技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及一種特異探測(cè)膀胱癌細(xì)胞的分子遺傳裝置。

背景技術(shù)：

在我國(guó)，膀胱癌發(fā)病率和死亡率均居泌尿系統(tǒng)腫瘤首位。美國(guó)腫瘤協(xié)會(huì)2011年的統(tǒng)計(jì)資料顯示，全世界每年新增膀胱癌患者38萬，死亡人數(shù)15萬。近十多年來，膀胱癌發(fā)病有逐年上升和年輕化等趨勢(shì)。許多患者就診時(shí)已屬中晚期，缺乏有效治療手段，預(yù)后差，死亡率高。膀胱移行上皮細(xì)胞癌占膀胱癌的90％以上，其分為非肌層浸潤(rùn)性和肌層浸潤(rùn)性，前者易發(fā)生復(fù)發(fā)，主要采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)進(jìn)行治療，術(shù)后輔以膀胱灌注治療，減少復(fù)發(fā)；后者易發(fā)生轉(zhuǎn)移，主要采用根治性膀胱切除術(shù)進(jìn)行治療，術(shù)后輔以化療或放療。膀胱癌轉(zhuǎn)移是患者的主要死因。骨盆淋巴結(jié)是膀胱癌轉(zhuǎn)移的首選部位，其次為肺、骨、肝臟和腦組織。膀胱癌發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的中位生存時(shí)間為12-15個(gè)月?；熓峭砥诎螂装┲委煹闹饕侄危熜Р患?，不能顯著延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。

基因治療，尤其近年來發(fā)展起來的分子靶向治療，曾是晚期膀胱癌治療的希望，但是存在諸多難以突破的技術(shù)瓶頸，如靶向性差、殺傷效果不穩(wěn)定、安全性隱患等，嚴(yán)重限制了該技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用。因此，探索特異、高效和副作用小的新型生物靶向治療方法，對(duì)于膀胱癌的治療具有非常重要的意義。

CRISPR Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌利用來保護(hù)自身免受外來病毒和核酸侵襲的細(xì)胞機(jī)器。當(dāng)細(xì)菌受到噬菌體感染后，CRISPR RNA就能通過互補(bǔ)序列結(jié)合噬菌體DNA序列，并表達(dá)Cas9——一種核酸切割酶，能切割噬菌體DNA，沉默其基因表達(dá)。CRISPR Cas9系統(tǒng)目前已被開發(fā)成為新一代基因組編輯技術(shù)，為修復(fù)突變DNA提供了一條簡(jiǎn)單的途經(jīng)，有潛力用于治療許多的遺傳基因疾病。將CRISPR/Cas系統(tǒng)用于真核細(xì)胞需要滿足兩個(gè)條件：一個(gè)是表達(dá)Cas9酶，用于切斷靶標(biāo)DNA；另外一個(gè)就是稱為引導(dǎo)RNA的RNA分子，這種分子能通過堿基配對(duì)與靶標(biāo)互補(bǔ)結(jié)合。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新的特異探測(cè)膀胱癌細(xì)胞的分子遺傳裝置，包括：

質(zhì)粒hUPII-pSpCas9；

質(zhì)粒hTERT-gRNA-BAM；

質(zhì)粒pRL-SV40-LacI；

質(zhì)粒pcDNA3-LacO-hRluc；

質(zhì)粒pcDNA3-LacO-E-cadherin。

將hUPII啟動(dòng)子片段插入質(zhì)粒Cbh-3X-FLAG-NLS-SpCas9-NLS的XbaI/AgeI位點(diǎn)，而構(gòu)建所述質(zhì)粒hUPII-pSpCas9。

將hTERT啟動(dòng)子和核酸酶序列圍繞的引導(dǎo)RNA分子分別插入質(zhì)粒pCMVp-NEO-BAM的XbaI/Sal I和Sal I/BamH I位點(diǎn)，而構(gòu)建所述質(zhì)粒hTERT-gRNA-BAM。

將lacI基因序列插入質(zhì)粒pRL-SV40的NheI/XbaI位點(diǎn)，而構(gòu)建所述質(zhì)粒pRL-SV40-LacI。

將lac操縱子序列和hRluc基因分別插入質(zhì)粒pcDNA3的Hind III/Kpn I和BamH I/EcoR I位點(diǎn)，而構(gòu)建所述質(zhì)粒pcDNA3-LacO-hRluc。

將人E-cadherin cDNA序列插入pcDNA3-LacO-hRluc的BamH I/EcoR I位點(diǎn)，而構(gòu)建所述質(zhì)粒pcDNA3-LacO-E-cadherin。

分子遺傳裝置的構(gòu)建基于CRISPR-Cas9技術(shù)，該裝置可以包含邏輯“與”門遺傳線路。分子遺傳裝置整合了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的腫瘤特異性啟動(dòng)子和人uroplakin基因的膀胱特異性啟動(dòng)子。該裝置基于來自這兩個(gè)啟動(dòng)子的輸入信息，并只在它們均有高轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞中激活輸出端基因的CMV啟動(dòng)子(該啟動(dòng)子在一般情況下被lacI抑制)。

當(dāng)且僅在膀胱癌細(xì)胞(同時(shí)具有高轉(zhuǎn)錄活性的hTERT和hUPII啟動(dòng)子)中，Cas9系統(tǒng)能有效工作并沉默阻遏蛋白lac I的表達(dá)，從而激活效應(yīng)基因的表達(dá)。

上述質(zhì)粒的混合物與轉(zhuǎn)染試劑形成質(zhì)粒/轉(zhuǎn)染試劑混合物。轉(zhuǎn)染試劑如Lipofectamin 2000。質(zhì)粒/轉(zhuǎn)染試劑混合物進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)和細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)。

所述lacI基因序列如SEQ ID NO:1所示。

所述膀胱癌細(xì)胞如T24、5637、J82或SW-780。

本發(fā)明的有益效果是：分子遺傳裝置能夠有效特異控制膀胱癌細(xì)胞并顯著影響其惡性生物學(xué)行為，并能夠有效檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞并增強(qiáng)熒光素酶基因的表達(dá)，便于科學(xué)研究。

附圖說明

圖1是分子遺傳裝置的工作原理示意圖；

圖2是lacI靶序列和所設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA序列示意圖；

圖3是熒光素酶檢測(cè)結(jié)果圖，其中，橫坐標(biāo)依次表示膀胱癌細(xì)胞系T24、膀胱癌細(xì)胞系5637、膀胱癌細(xì)胞系SW-780、膀胱癌細(xì)胞系J82、HEK-293T(人胚腎臟細(xì)胞)、HeLa(宮頸癌細(xì)胞)、A549(肺癌細(xì)胞)、PC-3(前列腺癌細(xì)胞)、GC-1(精母細(xì)胞)、GC-2(精母細(xì)胞)和Fibroblast(人成纖維上皮細(xì)胞)，對(duì)于每個(gè)細(xì)胞，左邊方柱指本發(fā)明分子遺傳裝置，右側(cè)方柱指hTERT-Rluc載體；SC-1指僅在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)熒光素酶的分子遺傳裝置；

圖4是細(xì)胞劃痕檢測(cè)結(jié)果圖，其中，A～K依次表示膀胱癌細(xì)胞系T24、膀胱癌細(xì)胞系5637、膀胱癌細(xì)胞系SW-780、膀胱癌細(xì)胞系J82、HEK-293T(人胚腎臟細(xì)胞)、HeLa(宮頸癌細(xì)胞)、A549(肺癌細(xì)胞)、PC-3(前列腺癌細(xì)胞)、GC-1(精母細(xì)胞)、GC-2(精母細(xì)胞)和人成纖維上皮細(xì)胞，對(duì)于每個(gè)細(xì)胞，上面表示0小時(shí)取樣結(jié)果，下面表示24小時(shí)取樣結(jié)果，從左至右，第一個(gè)表示SC-1，第三個(gè)表示pcDNA3-hTERT-E-cadherin。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

技術(shù)與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

膀胱癌細(xì)胞系T24、J82、5637、SW-780和HEK-293T(人胚腎臟細(xì)胞)、HeLa(宮頸癌細(xì)胞)、A549(肺癌細(xì)胞)、PC-3(前列腺癌細(xì)胞)、GC-1(精母細(xì)胞)和GC-2(精母細(xì)胞)購自American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,USA)，人成纖維上皮細(xì)胞由發(fā)明人分離培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液由90％的DMEM(Invitrogen,CA)，10％的胎牛血清(Invitrogen)，1％-2％的谷氨酰胺和0.5％-1％的雙抗配成。

2.分子遺傳裝置的構(gòu)建

質(zhì)粒hUPII-pSpCas9(PX165)的構(gòu)建過程如下：將hUPII啟動(dòng)子片段插入質(zhì)粒Cbh-3X-FLAG-NLS-SpCas9-NLS(從Addgene獲得，Addgene是全球科學(xué)家質(zhì)粒共享非盈利組織)的XbaI/AgeI位點(diǎn)。

質(zhì)粒hTERT-gRNA-BAM的構(gòu)建過程如下：將hTERT啟動(dòng)子和核酸酶序列圍繞的引導(dǎo)RNA分子分別插入質(zhì)粒pCMVp-NEO-BAM(從Addgene獲得)的XbaI/Sal I和Sal I/BamH I位點(diǎn)。

質(zhì)粒pRL-SV40-LacI的構(gòu)建過程如下：將lacI基因序列插入質(zhì)粒pRL-SV40(從Promega公司獲得)的NheI/XbaI位點(diǎn)。

質(zhì)粒pcDNA3-LacO-hRluc的構(gòu)建過程如下：將lac操縱子序列和hRluc基因分別插入質(zhì)粒pcDNA3(從Addgene獲得)的Hind III/Kpn I和BamH I/EcoR I位點(diǎn)。

質(zhì)粒pcDNA3-LacO-E-cadherin的構(gòu)建過程如下：將人E-cadherin cDNA序列插入pcDNA3-LacO-hRluc的BamH I/EcoR I位點(diǎn)。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天，4-5×10⁴個(gè)細(xì)胞接種在24孔板上，加入0.5ml培養(yǎng)基，放在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)。生長(zhǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞匯合度達(dá)到70％，在50ul的無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入1ug重組質(zhì)粒的混合物，柔和混勻。在50ul無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入1ul Lipofectamin2000(Invitrogen,CA)試劑，輕輕混勻，室溫放置5min。將稀釋好的質(zhì)粒和Lipo2000輕柔混勻，室溫放置20分鐘，以便形成質(zhì)粒/lipofectamin混合物。將質(zhì)粒/lipofectamin混合物加入24孔板內(nèi)，輕柔搖晃24孔板。放入培養(yǎng)箱內(nèi)，4-6小時(shí)后更換培養(yǎng)基。

4.熒光素酶活性檢測(cè)

用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測(cè)樣品Luciferase活性。按上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，吸去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗洗兩次，每孔細(xì)胞加入100μl的Passive Lysis Buffer(PLB)，室溫輕微振搖15min。收集細(xì)胞裂解液于1.5ml Eppendorf管中；向Eppendorf管中加入100μl的Luciferase Assay Reagent II(LAR II)；將細(xì)胞裂解液12,000g離心1min，取上清50μl加入1.5ml Eppendorf管中并吹打均勻：用閱讀儀測(cè)量可見光強(qiáng)度l0s(此時(shí)所讀光為psiCHECK2載體上轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生的螢火蟲Luciferase所發(fā)出的)；取出Eppendorf管，加入100μl Stop&Glo Reagent，吹打均勻；用閱讀儀測(cè)量可見光強(qiáng)度10s(此時(shí)所讀光為psiCHECK2載體上轉(zhuǎn)錄翻譯出的海腎Luciferase所發(fā)出的)將所得到的數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行分析。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

5.細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)

細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力由細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著，均勻得劃?rùn)M線，大約每隔0.5～1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37度5％CO₂培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，24小時(shí)取樣，拍照。細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用x±s表示。兩組間比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)以P<0.05表示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.分子遺傳裝置的構(gòu)建

基于CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)包含邏輯“與”門遺傳線路的分子裝置(如圖1所示)，該裝置整合了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)的腫瘤特異性啟動(dòng)子和人uroplakin基因的膀胱特異性啟動(dòng)子。該裝置基于來自這兩個(gè)啟動(dòng)子的輸入信息，并只在它們均有高轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞中激活輸出端基因的CMV啟動(dòng)子(該啟動(dòng)子在一般情況下被lacI抑制)。啟動(dòng)子的信息整合是通過Cas9蛋白和靶向lacI基因的引導(dǎo)RNA的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。該引導(dǎo)RNA和其lacI靶序列的分子序列如圖2所示。lacI的序列是GAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGA(SEQ ID NO:1)。引導(dǎo)RNA(sgRNA)的序列如圖2所示。

2.該裝置特異性識(shí)別膀胱癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

當(dāng)效應(yīng)基因被選取為luciferase基因時(shí)，熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該裝置僅在膀胱癌細(xì)胞T24、5637、J82和SW-780中激活熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)(如圖3所示)。這些結(jié)果提示該分子遺傳裝置能有效檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞并增強(qiáng)熒光素酶基因的表達(dá)(與hTERT-Rluc載體相比)。

3.該裝置特異性控制膀胱癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證當(dāng)效應(yīng)基因被選取為E-cadherin時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該裝置僅在膀胱癌細(xì)胞T24、5637、J82和SW-780中抑制細(xì)胞的遷移(如圖4所示)。這些結(jié)果提示該分子遺傳裝置能有效特異控制膀胱癌細(xì)胞并顯著影響其惡性生物學(xué)行為(與hTERT-Rluc載體相比)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換。