttcccatgatgcacctctgcttgctgtttacctgtatgttaattcgcttgaatcccatttctaga18號(hào)染色體序列:gctagcccccagctggtacttggaagagattctgcattactacacctcagtgcctgcctggttcccttcggaaactgttggctccacatacgacagtctaga13號(hào)染色體序列:gctagcgatgtttcgccaacttctgagccccacccttcccaaaacactcctttcccaaactctcctgccctgaatgcaggtttgtgccatagctctgtgtctaga以常用的pcdna3.1為載體分別對(duì)以上3條序列合成質(zhì)粒,用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染htr-8細(xì)胞,由于上述序列與目標(biāo)染色體上對(duì)應(yīng)的待檢測(cè)序列一致,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞即相當(dāng)于增加目標(biāo)序列的拷貝數(shù),用來(lái)模擬21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體拷貝數(shù)變異的樣本。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染利用thermo公司的3000transfectionreagent(貨號(hào):l3000001)進(jìn)行,具體流程為:htr-8細(xì)胞接種培養(yǎng)至約80%,用dmem培養(yǎng)基分別稀釋上述質(zhì)粒和lipo3000,然后按照1:1混合,室溫孵育5min,將復(fù)合體加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,37℃繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2天,收集細(xì)胞備用。每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3個(gè)孔,同時(shí)設(shè)置3個(gè)孔為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。實(shí)施例5正常組htr-8細(xì)胞樣本與拷貝數(shù)異常細(xì)胞樣本的分離與富集將實(shí)施例4中的3個(gè)對(duì)照組樣本和3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的9個(gè)樣本(各3個(gè)平行)制備成單細(xì)胞懸液,分別取細(xì)胞2000個(gè),每組混入4×106個(gè)cervix細(xì)胞作為背景細(xì)胞,全部12個(gè)組均重懸于500μlpbe溶液中,細(xì)胞分選的流程參照實(shí)施例1中本發(fā)明的細(xì)胞分離方法同時(shí)進(jìn)行,并對(duì)回收細(xì)胞和上清中殘留的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì),測(cè)試結(jié)果如下表所示:表4目標(biāo)染色體拷貝數(shù)異常htr-8細(xì)胞分選的效果結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后的htr-8細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞按照本發(fā)明的方法進(jìn)行分離富集并不會(huì)受影響,三種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組均能夠保持較高和較穩(wěn)定的結(jié)果,非特異性程度很低,回收效率無(wú)明顯差異。實(shí)施例6細(xì)胞核酸的抽提與純化本實(shí)施例采用商業(yè)化試劑盒的提取方法,具體參考thermo公司的magmaxtm-96dnamulti-samplekit(貨號(hào):4413021)的方法,流程如下:實(shí)施例5所分離得到12個(gè)樣本的宮頸滋養(yǎng)層htr-8細(xì)胞樣品同時(shí)進(jìn)行基因組dna提取,加入500μl試劑盒中的dna裂解液,渦旋20s混勻至細(xì)胞完全解離;加入400μl異丙醇,thermo-mix上室溫低速搖震3min,加入20μl試劑盒內(nèi)的dna結(jié)合液,再次于thermo-mix上室溫低速搖震3min;磁場(chǎng)分離5min至溶液變澄清,吸除上清;用300μl試劑盒內(nèi)的洗滌液1洗滌1次,磁場(chǎng)分離吸除上清;用300μl試劑盒內(nèi)的洗滌液2洗滌1次,磁場(chǎng)分離吸除上清;磁珠置于磁力架上室溫放置晾干3min,加入50μl試劑盒內(nèi)的dna洗脫液,輕柔渦旋混勻20s,置于70℃加熱5min,磁場(chǎng)分離5min,吸取上清液。利用qubit3.0測(cè)定提取核酸的濃度如下表所示,電泳圖如附圖3所示,電泳得到的dna片段與基因組dna相吻合,表明按照實(shí)施例1所述本發(fā)明的分離步驟能夠成功分離富集得到目標(biāo)細(xì)胞。表5提取所得dna樣本濃度測(cè)定值實(shí)施例7特定基因序列的拷貝數(shù)測(cè)定(1)引物/探針設(shè)計(jì)分別選取21號(hào)、18號(hào)以及13號(hào)染色體上一段保守的單拷貝序列為靶目標(biāo),應(yīng)用primer5、oligo7對(duì)靶目標(biāo)設(shè)計(jì)引物和探針序列,利用primerbank進(jìn)行調(diào)整,探針采用taqman形式。作為本發(fā)明的核心內(nèi)容,一組檢測(cè)21號(hào)、18號(hào)以及13號(hào)染色體拷貝數(shù)變異的引物探針,以及共同的參比序列信息如下:21號(hào)染色體上游引物采用seqidno:2所示的核苷酸序列,具體是:gatgtttcgccaacttctgagc21號(hào)染色體下游引物采用seqidno:3所示的核苷酸序列,具體是:cacagagctatggcacaaacct21號(hào)染色體探針采用seqidno:4所示的核苷酸序列,具體是:cctttcccaaactctcctgccctg18號(hào)染色體上游引物采用seqidno:5所示的核苷酸序列,具體是:ccccagctggtacttggaag18號(hào)染色體下游引物采用seqidno:6所示的核苷酸序列,具體是:ctgtcgtatgtggagccaaca18號(hào)染色體探針采用seqidno:7所示的核苷酸序列,具體是:ctcagtgcctgcctggttccc13號(hào)染色體上游引物采用seqidno:8所示的核苷酸序列,具體是:ctcacctatccacaatgcaatgc13號(hào)染色體下游引物采用seqidno:9所示的核苷酸序列,具體是:ccaatgggattcaagcgaattaaca13號(hào)染色體探針采用seqidno:10所示的核苷酸序列,具體是:cccatgatgcacctctgcttgct參比染色體上游引物采用seqidno:11所示的核苷酸序列,具體是:ctccatagctctccccactca參比染色體下游引物采用seqidno:12所示的核苷酸序列,具體是:gttcggctttcaccagtctgt參比染色體探針采用seqidno:13所示的核苷酸序列,具體是:tgttgagcatcatcttccacatggcag三種目標(biāo)染色體基因探針的熒光染料標(biāo)記類(lèi)型均為fam標(biāo)記,參比染色體基因探針的熒光染料為vic標(biāo)記。檢測(cè)時(shí)一種目標(biāo)染色體序列的引物/探針與參比染色體序列的引物/探針為一組進(jìn)行雙重pcr擴(kuò)增,在一次反應(yīng)中檢測(cè)目標(biāo)和參比基因的拷貝數(shù)。(2)數(shù)字pcr檢測(cè)利用實(shí)施例6純化得到的核酸樣品為模板,對(duì)于以上三種目標(biāo)染色體分別進(jìn)行數(shù)字pcr定量,采樣appliedbiosystems所產(chǎn)的quantstudio3ddigitalpcrsystem進(jìn)行數(shù)字pcr檢測(cè),參考其標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行,三者的數(shù)字pcr擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序分別如下表6—表9所示。表621號(hào)染色體擴(kuò)增反應(yīng)混合液體系表718染色體擴(kuò)增反應(yīng)混合液體系表813染色體擴(kuò)增反應(yīng)混合液體系表9擴(kuò)增反應(yīng)程序?qū)嵤├?數(shù)據(jù)分析與結(jié)果判別所述實(shí)施例7芯片經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后,在quantstudio3ddigitalpcr芯片讀取儀上讀數(shù),芯片原始結(jié)果如附圖4所示,其中中線的左上部分為fam信號(hào)的特征峰分布,右下部分為vic信號(hào)的特征峰分布情況,左下部分為背景信號(hào),右上部分為集中出現(xiàn)fam和vic信號(hào)的區(qū)域,拷貝數(shù)結(jié)果與樣本信息如下表10所示,結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為:當(dāng)fam/vic的比值(即a/b記為s)=1±0.05范圍內(nèi)時(shí),表明目標(biāo)單拷貝序列與參比單拷貝序列的拷貝數(shù)一致(考慮儀器檢測(cè)本身變異系數(shù)經(jīng)檢測(cè)約5%),則判定為所檢測(cè)目標(biāo)染色體拷貝數(shù)正常;當(dāng)s>1.05時(shí),表明目標(biāo)染色體單拷貝序列比參比染色體單拷貝序列要多,則判定為所檢測(cè)目標(biāo)染色體拷貝數(shù)異常。表10樣本資料和數(shù)字pcr測(cè)定結(jié)果與判定對(duì)表10進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,根據(jù)本申請(qǐng)所述數(shù)字pcr方法對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞檢測(cè)的判定結(jié)果,所測(cè)定結(jié)果與所模擬的拷貝數(shù)異常樣本情況完全一致,表明本方法的有效性。其中,fam和vic為探針上的不同熒光標(biāo)記類(lèi)型,在本實(shí)施例中fam值分別是指21號(hào)、18號(hào)、13號(hào)三次測(cè)定的拷貝數(shù)(均為fam標(biāo)記),vic是指參比染色體在三次檢測(cè)中的拷貝數(shù)(vic標(biāo)記)。本發(fā)明所公開(kāi)的實(shí)施例的上述說(shuō)明,使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明,同時(shí),以上僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明實(shí)施例的精神和原則之內(nèi),所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明實(shí)施例的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12