本發(fā)明涉及植物分子生物學領域，具體地說，涉及一種利用深紅色熒光蛋白標記植物種子的方法。

背景技術：

植物基因工程中的近期進展己打開了改造植物以具有改善的特征或性狀的新大門，所述改善的特征或性狀例如植物疾病抗性、昆蟲抗性、除草劑抗性、產(chǎn)量改善、植物可食用部分的營養(yǎng)質(zhì)量的改善。

篩選標記基因在植物基因工程中極為重要，它可以大大減少工作量，能夠方便區(qū)分轉(zhuǎn)化細胞核非轉(zhuǎn)化細胞。目前使用較多的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)從大腸桿菌中分離出來，具有潮霉素B抗性。該基因的作用機理是htp可以將磷酸基團共價的加到潮霉素B的第4位羥基上，使其發(fā)生磷酸化而失去活性，從而使轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生潮霉素抗性，非轉(zhuǎn)化細胞死亡。草丁膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)(bar)基因最初從吸水鏈霉菌中分離出來的。PAT能使草丁膦的自由氨基乙酰化，從而使草丁膦對植物無毒害作用。但是這些標記基因存在抗生素敏感性、除草劑大量使用以及人類健康和生態(tài)環(huán)境等潛在的安全威脅，限制了轉(zhuǎn)記憶植物的商業(yè)化應用。目前也有無選擇標記轉(zhuǎn)基因方法，包括共轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)座子法、位點特異性重組系統(tǒng)的方法，目前仍有待進一步研究，在商業(yè)上應用很有限。

自從1992年綠色熒光蛋白基因從水母中克隆以來，現(xiàn)在很多海洋生物物種中克隆到了新的熒光蛋白，熒光蛋白的的熒光波譜范圍從424nm的深藍色Sirius蛋白，到708nm的近紅外mIFP蛋白，覆蓋了深藍，藍色，青色，綠色，黃色，橙色，紅色，深紅，和近紅外的波段。并且還發(fā)現(xiàn)和進化出了光激活，光轉(zhuǎn)化熒光蛋白。這些熒光蛋白廣泛應用于生物分子標記，研究分子相互作用(能量共振轉(zhuǎn)移FRET)，光激活，光轉(zhuǎn)化熒光蛋白用于單分子熒光定位。熒光蛋白作為標記分子本身來源于海洋動物，自身可以發(fā)熒光進行光學檢測，不需要外源化學物質(zhì)處理，具有更高的生物安全性。

蛋白質(zhì)是稻米種子胚乳中繼淀粉后的第二大儲藏物質(zhì)，占糙米干重的8％-10％。按照蛋白質(zhì)功能可以將他們分為兩大類，即作為種子儲藏物質(zhì)的種子儲藏蛋白以及維持種子細胞正常代謝的結構蛋白。水稻種子蛋白大多數(shù)是儲藏蛋白，在子葉或胚乳中形成粒(糊粉層)。主要根據(jù)種子蛋白質(zhì)的溶解性分為4種：堿溶性谷蛋白，醇溶性醇溶蛋白，鹽溶性球蛋白和水溶性白蛋白。種子特異性啟動子可以驅(qū)動外源蛋白或種子自身蛋白在種子中表達儲存。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用深紅色熒光蛋白標記植物種子的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種植物種子標記用深紅色熒光蛋白TurboFP635基因，其為：

i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或

iii)在嚴格條件下與SEQ ID NO:2所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有70％以上同源性且具有翻譯成同等深紅色熒光功能蛋白的核苷酸序列。

熒光蛋白TurboFP635呈深紅色，激發(fā)峰：588nm，發(fā)射峰：635nm。其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明的另一目的是提供轉(zhuǎn)基因熒光篩選標記，以及轉(zhuǎn)基因種子標記，為了達到以上目的，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因熒光標記的有效連接序列的植物表達載體，包含有效連接調(diào)控的表達盒，

本發(fā)明的深紅色熒光蛋白TurboFP635基因表達盒，所述表達盒中包括植物種子特異性啟動子及其下游的深紅色熒光蛋白FP635基因。

由上述TurboFP635基因表達盒以及外源/內(nèi)源基因表達盒串聯(lián)而成的結構，均屬于本發(fā)明保護范圍。

本發(fā)明所述植物種子特異性啟動子包括水稻、玉米、高梁、大麥、燕麥、小麥、粟、甘蔗、大豆、蕓苔屬物種、棉花、紅花、煙草、苜蓿和向日葵等植物的種子特異性啟動子。優(yōu)選水稻種子特異性啟動子ZZ1，其為：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或

iii)在嚴格條件下與SEQ ID NO:1所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

本發(fā)明的深紅色熒光蛋白TurboFP635基因表達盒由水稻種子特異性啟動子及其下游的深紅色熒光蛋白FP635基因組成。其中，所述水稻種子特異性啟動子和深紅色熒光蛋白FP635基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和2所示。

本發(fā)明還提供含有所述表達盒的載體、宿主細胞、工程菌及轉(zhuǎn)基因細胞系。

本發(fā)明還提供所述表達盒或含有所述表達盒的載體在制備轉(zhuǎn)基因植物以及轉(zhuǎn)基因植物種子標記中的應用。

本發(fā)明含有上述深紅色熒光蛋白的重組表達載體可通過農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，獲得獨立的轉(zhuǎn)基因細胞或組織，培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因株系。

本發(fā)明還提供所述深紅色熒光蛋白TurboFP635在轉(zhuǎn)基因植物篩選以及植物種子標記中的應用。

本發(fā)明進一步提供一種利用深紅色熒光蛋白標記植物種子的方法，將含有所述表達盒的載體轉(zhuǎn)化目標植物，篩選得到的轉(zhuǎn)基因植株自交，結實產(chǎn)生帶熒光標記的種子。其中，所述植物包括但不限于水稻、玉米、高梁、大麥、燕麥、小麥、粟、甘蔗、大豆、蕓苔屬物種、棉花、紅花、煙草、苜蓿和向日葵。優(yōu)選水稻。

前述方法包括以下步驟：

S1、重組表達載體1300FP635-ZZ1的構建

S11、中間載體1300FP635的構建：人工合成深紅色熒光蛋白TurboFP635基因序列時，在起始密碼子前添加與載體1300GUSplus重復序列ctagaggatccacggtacc，并添加NcoI酶切位點；在終止密碼子后添加與載體1300GUSplus重復序列atcaacaactctcctggcgcaccatcgtcggctacagcctcgggaattgctaccgagctcgaatttccccgatcgttc，并添加SacI酶切位點；利用Gibson Assembly法，將構建好的TurboFP635基因序列插入到1300GUSplus載體NcoI和SacI酶切位點之間，得到中間載體1300FP635(圖1)；

S12、水稻種子特異性啟動子的克隆：提取水稻基因組DNA，設計引物序列如SEQ ID NO:4和5所示，通過PCR反應擴增得到水稻種子特異性啟動子；

S13、利用Gibson Assembly法，將S12的擴增產(chǎn)物插入到1300FP635載體NcoI酶切位點，即得重組表達載體1300FP635-ZZ1(圖2)；

S2、遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

S21、農(nóng)桿菌的制備：取-70℃保存的農(nóng)桿菌EHA105于含50μg/ml Kan+25μg/ml Rif+50μg/ml鏈霉素的平板劃線，28℃培養(yǎng)；挑取單菌落接種于50ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)12-16hr；取2ml菌液轉(zhuǎn)接于含有抗生素的100ml YEP液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.5；冰上預冷10分鐘，5000rpm離心10min；然后用無菌去離子水洗2次，10％甘油洗1次，溶于3ml10％甘油中；取100μl感受態(tài)細胞加入1μl重組表達載體1300FP635-ZZ1，2.5KV電擊轉(zhuǎn)化；在含有卡那霉素和利福平的YEP培養(yǎng)板上28℃培養(yǎng)，挑選陽性克??；

S22、驗證正確的克隆，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法侵染水稻‘中花11’，經(jīng)共培養(yǎng)、篩選、分化、生根步驟之后，得到T0代轉(zhuǎn)基因幼苗，提取DNA，經(jīng)PCR驗證的轉(zhuǎn)基因陽性植株；

S3、轉(zhuǎn)基因植株自交結實，收獲轉(zhuǎn)基因種子，在熒光顯微鏡下觀察種子呈深紅色。

步驟S22中PCR驗證使用的引物序列如SEQ ID NO:6和7所示。

本發(fā)明提供一種利用深紅色熒光蛋白標記植物種子的方法。通過合成深紅色熒光蛋白TurboFP635基因，將其構建于植物種子特異性啟動子下游，遺傳轉(zhuǎn)化載體通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入水稻胚性愈傷，挑選陽性愈傷組織，分化成苗，其結實種子在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)基因種子具有明顯熒光。該方法可以區(qū)分轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子，作物篩選標記，也可以用來標記愈傷組織，作為轉(zhuǎn)化篩選方法。

(一)熒光蛋白激發(fā)波長588nm發(fā)射波長635nm，為深紅色，具有更強的組織穿透能力，并且更容易與植物自身熒光區(qū)分開。

(二)該深紅色熒光蛋白在植物種子中表達，通過熒光檢測很容易區(qū)分轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子，在轉(zhuǎn)基因標記和生產(chǎn)中有很好的應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明深紅色熒光蛋白的重組表達載體1300FP635構建流程圖。

圖2為本發(fā)明ZZ1種子啟動子的重組表達載體1300FP635-ZZ1構建流程圖。

圖3和圖4分別為本發(fā)明實施例5中1300FP635-ZZ1轉(zhuǎn)基因水稻種子熒光檢測結果。

圖5為本發(fā)明實施例6中PCR檢測熒光和非熒光T1代植株基因型結果(靶基因為深紅色熒光蛋白基因，擴增條帶為432bp)。

圖6為本發(fā)明實施例6中PCR檢測熒光和非熒光T1代植株基因型結果(靶基因為潮霉素基因，擴增條帶為561bp)。

圖5和圖6中，M為DNA分子量標準，1：模板為水；2：非轉(zhuǎn)基因植株DNA；3：重組表達載體1300FP635-ZZ1；4-8：轉(zhuǎn)基因T1代熒光種子植株；9-13：轉(zhuǎn)基因T1代非熒光種子植株。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

本發(fā)明中使用的載體1300GUSplus由海南波蓮水稻基因科技有限公司提供，該載體已公開于水稻根系發(fā)育調(diào)控基因OsAIMl的克隆與功能研究，徐磊，浙江大學，2012年。

實施例1構建深紅色熒光蛋白TurboFP635的重組表達載體1300FP635

1、深紅色熒光蛋白TurboFP635的合成

人工合成深紅色熒光蛋白基因序列時，在起始密碼子ATG前帶有與載體1300GUSplus重復序列ctagaggatccacggtacc，且?guī)coI酶切位點。在終止密碼子TGA后帶有與載體1300GUSplus重復序列atcaacaactctcctggcgcaccatcgtcggctacagcctcgggaattgctaccgagctcgaatttccccgatcgttc，且?guī)acI酶切位點。為一步法構建到載體設計。

2、設計PCR TurboFP635引物

引物設計使用Gibson Assembly方法，擴增產(chǎn)物插入到1300GUSplus載體NcoI和SacI酶切位點。擴增TurboFP635基因引物如序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

PCR反應體系(100μ1)：

DNA模板:3μ1(50ng)

KOD聚合酶(購自東洋紡公司):2μ1

10×buffer:10μl

正向引物:3μ1(10μM)

反向引物:3μl(10μM)

dNTP:10μl(10mM)

MgSO₄:4μl

1/10DMSO:20μl

H₂O:45μl

PCR程序:預變性95℃4min；變性94℃30s，退火55-65℃30s，延伸68℃1min，35個循環(huán)；延伸68℃10min。

3、構建TurboFP635的重組表達載體1300FP635

構建流程見圖1，將擴增產(chǎn)物插入到1300GUSplus載體NcoI和SacI酶切位點。引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9擴增PCR產(chǎn)物，用1％瓊脂糖凝膠電泳回收704bp左右擴增產(chǎn)物。NcoI及SacI酶切載體1300GUSplus，回收線性酶切載體。

2×連接試劑盒連接深紅色熒光蛋白TurboFP635到載體1300GUSplus，10μl體系如下：

2.5μ1TurboFP635PCR產(chǎn)物(50ng)

2.5μ1酶切載體(100ng)

5μ1Ligation Mix

連接程序：50℃60min。

轉(zhuǎn)化：取上述連接產(chǎn)物5μ1電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑選陽性克隆測序，命名為1300FP635。

實施例2水稻種子特異性啟動子ZZ1的克隆

1、水稻基因組DNA的提取

根據(jù)植物DNA分離試劑盒(成都福際生物技術有限公司)方法說明提取水稻基因組DNA。基因組來源于水稻日本晴品種新鮮葉子。提取的基因組DNA分裝保存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2、設計擴增ZZ1的PCR引物

引物設計使用Gibson Assembly方法，擴增產(chǎn)物插入到1300FP635載體NcoI酶切位點。擴增ZZ1基因引物如序列SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示。其中上下游引物5’端均有15個左右核苷酸序列與載體相應連接位置重復，以便Gibson Assembly連接。

PCR反應體系(100μ1)：

DNA模板:3μ1(50ng)

KOD聚合酶(購自東洋紡公司):2μ1

10×buffer:10μl

正向引物:3μ1(10μM)

反向引物:3μl(10μM)

dNTP:10μl(10mM)

MgSO₄:4μl

1/10DMSO:20μl

H₂O:45μl

PCR程序:預變性95℃4min；變性94℃30s，退火55-65℃30s，延伸68℃2min 30s，35個循環(huán)；延伸68℃10min。

水稻種子特異性啟動子ZZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

實施例3構建種子特異性啟動子ZZ1的重組表達載體1300FP635-ZZ1

構建流程見圖2，將實施例2擴增產(chǎn)物插入到1300FP635載體NcoI酶切位點。

引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5擴增PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳回收2008bp左右產(chǎn)物。NcoI酶切載體1300FP635，回收線性酶切載體。

2×連接試劑盒連接種子特異性啟動子ZZ1到載體1300FP635。

10ul體系如下：

2.5μ1ZZ1PCR產(chǎn)物(50ng)

2.5μ1酶切載體(100ng)

5μ1Ligation Mix

連接程序：50℃60分鐘。

轉(zhuǎn)化：取上述連接產(chǎn)物2μ1電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑選陽性克隆測序。命名為1300FP635-ZZ1。1300FP635載體含有深紅色熒光蛋白FP635基因，其序列如SEQ ID NO:2所示，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色，用于檢測特異性表達與PCR檢測熒光和非熒光T1代植株基因型。1300FP635-ZZ1載體含有潮霉素基因，其序列如SEQ ID NO:10，用于PCR檢測熒光和非熒光T1代植株基因型。

實施例4轉(zhuǎn)基因1300FP635-ZZ1的水稻的獲得

取-70℃保存的農(nóng)桿菌EHA105于含Kan(50μg/ml)+Rif(25μg/ml)+鏈霉素(50μg/ml)平板劃線，28℃培養(yǎng)。挑取單菌落接種于50ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)12-16hr。取2ml菌液轉(zhuǎn)接于100ml(含有抗生素)YEP液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.5。冰上預冷10分鐘，5000rpm離心10min(冷凍離心機預冷到4℃)。無菌去離子水洗2次(每次10ml)，10％甘油洗1次溶于3ml10％甘油中。取100μl感受態(tài)細胞加1μl實施例3中制備的1300FP635-ZZ1質(zhì)粒，2.5KV電擊轉(zhuǎn)化。在含有卡那霉素和利福平的YEP培養(yǎng)板上28℃培養(yǎng)，挑選陽性克隆，用1300FP635載體特異性引物SEQ ID NO:6-7PCR驗證。

驗證正確的克隆，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法侵染水稻‘中花11’(參見Hiei Y Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal6:271-282)。經(jīng)共培養(yǎng)、篩選、分化、生根等步驟獲取T0代轉(zhuǎn)基因幼苗，提取DNA，經(jīng)PCR驗證(引物SEQ ID NO:6-7)的轉(zhuǎn)基因陽性植株，自交結實獲得T1代。取T1植株進行后續(xù)分析。

實施例5轉(zhuǎn)基因植株種子的檢測分析

通過轉(zhuǎn)基因植株結實，收獲轉(zhuǎn)基因種子，利用熒光顯微鏡觀察種子發(fā)熒光情況?！谢?1’為對照。帶有熒光的種子在熒光顯微鏡下可呈現(xiàn)深紅色，與‘中花11’有明顯的區(qū)別，結果如圖3所示。撥開穎殼，肉眼可看出種子呈紅色，結果如圖4所示。

實施例6檢測水稻轉(zhuǎn)基因熒光和非熒光T1代植株基因型

由重組植物表達載體1300FP635-ZZ1的轉(zhuǎn)基因植株，收獲T1代種子。熒光種子與非熒光種子各10粒，清水浸泡發(fā)芽，獲取葉片DNA(各5株)，分別在熒光顯微鏡下觀察熒光和非熒光植株(圖4)，并利用PCR法檢測基因型，PCR引物SEQ ID NO:6-7用于檢測轉(zhuǎn)基因深紅色熒光蛋白FP635，檢測結果見圖5，PCR引物SEQ ID NO:11-12用于檢測轉(zhuǎn)基因植株中的潮霉素基因，檢測結果見圖6。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 海南波蓮水稻基因科技有限公司

<120> 利用深紅色熒光蛋白標記植物種子的方法

<130> KHP161117835.7Q

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2008

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

gtgatcccag cgcttcactt agaatggttt ttcatagcat taaatgatat gccacgtagg 60

aaaaaacatg atgtgccatt ttattaactt aggaaagaga agaaaattgg gtcttctcaa 120

aatgatcatc atctaacaaa atgtctcttt gtttatttgt gcaaagagta aatgtgcatc 180

gtgcaatgtc atgcatgctg ccaaccaaga ttaatttcta tttagttgaa cctgtgcaac 240

atttaaagtg tgaagtaatt tttgttggac ttgaagcgac aaagcacctt ggtcgattag 300

gccatcccca acccatggtg tccatgggtg gtgtctagag cagtgagaga tcaataaatg 360

catatatgga cactacctcc ccattgcatc gtttatatac cagttttcat aggcaaaaaa 420

aaattagtag ctctttgcat gtaacattaa cagaggaggg tcagctgtgg caagcaagca 480

agcagacgcg ggaggggagg cgcgcagcag gcatggtgac ggggtagggc gcagcggatc 540

gagatgcgag gatttttttt tgggggggtg gggtgggggg agagaaacga gtcatccaac 600

ccaacgcgga tttagctagt ttccagtgcc ttggaacagc cgccgaaacg gtgtcgcgca 660

tgcgacctgg tttctatgtt tttgcttctt tctcttcttt tattccgttg ccacatcaac 720

tttttgtcta gttggcagcc taattaattc tatggaaacc aggtgacatg gagggttggg 780

gacatggtgg aaaaaaccgg aacgggccga cagttcaacc ggaaaaaacc agaacccgtt 840

cagttcaaaa gaaagaccgg acatgcatat gacccgcttt gaaccggcag aaccggtcgg 900

tttttctatg aaccggtcat taaaccgtcc ccggttagac cgaacaagcc acaataatct 960

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aatctcctat tctcggcacg tgtgatatac aatggtaagt gagatataca attctcggca 1080

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atacatgcca ggaagttcag aacaatgtgt tgcctttcac cggaaaactt tgttggagca 1200

aatgccttct tcttttttgc ttctgcttct tgagtccatg tggaggaagc agtagatagc 1260

tgatgatatc aggattcctt ctgtgtctgt gtaggtgtag caacaccact ataattttta 1320

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aattagagta agttggtgag ttattgtaaa gctctgcaaa gttaatttaa aagttattgc 1440

attaacttat ttcgtatcac aaacaagttt tcacaagagt attaatggaa caatgaaaac 1500

cattgaacat actataattt tttttcttac tgaaattata taattcaaag agcataaacc 1560

cacacagtcg taaagttcca cgtgtagtgc attatcaaaa taatagctta caaaacataa 1620

caaacttagt ttcaaaagtt gcaatcctta tcacattgac acataaagtg agcgatgagt 1680

catgtcatta tttttttgct caccatcatg tatatatgat gggcataaaa gttactttga 1740

tgatgatatc aaagaacatt tttaggtgca cctaacagaa tatccaaata atatgactca 1800

cttagatcct aatatagcat caagcaaaac taacactcta aagcaaccga tagggaaaca 1860

tctataaata gacaagcata atgaaaaccc tcctcatcct tcacacaatt caaacattat 1920

agttgaagca tagtagtaga atcctacaaa aatgaagatc attttcgtat ttgctctcct 1980

tgctattgtt gcatgcaacg cttctgca 2008

<210> 2

<211> 708

<212> DNA

<213> 深紅色熒光蛋白

<400> 2

atggtgggtg aggatagcgt gctgatcacc gagaacatgc acatgaaact gtacatggag 60

ggcaccgtga acgaccacca cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa gccctacgag 120

ggcacccaga ccatgaagat caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac 180

atcctggcta ccagcttcat gtacggcagc aaaaccttta tcaaccacac ccagggcatc 240

cccgacttct ttaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagaggat caccacatac 300

gaagacgggg gcgtgctgac cgctacccag gacaccagcc tccagaacgg ctgcctcatc 360

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acactcggct gggaggccag caccgagatg ctgtaccccg ctgacagcgg cctgagaggc 480

catagccaga tggccctgaa gctcgtgggc gggggctacc tgcactgctc cctcaagacc 540

acatacagat ccaagaaacc cgctaagaac ctcaagatgc ccggcttcta cttcgtggac 600

aggagactgg aaagaatcaa ggaggccgac aaagagacct acgtcgagca gcacgagatg 660

gctgtggcca ggtactgcga cctgcctagc aaactggggc acagctga 708

<210> 3

<211> 235

<212> PRT

<213> 深紅色熒光蛋白

<400> 3

Met Val Gly Glu Asp Ser Val Leu Ile Thr Glu Asn Met His Met Lys

1 5 10 15

Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val Asn Asp His His Phe Lys Cys Thr Ser

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Lys Ile Lys

35 40 45

Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr

50 55 60

Ser Phe Met Tyr Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile

65 70 75 80

Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg

85 90 95

Ile Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr

100 105 110

Ser Leu Gln Asn Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Asn Gly Val

115 120 125

Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Met Leu Tyr Pro Ala Asp Ser Gly Leu Arg Gly

145 150 155 160

His Ser Gln Met Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly Tyr Leu His Cys

165 170 175

Ser Leu Lys Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys

180 185 190

Met Pro Gly Phe Tyr Phe Val Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu

195 200 205

Ala Asp Lys Glu Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Met Ala Val Ala Arg

210 215 220

Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys Leu Gly His Ser

225 230 235

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagaggatc cacggtacgt gatcccagcg cttcacttag 40

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctatcctca cccactgcag aagcgttgca tgcaac 36

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctctcccctt cgccttcgac at 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agtagaagcc gggcatcttg ag 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctagaggatc cacggtacca tgg 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaacgatcgg ggaaattcga gctc 24

<210> 10

<211> 810

<212> DNA

<213> 潮霉素基因

<400> 10

gaccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt 60

ctctctctac aaatctatct ctctcgagct ttcgcagatc cgggggggca atgagatatg 120

aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc 180

gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta 240

ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt 300

tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg 360

gagtttagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa 420

gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg 480

atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 540

ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac 600

tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg 660

atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc 720

aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg 780

ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 810

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttagccaga cgagcgggtt c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcttctgcgg gcgatttgt 19