本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速回補(bǔ)鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法。

背景技術(shù)：

目前主要通過(guò)敲除鴨疫里默氏桿菌的基因來(lái)研究該基因的功能，進(jìn)而研究鴨疫里默氏桿菌的致病機(jī)理。將細(xì)菌某個(gè)基因敲除后通常會(huì)引起它的表型發(fā)生改變，但有些表型變化可能是由于被敲除的基因影響了其它基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)所導(dǎo)致。因此，我們?cè)谇贸硞€(gè)基因時(shí)，還需要對(duì)這個(gè)基因進(jìn)行回補(bǔ)，來(lái)確定該基因的功能。對(duì)于像大腸桿菌等細(xì)菌可以通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法直接將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。但鴨疫里默氏桿菌要求比較嚴(yán)格，目前主要通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入重組質(zhì)粒。這種方法需要利用大腸桿菌作為供體菌，且步驟繁瑣、耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)等給鴨疫里默氏桿菌研究帶來(lái)諸多不便?；诖思夹g(shù)背景，因此急需一種快速回補(bǔ)鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種快速回補(bǔ)鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法，該方法簡(jiǎn)單，周期短。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種快速回補(bǔ)鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法，構(gòu)建含有目的基因的重組穿梭質(zhì)粒，然后加入含有MgCl₂的活化的鴨疫里默氏桿菌菌液中，37℃孵育30分鐘，然后加入含MgCl₂的GCB培養(yǎng)基孵育7小時(shí)，然后涂布在含對(duì)應(yīng)抗性固體GCB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h至單克隆長(zhǎng)出，即獲得鴨疫里默氏桿菌回補(bǔ)菌株；所述穿梭質(zhì)粒為能夠在鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌中穩(wěn)定存在的質(zhì)粒。

本發(fā)明中，所述穿梭質(zhì)粒為含有鴨疫里默氏桿菌復(fù)制起始基因的質(zhì)粒。

進(jìn)一步，所述穿梭質(zhì)粒為pLMF03，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本發(fā)明中，所述MgCl₂的濃度為5mM。

本發(fā)明中，活化鴨疫里默氏桿菌的方法如下：從-80℃取出鴨疫里默氏桿菌在血平板上復(fù)蘇至菌落長(zhǎng)出，用接種環(huán)挑取單克隆菌落接種至GCB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；調(diào)整OD600＝1，得活化鴨疫里默氏桿菌。

本發(fā)明中，所述目的基因?yàn)轼喴呃锬蠗U菌RA0C_1193基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明中，所述重組穿梭質(zhì)粒由以下方法制備：將SEQ ID NO.4所示序列經(jīng)NcoI和XbaI酶切位點(diǎn)連入pLMF03質(zhì)粒NcoI和XbaI酶切位點(diǎn)制得。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種快速回補(bǔ)鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法，該方法載體重組后不需要轉(zhuǎn)入供體菌，直接可以進(jìn)入宿主菌并發(fā)揮相關(guān)基因功能；并且培養(yǎng)周期短，一般情況下18小時(shí)就能分離到回補(bǔ)候選株克?。凰璩杀据^低，為研究鴨疫里默氏桿菌基因功能提供了有力的工具。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明：

圖1為穿梭質(zhì)粒pLMF03圖譜。

圖2為PCR鑒定穿梭質(zhì)粒pLMF03轉(zhuǎn)入ATCC11845后長(zhǎng)出來(lái)的轉(zhuǎn)化子的電泳圖(第1-9泳道為隨機(jī)選取的9個(gè)轉(zhuǎn)化子，質(zhì)粒pLMF03為陽(yáng)性對(duì)照，ATCC11845野生株為陰性對(duì)照；)

圖3為PCR擴(kuò)增出的RA0C-1193基因片段的電泳圖(第1泳道DNA marker；第二泳道RA0C-1193基因片段)。

圖4為用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XbaI酶切質(zhì)粒pLMF03和RA0C-1193基因片段，回收酶切產(chǎn)物的電泳圖(第1泳道為酶切后的質(zhì)粒pLMF03，第2泳道為酶切后的RA0C-1193基因片段)。

圖5為載體pLMF03與目的基因RA0C-1193連接后轉(zhuǎn)入DH5α長(zhǎng)出來(lái)的轉(zhuǎn)化子的鑒定電泳圖(第1-6泳道為隨機(jī)挑取的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，7泳道為陽(yáng)性對(duì)照；ATCC11845野生株為陽(yáng)性對(duì)照)。

圖6為重組質(zhì)粒酶切后的電泳圖。

圖7為自然轉(zhuǎn)移長(zhǎng)出來(lái)的轉(zhuǎn)化子鑒定的電泳圖(1-5為轉(zhuǎn)化子為模板；6為質(zhì)粒pLMF03為模板；7為鴨疫里默氏桿菌ATCC11845為模板)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1

穿梭質(zhì)粒的準(zhǔn)備：首先從-80℃取出帶有穿梭質(zhì)粒pLMF03(圖1，SEQ ID NO.7)的宿主菌DH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存)在LB平板上，待其生長(zhǎng)起來(lái)后，用接種環(huán)挑取單克隆菌落接種至4ml液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；然后用質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)自天根)對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)的菌液進(jìn)行質(zhì)粒的提取，并測(cè)濃度。

受體菌的制備：首先從-80℃取出鴨疫里默氏桿菌ATCC11845野生株(本實(shí)驗(yàn)室保存)在血平板上復(fù)蘇，待其生長(zhǎng)起來(lái)后，用接種環(huán)挑取單克隆菌落接種至10ml液體GCB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜；將其調(diào)整為OD600＝1，并加入5mMMgCl₂混勻備用。

自然轉(zhuǎn)移：取兩個(gè)1.5ml無(wú)菌離心管，一個(gè)作為實(shí)驗(yàn)組，一個(gè)作為對(duì)照組，分別加入300μl(含5mM MgCl₂)上述菌液，其中實(shí)驗(yàn)組分別加入1μg的穿梭質(zhì)粒pLMF03，對(duì)照組不加。封口膠密封并置于37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘；取出孵育30分鐘的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別向其中加入700μl含有5mM MgCl₂的GCB培養(yǎng)基，即定容至1ml，封口膠密封，37℃培養(yǎng)箱孵育7小時(shí)。

培養(yǎng)基的制備：4個(gè)含頭孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)抗性的GCB固體培養(yǎng)基。

從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取出100μl菌液，分別用一次性涂布棒涂在含頭孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)的GCB固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h至單克隆長(zhǎng)出。

陽(yáng)性結(jié)合子的篩選及鑒定：經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，在含頭孢西丁抗性的培養(yǎng)基上，實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)出了明顯的單克隆菌落，而對(duì)照組沒(méi)有，挑取9個(gè)單克隆分離在新的含頭孢西丁抗性的GCB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。

將挑取的單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增cfxA部分片段(SEQ ID NO.1)，PCR鑒定引物如下：

cfx p1：5’-ggtgctgcaatgttgatg-3’(SEQ ID NO.2)；

cfx p2：5’-ccgctaaggtataactg-3’(SEQ ID NO.3)；

PCR擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；再72℃后延伸8min；16℃保存；同時(shí)以質(zhì)粒pLMF03為陽(yáng)性對(duì)照，ATCC11845野生株為陰性對(duì)照，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，穿梭質(zhì)粒pLMF03能夠成功導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌ATCC11845野生株。

實(shí)施例2、回補(bǔ)鴨疫里默氏桿菌RA ATCCΔRA0C-1193

構(gòu)建重組質(zhì)粒：在NCBI上查找RA ATCC11845株的RA0C-1193基因(約861bp)，序列如SEQ ID NO.4所示：然后設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物，具體引物如下：

p1：5’-catgccatggatgagccaaaccataaatac-3’(SEQ ID NO.5)，下劃線(xiàn)表示NcoI；

p2：5’-ctagtctagattagaaagtgattttgtaagtgcctg-3’(SEQ ID NO.6)下劃線(xiàn)表示XbaI；

然后以鴨疫里默氏桿菌ATCC11845基因組為模板，p1和p2為引物擴(kuò)增目的基因片段，PCR擴(kuò)增程序如下：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；再72℃后延伸10min；最后16℃保存；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得約861bp大小條帶，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小相符。

用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XbaI酶切質(zhì)粒pLMF03和目的基因片段，回收酶切產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物成功回收。

用T4連接酶連接載體片段pLMF03與目的基因片段，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，從轉(zhuǎn)化長(zhǎng)出來(lái)的單克隆菌落隨機(jī)挑取6個(gè)進(jìn)行PCR鑒定。以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6為特異性引物，ATCC11845野生株為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；再72℃后延伸10min，最后16℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，隨機(jī)選取的6個(gè)轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出了目的基因。使用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自天根)提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，然后用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XbaI鑒定，結(jié)果圖6所示。

受體菌的制備：首先從-80℃取出鴨疫里默氏桿菌RA ATCCΔRA0C-1193(RA ATCC ΔRA0C-1193菌株參見(jiàn)Liao H B,Cheng X J,Zhu D K,et al.TonB energy transduction systems of Riemerella anatipestifer are required for iron and hemin utilization[J].PloS one,2015,10(5):e0127506)，在血平板上復(fù)蘇，待其生長(zhǎng)起來(lái)后，用接種環(huán)挑取單克隆菌落接種至10ml液體GCB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜；將其調(diào)整為OD600＝1，并加入5mM MgCl₂混勻備用。

自然轉(zhuǎn)移：準(zhǔn)備兩個(gè)1.5ml無(wú)菌離心管，一個(gè)作為實(shí)驗(yàn)組，一個(gè)作為對(duì)照組，分別加入300μl(含5mM MgCl₂)上述菌液，其中實(shí)驗(yàn)組加入1μg的重組質(zhì)粒，對(duì)照組不加。封口膠密封并置于37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘；取出孵育30分鐘的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別向其中加入700μl含有5mM MgCl₂的GCB培養(yǎng)基，即定容至1ml，封口膠密封，37℃培養(yǎng)箱孵育7小時(shí)。

從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取出100μl菌液，分別用一次性涂布棒涂在含頭孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)和壯觀霉素(80μg/ml)(Spectinomycin，SPC)的GCB固體培養(yǎng)基上；將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h至單克隆長(zhǎng)出。

陽(yáng)性結(jié)合子的篩選及鑒定：培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)在含頭孢西丁抗性和壯觀霉素抗性的培養(yǎng)基上實(shí)驗(yàn)組均長(zhǎng)出了明顯的單克隆菌落，而對(duì)照組沒(méi)有，隨機(jī)挑取5個(gè)單克隆分離在新的抗性的GCB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜；以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3為模板PCR擴(kuò)增目的基因cfxA，并以質(zhì)粒pMM47為陽(yáng)性對(duì)照，ATCC11845野生株為陰性對(duì)照。

PCR擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循環(huán)30次；再72℃后延伸8min；最后16℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，5個(gè)轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出cfxA，表明重組質(zhì)粒能夠成功導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌ATCC11845。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種快速回補(bǔ)鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法

<160> 7

<210> 1

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cfxA部分序列

<400> 1

ggtgctgcaa tgttgatgaa tcgtttgttt actgaaggtc ttatcgatga tgagaaacaa 60

agtttcatta agaatacgtt aaaagaatgc aaaacaggtg tagataggat agcagctcca 120

cttcttgata aagaaggggt tgttatagcg cataagacag gttcaggtta tgttaatgaa 180

aatggtgttc ttgcagctca caatgatgtt gcctatatat gtctgcctaa taatatcagt 240

tataccttag cgg 253

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物cfx p1

<400> 2

ggtgctgcaa tgttgatg 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物cfx p2

<400> 3

ccgctaaggt ataactg 17

<210> 4

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RA0C_1193基因序列

<400> 4

atgagccaaa ccataaatac atcggaaaga aaagaccaaa tcaaaagtgc catcatcaca 60

tttttgatta gccttttggt attcttagct ttgtattttt attcgtttac tagagaactt 120

ccaaaggagg aagtcgtaag cacgatgctc atcaattttg gagaccaaaa cgagggtaac 180

ctgcctgaag aaccccaaaa ccaagagggc agtctatccg ccaccgaagc acctacacca 240

atacaagaaa tacaacctac acctgtagaa cctcagccca aaaaagaagt ggtaaaggag 300

aaaattatca cagggcaaaa taccaaaaca agtgctgaaa aggtggaaaa agtaacctct 360

aaacctacaa aagaaagcac agcaaacacc caaaagaaag aaaccacgac acctaaaaaa 420

agcagtacca ctacacaaaa taaaaccgtg accaaccaag gtgatggcag aggtaacgag 480

gctattggca acctcatcag agggcgaggt gccaacaaag gagctcaagg aaactcccaa 540

aacacttccg gcaattcagg agacccacta ggtggcgata gcaatggcga tagtaaaatc 600

ggcatagacc gaaagttaat cggatttata cctggaacta tggggcgtgg tggttcacag 660

ccgacccacc agtgttctgc ctcaggcacc attagcatct cttatgtggt agataaagcg 720

ggcaatgtaa tttcggctag acgaagtggc ggtattacag acccttgtgc cgtaaacaca 780

accatagagt gggtaaagaa atatgtaaaa gcagaaagag ctagcacttc ttctacaggc 840

acttacaaaa tcactttcta a 861

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物p1

<400> 5

catgccatgg atgagccaaa ccataaatac 30

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物p2

<400> 6

ctagtctaga ttagaaagtg attttgtaag tgcctg 36

<210> 7

<211> 6733

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLMF03質(zhì)粒序列

<400> 7

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 60

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 120

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 180

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 240

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 300

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 360

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 420

ttgggctatt taggcattag ccctcttttt aacctgactt aaaaaataat taaatcataa 480

gatattaaat atcaagtgat tatgatttac tatgctatac ataatatcac ccagtgttag 540

aaaattcttg ctatgctttt tgtttgtttt ttttcattcg tgaactttta gaatactttt 600

aaaataaact caaatttata aactattgat tttcaatatt atacaaaacc aaacttatta 660

acattaaact tatttctatt acctttaaaa taaactacta aaagacaaat ctaccaatcc 720

tcggaactat ttaataaata ggaagttata taaaaataat gaacttttag aatactttat 780

tagtcttttt agctccaaaa atgaactttt agaatacttt ttttgaactt ttagaatact 840

tttttaaact tgctttttag taagttcatt ttttatatat ttgtattcta aaagtgcatt 900

ttatattcat aactctctat atatggcaaa agtagataat aaactaatgt ttcagtccta 960

tatttttact acggctaaat atgatttttc agtctatgaa aagcgtatac tatataggca 1020

aatagaaata gaacaggcat tgctaaataa tgaggcgttg aaagattgta tcaaaataga 1080

tactaaccta tggggggata aaaaatatac aattccaatt tctatgctgt tagctaatga 1140

tgaagataaa aattattata aaattaaaaa agcattcaaa gacctaaaat caaagaacat 1200

tgagtacgaa gatgaaaaag aatacgcttg ctttggtgtt attgataagt tttggattga 1260

taaatatgga agaaatgtta cttggcaatc tgacaaaaga attgttgaag cggtaatgga 1320

ttttacaaga ggatggagaa aatatgaatt gaagattgct atgcagtttg agactattta 1380

tgcaatgcgt ttttacgaac tgatagctaa taaaaccaaa ccaataacat atgaagtgtc 1440

atttcttgaa aaaatgtttc aattggaaaa taagtacagg aaccctcagg gtaatcttaa 1500

tatcagtatg tttaaacgcc gtgtattaga ccccgctaaa aacgagttag ataaatgttc 1560

tccatacact tttgattata ctctttcaaa ggataaaaaa attatttctc taattcctat 1620

tttccaagaa caatttgcag atgaaagtat gaagatgatc aaaatagaag aggaaaaaga 1680

tatacactct gtattaactc aaagagaaat tgatgttttt acaaacgaat ttggttttac 1740

acaacaaggt ttattaaaca actatgccct attcaaagat tgtaaggcta cacttccatc 1800

aaactattct ttcttccttt ttcaagagat aagaaaaagt cggactaaga aaggaaaaat 1860

atctcctgct tatgtgattg ggattataag aaatatgctt aaagatttca aaaaagaaca 1920

acaataggct tatgaaaaaa tatacaacaa aagaaatcgc agagcttttt ggcgtcagcg 1980

aacggacaat ccagcgacac ataacgacac taagcgacaa catatcaaat accgacagaa 2040

agggcttttc aataccagaa gacattgttt tctttcttgc cgagcgacac cattacgaca 2100

ttttagcgac aacgaacgac aacgaacgac aggataaaaa tgaagaattt cctcatattg 2160

aatacttcac agaagaggaa taccaagagt ttaaaaaaag gatcacagag tacccttttt 2220

tgaaagagca aattaaactg tctaatgaac atttggatac tctaaaaaca caaatagaat 2280

atttcagact atcttacaat aagcaattgg atattcacga aaaattaatc ggagcgttcc 2340

gagaaagaaa ctttattgaa gctaaagaaa aggggatgga taaatagctc ctaataatta 2400

aagaagtatt agaaaaaaaa tgctatataa aaacttaatc gagctctata cgagatctgt 2460

tccaatgcat tggctgcagg tcgacatttc aaaaatttaa cttaaaccac tgatttacaa 2520

aaatgtttat ttgcaaaact attttacaaa gatattacaa taatttttct agcacaaatt 2580

tatttctcac catatctttg ccttgttcaa gtgagtgaac agagtaacaa acaaaaaaag 2640

aaacaaattt aaaaaaatta tttaaaattc catggctcta gaactcgagc atcatcatca 2700

tcatcattga actagtggag ttgcttctct tttcgggagt ggaaaactga aagaactgga 2760

acgtgccaac gaaaaactgc aagacgaggt ttcaaaacgg aacaccaata ttgaaaaatt 2820

gcagagccaa gtacagcaga tgcagaaaca gcatgatacg caaatccaca atctcagaga 2880

aatgcacagg caggaacttg acatgaaaga aaaagaactg tcacggctcg ccagaatcat 2940

agacaaggct ttcaggtggt ttccgatgtt cagggaaatg ctgcgcatgg aaaagttttg 3000

tgccatgctg ggattctcta aagaaatgac tgaaagtctt atagtcaaaa aagaagccct 3060

gaaatgtagc ggtaaaatct attccgagca acacaggcgg aactttgata taaaggatga 3120

tattttaagg gtggaaaatg accctgacga tgaaagcagg ctgaacctga caataaacag 3180

gaagccgatt gccgactggt tcagggagca atggcacagg cttagatatg gagcaagagt 3240

gccgcaacag gaagaaagaa aaagtagagg attcaaatta taatagaagc aatttgatta 3300

gtaatctaaa agcactccga taacgattag agtgctttta gattgtttat cattaattat 3360

caaagcaagt gcagtttaag attttactga agtttgcatt aataaagaat atactacagc 3420

tgatatatgc gcaacatatt gtgacgcttg tgatttattt cccttgaaat ccttaacaaa 3480

taccgctaag gtataactga tattattagg cagacatata taggcaacat cattgtgagc 3540

tgcaagaaca ccattttcat taacataacc tgaacctgtc ttatgcgcta taacaacccc 3600

ttctttatca agaagtggag ctgctatcct atctacacct gttttgcatt cttttaacgt 3660

attcttaatg aaactttgtt tctcatcatc gataagacct tcagtaaaca aacgattcat 3720

caacattgca gcaccaagag gagatgtata gttagagtaa gccttgttat ggtcagccga 3780

catttcctct tccgtataag ctatctgaaa acttgaacga ggaatgagtg tggctataaa 3840

actatctgtt tgagcgacat taaccatatc cttaaacata aggttgcttg cattgttgtc 3900

actctgagta agagtataac gcagcaaatc tctcactgtc aatgatatga ctggccctga 3960

ataatctttc agcataggac tccaagtctt tgggtcaagt ttatccctat ttatatttac 4020

taaggtatca agtgaaattc ctttattgtc aaagtcatta caaagagcta atgcctgatg 4080

aaccttaaac acactcatca taggataaac actcttatta ttgaccttaa ccgtatctct 4140

gttattaaca ataaccgcca caccaatttc gccaggacaa gctgagacaa tttgagaaat 4200

gctatcagtc aaaacatttg ttaaaggagg atttgcgcta tcttttgtcg ctgatttatg 4260

gaacaatgaa aataccaaga tgaaaatgca aactaaagct atactcaaaa ctacgatttg 4320

tttttttctg tttttttcca tgttttatat tatttatatt tgtttgacga gaatatcttt 4380

atttgccgac aaaggtacat aactaaagtt tcccacccaa ataaatagat agaaaaataa 4440

cagtttgtcg aattttcttt gtaaattagt aatcgctaaa gaactgattt tggggatccc 4500

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gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 4680

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 4740

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 4800

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aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 4980

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atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 5100

tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 5160

gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 5220

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gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 5340

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tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 5460

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catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 5640

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atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 6060

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gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 6480

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gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 6660

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cggagcctat gga 6733