專利名稱：一種捕獲分泌序列的載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程領(lǐng)域，具體的說是一種捕獲分泌 序列的載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。 冊粉
蛋白質(zhì)為所有生命體系賴以存在的基本支撐之一。在各種細胞蛋白中， 分泌型蛋白(包括細胞膜導(dǎo)向性蛋白和周質(zhì)腔蛋白)為一重要類別。這些 蛋白通常在其一級結(jié)構(gòu)中含有能夠被細胞分泌因子識別的信號，例如經(jīng)典
的I型分泌蛋白，尤其是經(jīng)由Sec途徑而分泌的蛋白，通常在其N端含有 一個由20 - 35個氨基酸組成的信號肽，該信號肽對于其所率引的蛋白的成 功跨膜運輸以及功能性構(gòu)像的形成具有決定性作用?；谄洫毺氐慕Y(jié)構(gòu)與 作用特點，在原核生物中分泌型蛋白通常具有重要生物學(xué)功能，例如對環(huán) 境信號的感知與傳導(dǎo)，與宿主細胞相互作用，群體密度感應(yīng)等，這些獨特 功能使得分泌型蛋白在病原微生物疾病防治中常作為藥物和疫苗靶點，因 而分泌蛋白的系統(tǒng)性篩選對于研究細菌的生命機制、致病機理、病害防治 等具有重要意義。
瓊膠酶是一種天然糖苷水解酶，多由海洋微生物產(chǎn)生，其作用底物為 瓊膠，能夠裂解瓊膠中的1，3 p-D-或1,4 oc-L-galacto-pyranose連接。 雖然近年來各種新型產(chǎn)瓊膠酶菌株不斷被發(fā)現(xiàn)，瓊膠酶基因及蛋白的研究 也曰漸深入，然而真正成功應(yīng)用于工業(yè)或科研領(lǐng)域的瓊膠酶卻極少。目前 瓊膠酶的實際性應(yīng)用主要限于從瓊膠包埋劑中回收DNA或其它分子，其潛 在性應(yīng)用包括用于制備瓊膠衍生寡聚糖等，但將瓊膠酶基因作為一種分子 生物學(xué)工具進行應(yīng)用的研究尚未見報道。
瓊膠酶agaV為保守性I類分泌蛋白，具有典型的Sec-translocon依
賴型分泌蛋白結(jié)構(gòu)特征以及高效的胞間質(zhì)折疊能力，并且其胞外活性檢測 簡單直接，然而，迄今為止國際上尚未有利用瓊膠酶基因捕獲分泌信號的 報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于一種簡單高效的捕獲分泌蛋白基因序列的載體及其構(gòu) 建方法和應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為載體為具有序列表SEQ ID No:2中堿基序列，含有去信號序列的瓊膠酶基因agaK，外源基因插入位點 以及篩選標(biāo)記。 構(gòu)建方法1 )設(shè)計質(zhì)粒pBK:
a. 以質(zhì)粒pACYC177為模板，用分別含有BamHI位點和HincII位點的卡 那霉素基因引物，PCR擴增卡那霉素基因，PCR產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切 酶BamHI和Hindi雙酶切；
其中PCR條件為94°C60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s， 45°C 60s, 72。C 60s， 5個循環(huán)后改為94°C 40s, 58°C 60s， 72°C 60s, 25個循環(huán)后再 在72°C延伸反應(yīng)lOmin;
b. 將質(zhì)粒pBR322用BamHI和Seal酶切，電泳回收3471 bp DNA片段， 將該片段與a步驟中得到酶切處理過的PCR產(chǎn)物連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5oc,在含有卡那霉素LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，篩選出抗卡那霉素的轉(zhuǎn) 化子，從轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒，即為PBK;
2) 設(shè)計質(zhì)粒pUALS:
a.將agaV的操縱子克隆到質(zhì)粒pUC19,構(gòu)成重組質(zhì)粒pBUAl,而后以 質(zhì)粒pBUAl為模板，用分別含有BamHI位點和XhoI位點的引物，進行PCR 擴增，得到去信號序列的agaV的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物純化，而后與載體 PBS - T于室溫連接，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 cx ，在含有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選白色轉(zhuǎn)化子；
其中PCR條件:94。C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s， 46。C 60s, 72。C 60s, 5個循環(huán)后改為94。C 40s， 59。C 60s， 72。C 60s, 25個循環(huán)后再 在72°C延伸反應(yīng)lOmin;
b.從挑取的白色轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒，即為PUALS;
3) 設(shè)計分泌序列捕獲載體
a. 將步驟l)中得到的質(zhì)粒pBK用限制性內(nèi)切酶BamHI和BsaBI酶切， 得到3. 2kbDM片段;將步驟2 )中的質(zhì)粒pUALS用限制性內(nèi)切酶BamHI和 Smal雙酶切，得到1. 3kb DM片段，將其與前3. 2kb DNA片段相連接，連 接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有Kn的LB固體培養(yǎng)基上篩選抗卡那霉 素的轉(zhuǎn)化子；
b. 從抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒，即為分泌序列捕獲載體PBU。 所述步驟1 ) a中的引物為KnF2 5' - ATGGATCCACGGTTGATGAGAGC -3，，
KnR3 5， - GCCGTCGACCAATTAACCAATTC -3，。
所述步驟2 ) a中的引物為UAF5 5， -ATGGATCCGAAGACTGGCGAGAAATC-3， UAR3 5， -CACTCGAGTTGTATAAATTTCAATCGC- 3，。
所述步驟2)得到去信號序列的agaV的PCR產(chǎn)物純化后，與載體pBS -T于室溫連接2-4小時。
所述載體可捕獲原核生物中分泌蛋白基因。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點
l.適用范圍廣。本發(fā)明可用于原核生物信號序列的篩選，尤其是基因 組序列尚未知的微生物。
2. 功能多樣性。本發(fā)明不僅可以從未知基因組中篩選分泌蛋白基因，
而且還可以對假定(putative)分泌信號的驗證、啟動子以及SD (Shine Dalgarno)序列的功能檢測、人工強力信號肽的大規(guī)模篩選等。
3. 簡單高效性。本發(fā)明操作簡單，只需常規(guī)的連接、轉(zhuǎn)化以及顏色篩 選；所捕獲的基因無假陽性，100%具有典型的分泌蛋白基因特征。


圖1為本發(fā)明構(gòu)建捕獲分泌蛋白基因序列載體的流程圖。
圖2本發(fā)明篩選出的代表性S. f/iiae(G26)蛋白信號肽預(yù)測圖。
圖3本發(fā)明篩選出的代表性K. iiarveja' ( T4 )蛋白信號肽預(yù)測圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明 進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
本發(fā)明是利用aga^結(jié)構(gòu)基因作為報告基因，與質(zhì)粒pBR322衍生質(zhì)粒 構(gòu)建成一種分泌信號捕獲載體；在該捕獲載體中，外源DNA可以經(jīng)由一個 BamHI位點而插入到aga7基因的上游；由于缺失信號序列以及啟動子，該 捕獲載體中的agaK基因無法表達，但是如果插入的外源DNA片段中含有一 個在編碼區(qū)斷裂(truncated)的功能基因，并且該斷裂基因的5'編碼區(qū) 與agaK基因連接形成in-frame融合，那么aga7基因便可以融合基因的方 式表達；如果插入的斷裂基因含有分泌信號序列，并且該信號序列能夠為 大腸桿菌的分泌系統(tǒng)所識別，同時融合的異源肽為agaV所容忍，不影響其 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的形成以及功能活性，那么表達后的agaV則可以融合蛋白的形 式被運輸至胞外并具有與野生型類似的、可檢測到的活性。所插入的斷裂 基因序列可經(jīng)由對aga7上游區(qū)測序獲知，隨后運用染色體步移、分子雜交 等方法即可很容易地克隆得到完整的分泌基因。由于Sec分泌系統(tǒng)的保守 性以及I類膜導(dǎo)向蛋白在原核生物中的廣泛存在性，該捕獲載體可以應(yīng)用 于所有原核生物(包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌)分泌信號的篩選， 由此獲得的分泌蛋白可以用于多種目的。
在本發(fā)明實施例中所涉及到的實驗方法均采用如下方法
1. 質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收、細菌基因組DNA 提取皆使用美國Omega Bio-Tek公司的相應(yīng)試劑盒(Plasmid Mini Kit I, Cycle-pure Kit , Gel Extraction Kit, Bacterial DNA Kit)
2. 質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 ) ，
3. 所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"， 北京。
實施例1
分泌信號捕獲載體pBU的構(gòu)建過程(參見圖l)
步驟l)載體pBK的構(gòu)建。
a. 以質(zhì)粒pACYC177 (來自于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北京)為模 板，用下列引物PCR卡那霉素(Kn )基因KnF2 (5 '-ATGGATCCACGGTTGATGAGAGC -3，，劃線堿基為BamHI位點)，KnR3 (5，— GCCGTCGACCAATTAACCAATTC -3，， 劃線堿基為HincII位點)，PCR條件為 94。C 60s預(yù)變性模板腿,然后94。C 40s， 45"C 60s, 72。C 60s, 5個循環(huán) 后改為94"C40s， 58"C60s, 72"C 60s, 25個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)10min。 PCR產(chǎn)物用Omega Cycle-pure試劑盒純化后用限制性內(nèi)切酶BamHI和 HincII雙酶切，然后用用Omega Cycle - pure試劑盒純化。
b. 將質(zhì)粒pBR322 (購自于"上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司"，上海) 用BamHI和Seal酶切，電泳回收3471 bp DNA片段，將該片段與前 BamHI/HincII酶切處理過的PCR產(chǎn)物連接，連接液用Hanahan方法轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5cc，在含Kn ( 50ug/ml )的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基平板上篩 選轉(zhuǎn)化子，用Omega Plasmid Mini Kit提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBK， 該質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和Smal酶切后于0. 8%瓊脂糖凝膠中電泳，電
泳結(jié)果表明酶切產(chǎn)物為兩條帶， 一條大小約為ssobp,另一條為牧b,說明
該質(zhì)粒為正確重組質(zhì)粒。
所述LB組成成分按重量百分比計1. 0%蛋白胨，0. 5%酵母粉，1.0%
氯化鈉。
步驟2)載體pUALS的構(gòu)建。
a.將鰻弧菌中的瓊膠酶agaV的操縱子克隆到質(zhì)粒pUC19 (巿購)，構(gòu) 成重組質(zhì)粒pBUAl,而后以質(zhì)粒pBUAl為模板，用引物UAF5(5，-ATGGATCCGAAGACTGGCGAGAAATC -3，，劃線堿基為BamHI位點)和UAR3(5' -CACTCGAGTTGTATAAATTTCAATCGC-3，, 劃線堿基為Xhol位點)進行PCR擴 增，得到去信號序列的agaV的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用Omega Cycle-pure 試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T ("天根生化科技有限公司"，北京) 于室溫連接2小時，連接混合液用Hanahan方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHScx后在含 有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培 養(yǎng)18小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子。
PCR條件94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94。C40s， 46。C 60s, 72°C 60s， 5個循環(huán)后改為94。C 40s, 59°C 60s, 72('C 60s， 25個循環(huán)后再在72flC延伸 反應(yīng)lOmin。
其中瓊膠酶agaV序列表如下
atgaaatcca taattaaaac tctgacattg ctaccaatat ttttaactag cacgaegtta atggctgaag actggegaga犯tccccatt ccagcaccgt tagaagatgg gcagagctgg gagttacaag aggcatactc cgattcgttt aattataegg gtaagggega ctctttccgt agtaagtgga atgataccta etttcaeggt tggacaggac ctggtttaac ctattggcaa agtgatgagt catgggtaga tgatggcaac ttgataatca gtgcctctcg tegtcaggga acagagatgg tgaatgcggg cgttgtgacg tctaagacaa aggtgaaata tcctattttt
ctagaggcca atataaaggt gagtggctta gagctatcat caaatttttg gcttcttagt gaaaatgatc aacgagaaat cgatgtattg gaagtgtatg gtggcgctga agacgaatgg tttgccaaaa atatgtcaac aaacttccat gta臓cc gcaatgaaga caactcaatt cgtagcgatt tcaacgatca gacccacaat gagccgcaat ggggtactta ttggcgtgat gggttccatc gctttgcggt atattggaaa agcccaactg aagtgacttt ttatatcaat ggcatagaga caccgaaagg ttcttgggaa gacgtcgtaa tgaaagataa agattacacg ggagccatcc tagataaatc aacctacaac atggatcaag agatgttcat tattattgat actgaagacc attcgtggcg ttctgaggct ggaataatcg caaaagatga agacctagct gatgatagta agaacaaaat gtatgtggat tggatacgtg tttataagcc agttggcgga gatgacaatg gtaatgtgac cgtaccgtca gggtatacaa acacacaatt tgtgcatagt gacttgtgtt tggatgtcaa agatggagcg acttggaacg gcagtactta tcagcaatgg gtgtgtaata cgggcaacct gaaccaacga tttgggtttg aagaagtcgc gacgggagag tatttaatta aatccaaacg tagtcagctg tgcttagagc tcaagcccgg tagtaatcaa tggcaggacg gtgcgatcat tcagcaatat gtgtgtaatt cagctgaaga gaatcaacgt tggacgctat ttgataaagg cagccagacg tttgagattc gaagcaaggc aacaggtaag
tgtttagagc ttgctgacaa tcagggaagc aacggcggga cagtgcagca atggtcatgt gatggtggta ataaccagcg attgaaattt atacaataa
b.釆用Omega Plasmid Mini Kit提取白色轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 pUALS，該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI雙酶切后于0. 8%瓊脂糖凝膠中 電泳，電泳結(jié)果表明酶切產(chǎn)物為兩條帶， 一條大小約為1.3kb (agaV插入 片段)，另一條為3kb (pBS-T載體)，說明該質(zhì)粒為正確重組質(zhì)粒。
步驟3 )分泌序列捕獲載體pBU的構(gòu)建。 將步驟1 )的質(zhì)粒pBK用限制性內(nèi)切酶BamHI和BsaBI酶切，在0. 8%瓊脂 糖凝膠中電泳，回收3.2kbDNA片段；將步驟2 )的質(zhì)粒pUALS用限制性內(nèi) 切酶BamHI和Smal酶切，在0. 8%瓊脂糖凝膠中電泳，回收1. 3kb DNA片段， 將其與3. 2kb pBK/BamHI/BsaBI片段連接，連接液用Hanahan方法轉(zhuǎn)化入 大腸桿菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。挑 取2個轉(zhuǎn)化子，用Omega Plasmid Mini Kit提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBU (參 見序列表2)，該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI雙酶切后于Q. 8%瓊脂糖 凝膠中電泳，電泳結(jié)果表明酶切產(chǎn)物為兩條帶， 一條大小約為1.3kb,另一 條為3. 2kb，說明該質(zhì)粒為正確重組質(zhì)粒，pBU全長4577 bp,為雙鏈DNA, pBU特點(主要元件)agaV: l- 1302,KrT: 4577 - 3480, Origin: 2773 -2185。
實施例2
采用捕獲載體pBU從革蘭氏陽性菌海豚鏈球菌(Stre^ococcus iniae) (G26)中篩選分泌序列和分泌蛋白基因。在5ml TSAYE培養(yǎng)基(其成分為 peptone 1. 7%， polyp印tone 0.3%, yeast extract 0. 6%，NaCl 1. 5%， K2HP04 0.327%, glucose 0. 25%，agar 1.5%)中過夜培養(yǎng)^iae菌株G26,用 Omega Bacterial DNA試劑盒提取基因組DNA，將5ug基因組DNA用限制性 內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切后在0. 8%的瓊脂凝膠中電泳，用Omega Gel Extraction試劑盒回收4 - 6kb DNA片段，將4Q0ng回收的DNA與200ng BamHI線性化并經(jīng)小牛堿性磷酸酶(CIP)處理過的質(zhì)粒pBU連接，連接混 合液用Hanahan方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含Kn ( 50ug/m"的LB瓊脂
培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取6個周邊培養(yǎng)基凹陷的轉(zhuǎn)化 子，將挑取的轉(zhuǎn)化子在含Kn(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用Omega PlasmidMini Kit試劑盒提取質(zhì)粒并對其所含插入DNA片段用引物UAR6( 5， -CTCATCACTTTGCCAATAGG-3，)進行測序。測序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析后發(fā) 現(xiàn)所有6個重組質(zhì)粒中都含有一個具信號肽序列的斷裂功能基因如下，其 中信號肽通常由約15 — 35個氨基酸所組成，位于分泌蛋白的N端或C端， 其組成氨基酸多為疏水性和非極性氨基酸，但其N端附近的幾個氨基酸通 常為堿性氨基酸，括號內(nèi)劃線氨基酸為信號肽特征性強堿性氨基酸。
BUG1
(MF^ETETLL^SPNLWVTIIGIALVPALYCLVFLSSMWNPYA) HFNQ FPVAVVNQDKGASLDNKSINVGNEMVDTLSKNKDLDFHFVSEKTAQEK LDAGKYYM1ITFPDWSSKVASVM BUG2
(MGRKKRKRSYOLKKTSSKGFKLTVLSFVLLTLLVSVWSLKKA) RQ YNFFGVKGDYKGKSAVLPTLEDDGQGNLYTVDAKFRSYGKMINSFKD YRLYYFD
捕獲的斷裂功能基因其編碼產(chǎn)物皆為分泌型蛋白如下其中該序列中 大寫部分為分泌信號序列
G26
BUG1:
tttccagttgccgttgtcaatcaagataagggtgctagcttagataataaatccatcaacgtcggaaatgagatggtggacacactgtcaaaaaataaggactt
gga加catttcgtttctgaaaaaacagctcaagaaaaacttgatgctgggaaatactatatgattatcactttcccagataatttttcaagtaaagttgcctctgtg
atgac
BUG2:
caagatttgaaacctttagctgaaacagcctctttatcatttataagaaaaagtgcacattcagcggcagatatagcaagaaaaaatgatctatatacgtcagtg atgcttgcgcaagcaactctagagtcgcaaaatggccaatcccaattgagtcaaaaaccttattataatttctttggggtgaaaggagattacaaaggaaaatc tgctgttttacccactctagaagatgatggtcaagggaatctttatacagttgatgcaaagtttagatcttacggaaaaatgattaattcttttaaagactatgcaac tgtattatcagaccctttgtatgaaaatactcataaagctaaaacaaaacactatcaagaagcaacagcaactttaacgggtcgttatgcaacagacacgtctta tcatgtcaaattaaataatcttattgagacttataggctttattattttgacta
通過檢測可得本發(fā)明構(gòu)建的載體捕獲的分泌序列皆為編碼分泌型蛋白
的序列(參見圖2)。 實施例3
采用捕獲載體PBU從革蘭氏陰性菌哈氏弧菌7. /Mireyi (T4)在5ml TSAYE培養(yǎng)基(其成分為peptone 1. 7%， polypeptone 0. 3%，yeast extract0. 6%,NaCl 1.5%,K2HP04 0.327%, glucose 0. 25%, agar 1.5%)中過夜培養(yǎng) K /Mireyf菌株T4，用Omega Bacterial DNA試劑盒提取基因組DNA, ^ 5ug基因組DNA用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切后在0. 8%的瓊脂凝膠中 電泳，用Omega Gel Extraction試劑盒回收4 - 6kb DNA片段，將飾g 回收的DNA與200ng BamHI線性化并經(jīng)小牛堿性磷酸酶(CIP)處理過的質(zhì) 粒pBU連接，連接混合液用Hanahan方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc后在含Kn (50ug/ml )的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取7個 周邊培養(yǎng)基凹陷的轉(zhuǎn)化子，將挑取的轉(zhuǎn)化子在含Kn (50ug/ml)的LB培養(yǎng) 基中過夜培養(yǎng)，用Omega Plasmid Mini Kit試劑盒提取質(zhì)粒并對其所含插 入DNA片段用引物UAR6 (5， -CTCATCACTTTGCCAATAGG-3，)進行測序。測序 結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)所有7個重組質(zhì)粒中都含有一個具信號肽序 列的斷裂功能基因如下，其中信號肽通常由約15 —35個氨基酸所組成， 位于分泌蛋白的N端或C端，其組成氨基酸多為疏水性和非極性氨基酸， 但其N端附近的幾個氨基酸通常為堿性氨基酸，括號內(nèi)劃線氨基酸為信號 肽特征性強堿性氨基酸。
BUSl
(MgTIAAALLACLSFSANA ) AEYRANEVANGFQIPWGIEFLDNQRVI VNEKNGTVSLLDIKSGKPQKLFNVPDVNTSGQAGLLDVALTPNADK(2 NPQLFFTYSKRTSK BUS2
(M腿ILLFSILAYSTLSYA)RIPNSLQDQNITITVKYDKETQEFYDLSATG SNYFNYQIRNDGFEITHGRDGFIGASTEF麗QSIRVGLDTNQDLGVKY LINTSTGAKASLDVGLLSAFFRYQGQSANAHSDNAQN
捕獲的斷裂功能基因其編碼產(chǎn)物皆為分泌型蛋白如下其中該序列中大 寫部分為分泌信號序列中篩選分泌序列和分泌蛋白基因。 T4
BUSl:
aataccgcgctaacgaagtggcgaatggatttcagatcccttggggaatcgagttcttagacaaccaacgcgttatcgtcaatgaaaag aacggtacggtttcgctgctggatatcaaatcaggcaaacctcaaaagctgtttaacgtccccgatgtgaacaccagtggacaagcgg gcttattggatgttgcgctcacaccgaatgccgataagcaaaacccgcaactcttctttacctacagcaagcgtacgagcaaagg BUS2-Blue:
cccaattctctgcaagaccagaatattacaattactgtaaagtatgataaggaaactcaagaattctatgatttgagtgctactggatccaat tattttaactatcagataagaaacgatggttttgaaataacacatggtcgagatgggttcataggagcgagtacagagtttaataaccaatc tataagggttgggctagatacgaatcaagacctaggtgtaaagtacttaattaacacgtcgacaggagcaaaagcatcgttggatgttgg tcttttaagtgctttctttaggtatcaaggacagtcagctaatgctcacagcgacaacgcacagaatt
通過檢測可得本發(fā)明構(gòu)建的載體捕獲的分泌序列皆為編碼分泌型蛋白 的序列(參見圖3)。
實施例2和實施例3結(jié)果表明pBU可以作為一種廣譜性(general )篩 選工具，快速、高效地從革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中篩選功能性分泌序 列以及分泌蛋白基因。
本發(fā)明實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明 進行限制。
(1) SEQ ID No:2的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度4577堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)狀
(b) 分子類型DNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源人工合成
序列表
SEQUENCE LISTING <110〉中H科學(xué)院海洋研究所
<120〉 一種捕獲分泌序列的載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)ffl
<130>
〈160〉 2
<170> Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211〉 1359
<212> 隱
〈213> Vibrio sp.
〈220〉
〈221> gene
<222> (1).. (1359)
〈223>
〈400〉 1 atgaaatccata_atta.a_a.actctgacattgctaccaatatttttaact 3gcacgacgtta60
atggctgaagactggcgagaaatccccattccagcaccgttag朋gatgggc卿gctgg12()
g3gtt3C犯gaggcatactccgattcgtttgt船gggCgBctctt t.ccgt180
agtaaglgga3tgataccl3ctttcacggttggacaggacctggtttaacct.at t ggcaa240
agtgatgagt.catgggtagat gatggcsac11gataatcagtgc(:txtcgtcglcaggga300
acagagatggtgaatgcgggcgUgtgacgtctaagacaa360
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t.tcgagagtagttggCd457權(quán)利要求
1.一種捕獲分泌序列的載體，其特征在于具有序列表SEQ ID No2中堿基序列，含有去信號序列的瓊膠酶基因agaV，外源基因插入位點以及篩選標(biāo)記。
2. —種按權(quán)利要求1所述的分泌序列捕獲載體的構(gòu)建方法，其特征在于 1)設(shè)計質(zhì)粒pBK:a. 以質(zhì)粒pACYC177為模板，用分別含有BamHI位點和HincII位點的卡 那霉素基因引物，PCR擴增卡那霉素基因，PCR產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切 酶BamHI和HincII雙酶切；其中PCR條件為:94。C60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s， 45。C 60s, 72"C 60s, 5個循環(huán)后改為94nC 40s， 58°C 60s, 72°C 60s, 25個循環(huán)后再 在72°C延伸反應(yīng)10min;b. 將質(zhì)粒pBR322用BamHI和Seal酶切，電泳回收3471 bp DNA片段， 將該片段與a步驟中得到酶切處理過的PCR產(chǎn)物連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5cc,在含有卡那霉素LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，篩選出抗卡那霉素的轉(zhuǎn) 化子，從轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒，即為PBK;2 )設(shè)計質(zhì)粒p面:a.將agaV的操縱子克隆到質(zhì)粒pUC19,構(gòu)成重組質(zhì)粒pBUAl，而后以 質(zhì)粒pBUAl為模板，用分別含有BamHI位點和Xhol位點的引物，進行PCR 擴增，得到去信號序列的agaV的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物純化，而后與載體 pBS - T于室溫連接，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，在含有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選白色轉(zhuǎn)化子；其中PCR條件94°C 60s預(yù)變性模板DNA,然后94"C 40s， 46°C 60s， 72°C 60s, 5個循環(huán)后改為94°C 40s, 59°C 60s， 72°C 60s， 25個循環(huán)后再 在72"C延伸反應(yīng)lOmin;b.從挑取的白色轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒，即為pUALS; 3)設(shè)計分泌序列捕獲載體a. 將步驟1 )中得到的質(zhì)粒pBK用限制性內(nèi)切酶BamHI和BsaBI酶切， 得到3. 2kbDNA片段；將步驟2)中的質(zhì)粒pUALS用限制性內(nèi)切酶BamHI和 Smal雙酶切，得到1. 3kb DNA片段，將其與前3. 2kb DNA片段相連接，連 接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5cx后在含有Kn的LB固體培養(yǎng)基上條選抗卡那霉 素的轉(zhuǎn)化子；b. 從抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒，即為分泌序列捕獲載體pBU。
3. 按權(quán)利要求2所述的分泌序列捕獲載體及其構(gòu)建方法，其特征在于: 所述步驟1 )a中的引物為KnF2 5， - ATGGATCCACGGTTGATGAGAGC -3， , KnR3 5， — GCCGTCGACCAATTAACCAATTC —3'。
4. 按權(quán)利要求2所述的分泌序列捕獲載體及其構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟2 )a中的引物為UAF5 5， -ATGGATCCGAAGACTGGCGAGAAATC-3， UAR3 5， -CACTCGAGTTGTATAAATTTCAATCGC-3'。
5. 按權(quán)利要求2所述的分泌序列捕獲載體及其構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟2)得到去信號序列的agav的PCR產(chǎn)物純化后，與載體pBS - T 于室溫連接2-4小時。
6. —種按權(quán)利要求l所述的分泌序列捕獲載體的應(yīng)用，其特征在于所 述載體可捕獲原核生物中分泌蛋白基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程領(lǐng)域，具體的說是一種捕獲分泌序列的載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該捕獲載體含有去信號序列的瓊膠酶基因agaV，外源基因插入位點以及篩選標(biāo)記。利用成熟瓊膠酶基因agaV作為報告子，可以迅速、高效地從革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中篩選出功能性信號序列以及分泌蛋白基因，本發(fā)明不僅可以從未知基因組中篩選分泌蛋白基因，而且還可以對假定分泌信號的驗證、啟動子以及SD序列的功能檢測、人工強力信號肽的大規(guī)模篩選等。本發(fā)明操作簡單，只需常規(guī)的連接、轉(zhuǎn)化以及顏色篩選；所捕獲的基因無假陽性，100％具有典型的分泌蛋白基因特征。從而為病原微生物疾病防治提供候選疫苗抗原和藥物靶點。
文檔編號C12N15/65GK101191133SQ20061013444
公開日2008年6月4日 申請日期2006年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月1日
發(fā)明者黎 孫, 張衛(wèi)衛(wèi) 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所