本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及蘇氨酸衰減子的突變體及其應(yīng)用以及解除蘇氨酸操縱子反饋阻遏的方法。
背景技術(shù)：
：L-蘇氨酸(L-Threonine)的化學(xué)名稱為α-氨基-β-羥基丁酸，是人體八種必需氨基酸之一。作為生物大分子的基本構(gòu)成元件，蘇氨酸對人和動物的營養(yǎng)及健康具有重要的生理作用，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、以及醫(yī)藥行業(yè)，是三大大宗發(fā)酵類氨基酸之一。近年來，蘇氨酸的市場需求量逐年增長，其中飼料行業(yè)對蘇氨酸的市場需求量最大。蘇氨酸作為安全性飼料添加劑，是繼賴氨酸之后的豬生長的第二限制氨基酸，并且是家禽生長的第三限制氨基酸，僅次于賴氨酸和蛋氨酸。微生物發(fā)酵法是目前工業(yè)化生產(chǎn)蘇氨酸的主要方法。大腸桿菌從天冬氨酸合成蘇氨酸共需要五步酶催化反應(yīng)，其中四步反應(yīng)由蘇氨酸操縱子thrABC編碼的酶催化。大腸桿菌蘇氨酸操縱子的表達(dá)由衰減子(Attenuator)進(jìn)行翻譯水平上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，胞內(nèi)蘇氨酸和異亮氨酸對大腸桿菌蘇氨酸操縱子(thrABC)的協(xié)同阻遏作用導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄弱化。衰減子包含前導(dǎo)肽基因thrL和后續(xù)的終止子結(jié)構(gòu)，位于蘇氨酸操縱子的啟動子之后和thrA基因之前。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種蘇氨酸衰減子的突變體及其在蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明首先提供了一種解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因，自上游至下游依次包括元件甲和元件乙；所述元件甲如序列表的序列17第294至n1位核苷酸所示，n1為310以上336以下的自然數(shù)；所述元件乙為編碼蘇氨酸操縱子的基因。n1具體可為311或336。所述“解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因”中不含有序列表的序列17第1-293位核苷酸。所述“編碼蘇氨酸操縱子的基因”為編碼天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶復(fù)合體的基因、編碼高絲氨酸脫氫酶的基因和編碼蘇氨酸合成酶的基因。所述天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶復(fù)合體為ThrA蛋白(野生蛋白)或ThrA*蛋白(突變蛋白)。所述高絲氨酸脫氫酶為ThrB蛋白。所述蘇氨酸合成酶為ThrC蛋白。編碼ThrA蛋白的基因為thrA基因。編碼ThrA*蛋白的基因為thrA*基因。編碼ThrB蛋白的基因為thrB基因。編碼ThrC蛋白的基因為thrC基因。所述ThrA*蛋白為如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列18所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)將序列18的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶復(fù)合體功能的由序列18衍生的蛋白質(zhì)。所述thrA*基因為如下(a3)或(a4)或(a5)：(a3)編碼區(qū)如序列表中序列17第337-2799位核苷酸所示的DNA分子；(a4)在嚴(yán)格條件下與(a3)限定的DNA序列雜交且編碼天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶復(fù)合體的DNA分子；(a5)與(a3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶復(fù)合體的DNA分子。與ThrA蛋白相比，ThrA*蛋白只存在一個氨基酸殘基的差異，即第253位氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)榱私M氨酸。所述thrA基因為如下(a6)或(a7)或(a8)：(a6)編碼區(qū)如序列表中序列14第337-2799位核苷酸所示的DNA分子；(a7)在嚴(yán)格條件下與(a6)限定的DNA序列雜交且編碼天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶復(fù)合體的DNA分子；(a8)與(a6)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶復(fù)合體的DNA分子。所述ThrB蛋白為如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列19所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b2)將序列19的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有高絲氨酸脫氫酶功能的由序列19衍生的蛋白質(zhì)。所述thrB基因為如下(b3)或(b4)或(b5)：(b3)編碼區(qū)如序列表中序列17第2801-3733位核苷酸所示的DNA分子；(b4)在嚴(yán)格條件下與(b3)限定的DNA序列雜交且編碼高絲氨酸脫氫酶的DNA分子；(b5)與(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼高絲氨酸脫氫酶的DNA分子。所述ThrC蛋白為如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列20所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c2)將序列20的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有蘇氨酸合成酶功能的由序列20衍生的蛋白質(zhì)。所述thrC基因為如下(c3)或(c4)或(c5)：(c3)編碼區(qū)如序列表中序列17第3734-5020位核苷酸所示的DNA分子；(c4)在嚴(yán)格條件下與(c3)限定的DNA序列雜交且編碼蘇氨酸合成酶的DNA分子；(c5)與(c3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼蘇氨酸合成酶的DNA分子。所述“解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因”為如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)：(d1)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列17第294至336位核苷酸、序列表的序列17第337-2799位核苷酸、序列表的序列17第2801-3733位核苷酸、序列表的序列17第3734-5020位核苷酸；(d2)序列表的序列17第294-5020位核苷酸所示的DNA分子；(d3)序列表的序列17第294-5132位核苷酸所示的DNA分子；(d4)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列14第294至336位核苷酸、序列表的序列14第337-2799位核苷酸、序列表的序列14第2801-3733位核苷酸、序列表的序列14第3734-5020位核苷酸；(d5)序列表的序列14第294-5020位核苷酸所示的DNA分子。本發(fā)明還保護(hù)一種特異DNA分子，自上游至下游依次包括啟動子和以上任一所述的“解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因”。所述啟動子具體可為強啟動子，例如L啟動子、trc啟動子、T5啟動子、lac啟動子、tac啟動子或T7啟動子。所述啟動子具體可為啟動子PPL。啟動子PPL為如下(e1)或(e2)或(e3)：(e1)序列表中序列13所示的DNA分子；(e2)在嚴(yán)格條件下與(e1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；(e3)與(e1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。所述特異DNA分子具體可為如下(f1)或(f2)：(f1)自上游至下游依次包括如下元件：啟動子和所述“解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因”；(f2)自上游至下游依次由如下元件組成：啟動子、限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列和所述解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因。本發(fā)明還保護(hù)含有以上任一所述“解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因”的重組質(zhì)粒甲。所述重組質(zhì)粒甲具體可為在出發(fā)質(zhì)粒的多克隆位點插入所述“解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因”得到的重組質(zhì)粒。所述出發(fā)質(zhì)粒為低拷貝、中拷貝或高拷貝數(shù)質(zhì)粒，例如pSC101、pACYC184、pBR322或pTrc99a。所述出發(fā)質(zhì)粒具體可為質(zhì)粒pACYC184。本發(fā)明還保護(hù)含有以上任一所述特異DNA分子的重組質(zhì)粒乙。所述重組質(zhì)粒乙具體可為在出發(fā)質(zhì)粒的多克隆位點插入所述特異DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述出發(fā)質(zhì)粒為低拷貝、中拷貝或高拷貝數(shù)質(zhì)粒，例如pSC101、pACYC184、pBR322或pTrc99a。所述出發(fā)質(zhì)粒具體可為質(zhì)粒pACYC184。所述出發(fā)質(zhì)粒具體可為質(zhì)粒pACYC184。所述重組質(zhì)粒乙更具體可為在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和EcoRV酶切位點之間插入所述特異DNA分子得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)含有以上任一所述“解除阻遏的蘇氨酸操縱子基因”的重組菌甲。所述重組菌甲具體可為將所述重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入出發(fā)菌得到的重組菌。本發(fā)明還保護(hù)含有以上任一所述特異DNA分子的重組菌乙。所述重組菌乙具體可為將所述重組質(zhì)粒乙導(dǎo)入出發(fā)菌得到的重組菌。以上任一所述出發(fā)菌具體可為大腸桿菌，例如大腸桿菌K-12或其衍生菌株。以上任一所述出發(fā)菌更具體可為以大腸桿菌K12W3110為出發(fā)菌株，抑制metA基因、ilvA基因、lysA基因、tdh基因、tdcC基因和sstT基因表達(dá)得到的菌株。所述metA基因為編碼高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(MetA蛋白)的基因。所述MetA蛋白為如下(g1)或(g2)：(g1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(g2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。所述metA基因為如下(g3)或(g4)或(g5)或(g6)：(g3)編碼區(qū)如序列表中序列1第752-1681位核苷酸所示的DNA分子；(g4)序列表中序列1所示的DNA分子；(g5)在嚴(yán)格條件下與(g3)或(g4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；(g6)與(g3)或(g4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。所述ilvA基因為編碼蘇氨酸脫氨酶(IlvA蛋白)的基因。所述IlvA蛋白為如下(h1)或(h2)：(h1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(h2)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。所述ilvA基因為如下(h3)或(h4)或(h5)或(h6)：(h3)編碼區(qū)如序列表中序列3第638-2182位核苷酸所示的DNA分子；(h4)序列表中序列3所示的DNA分子；(h5)在嚴(yán)格條件下與(h3)或(h4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；(h6)與(h3)或(h4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。所述lysA基因為編碼二氨基庚二酸脫羧酶(LysA蛋白)的基因。所述LysA蛋白為如下(i1)或(i2)：(i1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(i2)將序列6的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列6衍生的蛋白質(zhì)。所述lysA基因為如下(i3)或(i4)或(i5)或(i6)：(i3)編碼區(qū)如序列表中序列5第639-1901位核苷酸所示的DNA分子；(i4)序列表中序列5所示的DNA分子；(i5)在嚴(yán)格條件下與(i3)或(i4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；(i6)與(i3)或(i4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。所述tdh基因為編碼蘇氨酸脫水酶(Tdh蛋白)的基因。所述Tdh蛋白為如下(j1)或(j2)：(j1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(j2)將序列8的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列8衍生的蛋白質(zhì)。所述tdh基因為如下(j3)或(j4)或(j5)或(j6)：(j3)編碼區(qū)如序列表中序列7第753-1778位核苷酸所示的DNA分子；(j4)序列表中序列7所示的DNA分子；(j5)在嚴(yán)格條件下與(j3)或(j4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；(j6)與(j3)或(j4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。所述tdcC基因為編碼蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運蛋白(TDCC蛋白)的基因。所述TDCC蛋白為如下(k1)或(k2)：(k1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(k2)將序列10的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列10衍生的蛋白質(zhì)。所述tdcC基因為如下(k3)或(k4)或(k5)或(k6)：(k3)編碼區(qū)如序列表中序列9第701-2032位核苷酸所示的DNA分子；(k4)序列表中序列9所示的DNA分子；(k5)在嚴(yán)格條件下與(k3)或(k4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；(k6)與(k3)或(k4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。所述sstT基因為編碼蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運蛋白(SstT蛋白)的基因。所述SstT蛋白為如下(m1)或(m2)：(m1)由序列表中序列12所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(m2)將序列12的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列12衍生的蛋白質(zhì)。所述sstT基因為如下(m3)或(m4)或(m5)或(m6)：(m3)編碼區(qū)如序列表中序列11第701-1945位核苷酸所示的DNA分子；(m4)序列表中序列11所示的DNA分子；(m5)在嚴(yán)格條件下與(m3)或(m4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；(m6)與(m3)或(m4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。以上任一所述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。以上任一所述出發(fā)菌更具體可為以大腸桿菌K12W3110為出發(fā)菌株，敲除如下六個基因區(qū)段得到的菌株：metA基因的開放閱讀框(序列表的序列1第752-1681位核苷酸)；ilvA基因的開放閱讀框(序列表的序列3第638-2182位核苷酸)；lysA基因的開放閱讀框(序列表的序列5第639-1901位核苷酸)；tdh基因的開放閱讀框(序列表的序列7第753-1778位核苷酸)；tdcC基因的如下區(qū)段：序列9中第701-1852位核苷酸；sstT基因的如下區(qū)段：序列11中第697-1759位核苷酸。敲除metA基因的開放閱讀框具體是通過導(dǎo)入干擾片段Ⅰ或干擾質(zhì)粒Ⅰ實現(xiàn)的。干擾片段Ⅰ自上游至下游依次由序列表的序列1第245-751位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列1第1682-2154位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。干擾質(zhì)粒Ⅰ為具有干擾片段Ⅰ的重組質(zhì)粒。干擾質(zhì)粒Ⅰ具體可為在pKOV質(zhì)粒的多克隆位點(例如SalI和NotI酶切位點之間)插入干擾片段Ⅰ得到的重組質(zhì)粒。敲除ilvA基因的開放閱讀框具體是通過導(dǎo)入干擾片段Ⅱ或干擾質(zhì)粒Ⅱ?qū)崿F(xiàn)的。干擾片段Ⅱ自上游至下游依次由序列表的序列3第140-637位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列3第2183-2712位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。干擾質(zhì)粒Ⅱ為具有干擾片段Ⅱ的重組質(zhì)粒。干擾質(zhì)粒Ⅱ具體可為在pKOV質(zhì)粒的多克隆位點(例如BamHI和NotI酶切位點之間)插入干擾片段Ⅱ得到的重組質(zhì)粒。敲除lysA基因的開放閱讀框具體是通過導(dǎo)入干擾片段Ⅲ或干擾質(zhì)粒Ⅲ實現(xiàn)的。干擾片段Ⅲ自上游至下游依次由序列表的序列5第132-638位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列5第1902-2445位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。干擾質(zhì)粒Ⅲ為具有干擾片段Ⅲ的重組質(zhì)粒。干擾質(zhì)粒Ⅲ具體可為在pKOV質(zhì)粒的多克隆位點(例如BamHI和NotI酶切位點之間)插入干擾片段Ⅲ得到的重組質(zhì)粒。敲除tdh基因的開放閱讀框具體是通過導(dǎo)入干擾片段Ⅳ或干擾質(zhì)粒Ⅳ實現(xiàn)的。干擾片段Ⅳ自上游至下游依次由序列表的序列7第227-752位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列7第1779-2271位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。干擾質(zhì)粒Ⅳ為具有干擾片段Ⅳ的重組質(zhì)粒。干擾質(zhì)粒Ⅳ具體可為在pKOV質(zhì)粒的多克隆位點(例如BamHI和NotI酶切位點之間)插入干擾片段Ⅳ得到的重組質(zhì)粒。敲除“tdcC基因的如下區(qū)段：序列9中第701-1852位核苷酸”是通過導(dǎo)入干擾片段Ⅴ或干擾質(zhì)粒Ⅴ實現(xiàn)的。干擾片段Ⅴ自上游至下游依次由序列表的序列9第176-700位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列9第1853-2388位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。干擾質(zhì)粒Ⅴ為具有干擾片段Ⅴ的重組質(zhì)粒。干擾質(zhì)粒Ⅴ具體可為在pKOV質(zhì)粒的多克隆位點(例如BamHI和NotI酶切位點之間)插入干擾片段Ⅴ得到的重組質(zhì)粒。敲除“sstT基因的如下區(qū)段：序列11中第697-1759位核苷酸”是通過導(dǎo)入干擾片段Ⅵ或干擾質(zhì)粒Ⅵ實現(xiàn)的。干擾片段Ⅵ自上游至下游依次由序列表的序列11第14-696位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列11第1760-2240位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。干擾質(zhì)粒Ⅵ為具有干擾片段Ⅵ的重組質(zhì)粒。干擾質(zhì)粒Ⅵ具體可為在pKOV質(zhì)粒的多克隆位點(例如BamHI和NotI酶切位點之間)插入干擾片段Ⅵ得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)所述重組菌甲在生產(chǎn)蘇氨酸(例如L-蘇氨酸)中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)所述重組菌乙在生產(chǎn)蘇氨酸(例如L-蘇氨酸)中的應(yīng)用。應(yīng)用所述重組菌生產(chǎn)蘇氨酸時，采用葡萄糖作為碳源。應(yīng)用所述重組菌生產(chǎn)蘇氨酸時，采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所述重組菌。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以是豐富培養(yǎng)基，也可以是無機鹽培養(yǎng)基。培養(yǎng)基包含碳源、氮源、無機離子、抗生素和其它的營養(yǎng)因子。作為碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖類；也可以是甘油、甘露醇等醇類；也可以使用葡萄糖酸、檸檬酸、丁二酸等有機酸類。作為氮源，可以使用氨水、硫酸銨、磷酸銨、氯化銨等無機氮源；也可以使用玉米漿、豆粕水解液、毛發(fā)粉、酵母提取物、蛋白胨等有機氮源。無機離子包含鐵、鈣、鎂、錳、鉬、鈷、銅、鉀等離子中的一種或多種。其它營養(yǎng)因子還包括生物素、維生素B1、吡哆醛等維生素。所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖。所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體可為：葡萄糖20.0g/L、硫酸銨15.0g/L、磷酸二氫鉀2.0g/L、七水硫酸鎂2.0g/L、酵母粉2.0g/L、異亮氨酸0.6g/L、蛋氨酸0.6g/L、賴氨酸鹽酸鹽1.2g/L、碳酸鈣15.0g/L、微量元素混合液5mL/L，余量為水。微量元素混合液：FeSO4·7H2O10g/L、CaCl21.35g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、MnSO4·4H2O0.5g/L、CuSO4·5H2O1g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O0.106g/L、Na2B4O7·10H2O0.23g/L、CoCl2·6H2O0.48g/L、35％HCl10mL/L，余量為水。所述培養(yǎng)的條件具體可為：37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)24h。所述培養(yǎng)的條件具體可為：將種子液以3％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)24h。種子液的制備方法如下：將重組菌接種至液體LB培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到種子液。所述培養(yǎng)的過程中進(jìn)行如下過程控制：培養(yǎng)過程中，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值使其維持在6.8-7.0；培養(yǎng)過程中，每隔3-4h取樣一次，檢測葡萄糖含量，當(dāng)體系中的葡萄糖含量低于5g/L時，補加葡萄糖并使體系中的葡萄糖濃度達(dá)到10g/L。本發(fā)明還保護(hù)一種解除蘇氨酸操縱子反饋阻遏的方法，包括如下步驟：刪除蘇氨酸操縱子中的如下DNA區(qū)段：序列表的序列17第1-293位核苷酸。所述方法中，還可包括如下步驟：刪除蘇氨酸操縱子中的如下DNA區(qū)段：序列表的序列17第n2-336位核苷酸；n2為311以上336以下的自然數(shù)。本發(fā)明通過翻譯融合報告基因的方法驗證蘇氨酸衰減子的改造效果。通過融合thrA基因的5’端序列與兩種報告基因lacZ和gfp的完整閱讀表達(dá)框，然后測定報告蛋白LacZ的酶活和GFP熒光值，計算不同蘇氨酸衰減子突變體調(diào)控下的基因表達(dá)量，驗證蘇氨酸衰減子突變體的去阻遏作用。本發(fā)明的有益效果在于，獲得了一種高效解除反饋阻遏的蘇氨酸衰減子突變體，使去阻遏效率顯著提高，從而提高了基因表達(dá)水平。過表達(dá)包含該突變體的蘇氨酸操縱子的工程菌可以顯著提高蘇氨酸產(chǎn)量。本發(fā)明中的突變體在實踐上可用于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸。本發(fā)明通過從5’端逐步截短蘇氨酸衰減子功能序列，獲得了高效解除蘇氨酸操縱子轉(zhuǎn)錄阻遏的方法。應(yīng)用本發(fā)明提供的蘇氨酸衰減子改造方法，可顯著提高蘇氨酸操縱子的表達(dá)水平，從而提高工程菌的蘇氨酸發(fā)酵性能。本發(fā)明獲得高效解除反饋阻遏的核酸序列，構(gòu)建了高效生產(chǎn)蘇氨酸的菌株，為改進(jìn)蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)提供了新方法。附圖說明圖1流式細(xì)胞儀分析不同衰減子突變體調(diào)控下的GFP表達(dá)強度。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。下述實施例中如未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實驗(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。大腸桿菌K12W3110(又稱E.coliK12W3110)：日本技術(shù)評價研究所生物資源中心(NITEBiologicalResourceCenter,NBRC)。pKOV質(zhì)粒：Addgene公司，產(chǎn)品目錄號為25769。pACYC184質(zhì)粒：NEB公司，產(chǎn)品目錄號E4152S。pAD123質(zhì)粒：Gene，1999，226(2):297-305。ONPG的全稱為：鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷。實施例所用的各個引物序列如下(5’→3’)：WY569：GCGTCGACATAGAACCCAACCGCCTGCTCA；WY570：AACGATCGACTATCACAGAAGAAACCTGATTACCTCACTACATA；WY571：TATGTAGTGAGGTAATCAGGTTTCTTCTGTGATAGTCGATCGTT；WY572：ATTGCGGCCGCCCGAAATAAAATCAGGCAACGT；WY583：CGTTAATGAAATATCGCCAG；WY584：TCGAAATCGGCCATAAAGAC。WY577：CGCGGATCCGAAAGTGTACGAAAGCCAGG；WY578：GCGCTATCAGGCATTTTTCCTATTAACCCCCCAGTTTCGA；WY579：TCGAAACTGGGGGGTTAATAGGAAAAATGCCTGATAGCGC；WY580：ATTGCGGCCGCGTGAAGCGGATCTGGCGATT；WY587：ATGGCTGTATCCGCTCGCTG；WY588：ACACCATCGATCAGCAAGGGC。WY573：CGCGGATCCGGCACGATATTTAAGCTGAC；WY574：CAACCAGCGACTAACCGCAGAACAAACTCCAGATAAGTGC；WY575：GCACTTATCTGGAGTTTGTTCTGCGGTTAGTCGCTGGTTG；WY576：ATTGCGGCCGCGCTGGCAACGCGTCATTTAA；WY585：GTAACACACACACTTCATCT；WY586：GATCCCGGATGCTGATTTAG。WY598：CGCGGATCCATACTGCGATGTGATGGGCC；WY599：AATACCAGCCCTTGTTCGTGCTCACATCCTCAGGCGATAA；WY600：TTATCGCCTGAGGATGTGAGCACGAACAAGGGCTGGTATT；WY601：ATTGCGGCCGCCGTTGCCACTTCAATCCCAC；WY602：GCTATGCCAACAACGATATG；WY603：GGTTAATACGCCGGTTGAGC。WY476：CGCGGATCCGGAACGATTGGTCTGGAAAT；WY477：GGCTTCAATCAGGTCAAGGATATCCTATCCTCAACGAATTA；WY478：TAATTCGTTGAGGATAGGATATCCTTGACCTGATTGAAGCC；WY479：ATTGCGGCCGCCGCGACGGATATTATCAATGAC；WY497：GCGCCAAAATCCAAAGTAGC；WY498：ATGTGCGCGCTGGGAAACAT。WY945：CGCGGATCCTATCTTCGCCGTGACCACTGA；WY946：ACCGAACATATTACAGGCCAGCGATCCTTTCATTGTGTTGTC；WY947：GACAACACAATGAAAGGATCGCTGGCCTGTAATATGTTCGGT；WY948：ATTGCGGCCGCCTCGCGAAGTTCCATCATCCT；WY949：CCTGTAACGAGCGTAACGACT；WY950：TATCTTCGCCGTGACCACTGA。WY914：CCCAAGCTTACAGAGTACACAACATCCATG；WY1630：CCCAAGCTTCATTAGCACCACCATTACCA；WY1629：CCCAAGCTTCAGGTAACGGTGCGGGCTGA；WY1628：CCCAAGCTTCGCGTACAGGAAACACAGAA；WY1627：CCCAAGCTTGTGCGGGCTTTTTTTTTCGA；WY913：CCCAAGCTTTCGACCAAAGGTAACGAGGT；WY1746:CATAGAACCAGAACCAGAACCCAATTGCGCCAGCGGGAAC。WY1752:CAATTGGGTTCTGGTTCTGGTTCTATGACCATGATTACGGATTCACT；WY1750:CGCGGATCCACGCGAAATACGGGCAGACA。實施例1、E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT的構(gòu)建以大腸桿菌K12W3110為出發(fā)菌株，依次敲除metA基因(編碼高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的基因)、ilvA基因(編碼蘇氨酸脫氨酶的基因)、lysA基因(編碼二氨基庚二酸脫羧酶的基因)、tdh基因(編碼蘇氨酸脫水酶的基因)、tdcC基因(編碼蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運蛋白的基因)和sstT基因(編碼蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運蛋白的基因)，獲得底盤工程菌，將其命名為E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT。1、敲除metA基因(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY569和WY570組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅰ-甲(metA基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY571和WY572組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅰ-乙(metA基因下游區(qū)域)。(3)將DNA片段Ⅰ-甲和DNA片段Ⅰ-乙混合后作為模板，采用WY569和WY572組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅰ-丙。(4)取pKOV質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取DNA片段Ⅰ-丙，用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒Ⅰ。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒Ⅰ進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pKOV質(zhì)粒的SalI和NotI酶切位點之間插入了如下特異DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列1第245-751位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列1第1682-2154位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。metA基因如序列表的序列1所示，第752-1681位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列2所示的metA蛋白)。(7)將重組質(zhì)粒Ⅰ導(dǎo)入大腸桿菌K12W3110，得到metA基因敲除的重組菌，命名為E.coliK12W3110△metA。metA基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用WY583和WY584組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到1375bp擴(kuò)增產(chǎn)物，初步判斷為候選的目標(biāo)菌；進(jìn)一步通過測序驗證菌株染色體上的metA基因的開放閱讀框被敲除。2、敲除ilvA基因(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY577和WY578組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅱ-甲(ilvA基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY579和WY580組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅱ-乙(ilvA基因下游區(qū)域)。(3)將DNA片段Ⅱ-甲和DNA片段Ⅱ-乙混合后作為模板，采用WY577和WY580組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅱ-丙。(4)取pKOV質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取DNA片段Ⅱ-丙，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒Ⅱ。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒Ⅱ進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pKOV質(zhì)粒的BamHI和NotI酶切位點之間插入了如下特異DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列3第140-637位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列3第2183-2712位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。ilvA基因如序列表的序列3所示，第638-2182位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列4所示的ilvA蛋白)。(7)將重組質(zhì)粒Ⅱ?qū)隕.coliK12W3110△metA，得到ilvA基因敲除的重組菌，命名為E.coliK-12W3110△metA△ilvA。ilvA基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用WY587和WY588組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到1344bp擴(kuò)增產(chǎn)物，初步判斷為候選的目標(biāo)菌；進(jìn)一步通過測序驗證菌株染色體上的ilvA基因的開放閱讀框被敲除。3、敲除lysA基因(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY573和WY574組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅲ-甲(lysA基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY575和WY576組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅲ-乙(lysA基因下游區(qū)域)。(3)將DNA片段Ⅲ-甲和DNA片段Ⅲ-乙混合后作為模板，采用WY573和WY576組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅲ-丙。(4)取pKOV質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取DNA片段Ⅲ-丙，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒Ⅲ。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒Ⅲ進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pKOV質(zhì)粒的BamHI和NotI酶切位點之間插入了如下特異DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列5第132-638位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列5第1902-2445位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。lysA基因如序列表的序列5所示，第639-1901位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列6所示的lysA蛋白)。(7)將重組質(zhì)粒Ⅲ導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA，得到lysA基因敲除的重組菌，命名為E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA。lysA基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用WY585和WY586組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到1302bp擴(kuò)增產(chǎn)物，初步判斷為候選的目標(biāo)菌；進(jìn)一步通過測序驗證菌株染色體上的lysA基因的開放閱讀框被敲除。4、敲除tdh基因(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY598和WY599組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅳ-甲(tdh基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY600和WY601組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅳ-乙(tdh基因下游區(qū)域)。(3)將DNA片段Ⅳ-甲和DNA片段Ⅳ-乙混合后作為模板，采用WY598和WY601組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅳ-丙。(4)取pKOV質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取DNA片段Ⅳ-丙，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒Ⅳ。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒Ⅳ進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pKOV質(zhì)粒的BamHI和NotI酶切位點之間插入了如下特異DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列7第227-752位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列7第1779-2271位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。tdh基因如序列表的序列7所示，第753-1778位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列8所示的tdh蛋白)。(7)將重組質(zhì)粒Ⅳ導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA，得到tdh基因敲除的重組菌，命名為E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh。tdh基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用WY602和WY603組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到1434bp擴(kuò)增產(chǎn)物，初步判斷為候選的目標(biāo)菌；進(jìn)一步通過測序驗證菌株染色體上的tdh基因的開放閱讀框被敲除。5、敲除tdcC基因(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY476和WY477組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅴ-甲(tdcC基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY478和WY479組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅴ-乙(tdcC基因下游區(qū)域)。(3)將DNA片段Ⅴ-甲和DNA片段Ⅴ-乙混合后作為模板，采用WY476和WY479組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅴ-丙)。(4)取pKOV質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取DNA片段Ⅴ-丙，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒Ⅴ。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒Ⅴ進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pKOV質(zhì)粒的BamHI和NotI酶切位點之間插入了如下特異DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列9第176-700位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列9第1853-2388位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。tdcC基因如序列表的序列9所示，第701-2032位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列10所示的tdcC蛋白)。(7)將重組質(zhì)粒Ⅴ導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh，得到tdcC基因敲除的重組菌，命名為E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC。tdcC基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用WY497和WY498組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到1453bp擴(kuò)增產(chǎn)物，初步判斷為候選的目標(biāo)菌；進(jìn)一步通過測序驗證菌株染色體上的tdcC基因的如下區(qū)段被敲除：序列9中第701-1852位核苷酸。6、敲除sstT基因(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY945和WY946組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅵ-甲(sstT基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY947和WY948組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅵ-乙(sstT基因下游區(qū)域)。(3)將DNA片段Ⅵ-甲和DNA片段Ⅵ-乙混合后作為模板，采用WY945和WY948組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段Ⅵ-丙。(4)取pKOV質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取DNA片段Ⅵ-丙，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒Ⅵ。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒Ⅵ進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pKOV質(zhì)粒的BamHI和NotI酶切位點之間插入了如下特異DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列11第14-696位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列11第1760-2240位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。sstT基因如序列表的序列11所示，第701-1945位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列12所示的sstT蛋白)。(7)將重組質(zhì)粒Ⅵ導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC，得到sstT基因敲除的重組菌，命名為E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT。sstT基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用WY949和WY950組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到1569bp擴(kuò)增產(chǎn)物，初步判斷為候選的目標(biāo)菌；進(jìn)一步通過測序驗證菌株染色體上的sstT基因的如下區(qū)段被敲除：序列11中第697-1759位核苷酸。實施例2、衰減子突變體調(diào)控lacZ基因的表達(dá)一、構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC184-PPL1、合成序列表的序列13所示的雙鏈DNA分子(啟動子PPL)。2、以步驟1制備的雙鏈DNA分子為模板，采用WY843和WY842組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。WY843：TGCTCTAGACAATTCCGACGTCTAAGAAA；WY842：CCCAAGCTTGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT。3、取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。4、取pACYC184質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架(約4.1kb)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pACYC184-PPL。二、構(gòu)建各個重組質(zhì)粒1、構(gòu)建重組質(zhì)粒A(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY914和WY1746組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A1；以人工合成的序列表的序列15所示的雙鏈DNA分子為模板，采用WY1752和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A2；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A2混合后作為模板，采用WY914和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A3。(2)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A3，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pACYC184-PPL，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收載體骨架(約4.0kb)。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒A。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒A進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和BamHⅠ酶切位點之間插入了特異DNA分子A；特異DNA分子A自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列14第172至606位核苷酸，連接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因(開放閱讀框為序列15中第1-3075位)。重組質(zhì)粒A命名為pACYC184-PPL-thrLA-lacZ914。2、構(gòu)建重組質(zhì)粒B(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY1630和WY1746組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B1；以人工合成的序列表的序列15所示的雙鏈DNA分子為模板，采用WY1752和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B2；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B2混合后作為模板，采用WY1630和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B3。(2)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B3，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pACYC184-PPL，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收載體骨架(約4.0kb)。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒B。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒B進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和BamHⅠ酶切位點之間插入了特異DNA分子B；特異DNA分子B自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列14第198至606位核苷酸，連接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重組質(zhì)粒B命名為pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1630。3、構(gòu)建重組質(zhì)粒C(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY1629和WY1746組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C1；以人工合成的序列表的序列15所示的雙鏈DNA分子為模板，采用WY1752和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C2；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C2混合后作為模板，采用WY1629和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C3。(2)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C3，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pACYC184-PPL，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收載體骨架(約4.0kb)。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒C。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒C進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和BamHⅠ酶切位點之間插入了特異DNA分子C；特異DNA分子C自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列14第236至606位核苷酸，連接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重組質(zhì)粒C命名為pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1629。4、構(gòu)建重組質(zhì)粒D(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY1628和WY1746組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物D1；以人工合成的序列表的序列15所示的雙鏈DNA分子為模板，采用WY1752和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物D2；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物D1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物D2混合后作為模板，采用WY1628和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物D3。(2)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物D3，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pACYC184-PPL，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收載體骨架(約4.0kb)。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒D。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒D進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和BamHⅠ酶切位點之間插入了特異DNA分子D；特異DNA分子D自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列14第256至606位核苷酸，連接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重組質(zhì)粒D命名為pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1628。5、構(gòu)建重組質(zhì)粒E(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY1627和WY1746組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物E1；以人工合成的序列表的序列15所示的雙鏈DNA分子為模板，采用WY1752和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物E2；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物E1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物E2混合后作為模板，采用WY1627和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物E3。(2)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物E3，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pACYC184-PPL，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收載體骨架(約4.0kb)。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒E。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒E進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和BamHⅠ酶切位點之間插入了特異DNA分子E；特異DNA分子E自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列14第294至606位核苷酸，連接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重組質(zhì)粒E命名為pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1627。6、構(gòu)建重組質(zhì)粒F(1)以大腸桿菌K12W3110的基因組DNA為模板，采用WY913和WY1746組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物F1；以人工合成的序列表的序列15所示的雙鏈DNA分子為模板，采用WY1752和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物F2；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物F1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物F2混合后作為模板，采用WY913和WY1750組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物F3。(2)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物F3，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。(3)取重組質(zhì)粒pACYC184-PPL，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收載體骨架(約4.0kb)。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒F。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒F進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和BamHⅠ酶切位點之間插入了特異DNA分子F；特異DNA分子F自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列14第310至606位核苷酸，連接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重組質(zhì)粒F命名為pACYC184-PPL-thrLA-lacZ913。三、構(gòu)建重組菌將pACYC184-PPL-thrLA-lacZ914導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為LAC914。將pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1630導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為LAC1630。將pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1629導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為LAC1629。將pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1628導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為LAC1628。將pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1627導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為LAC1627。將pACYC184-PPL-thrLA-lacZ913導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為LAC913。將pACYC184質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為LAC對照。四、β-半乳糖苷酶活性測定試驗菌株為：LAC914、LAC1630、LAC1629、LAC1628、LAC1627或LAC913。1、將試驗菌株接種至含34mg/L氯霉素的液體LB培養(yǎng)基，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12h,得到種子液。2、取步驟1得到的種子液，按照2％的接種量接種至含34mg/L氯霉素的液體2YT培養(yǎng)基，37℃、220rpm培養(yǎng)6h。3、完成步驟2后，從培養(yǎng)體系取樣1.5ml，測定OD600nm的光密度值，1ml作為待測樣本檢測β-半乳糖苷酶活性。檢測β-半乳糖苷酶活性的方法：(1)將1ml待測樣本10000×g離心5min，收集菌體沉淀，用pH7.2的PBS緩沖液洗滌兩遍，然后用Z-buffer定容至1ml并充分懸浮菌體，置于冰上備用。Z-buffer：40mMNaH2PO4、60mMNa2HPO4、10mMKCl、1mMMgSO4、50mMβ-mercaptoethanol，pH7.0。(2)完成步驟(1)后，取樣0.05mL，加入0.2mL4mg/ml的ONPG水溶液和0.8mLZ-buffer并混勻，37℃靜置反應(yīng)并記錄反應(yīng)起始時間，體系呈淡黃色時加入1mL1MNa2CO3水溶液終止反應(yīng)并記錄反應(yīng)終止時間，用紫外分光光度計測定OD420nm值。LAC對照進(jìn)行上述步驟，作為紫外分光光度計測定OD420nm值的空白對照。β-半乳糖苷酶酶活MillerUnit＝1000×OD420nm/(OD600nm×t×V)；t，反應(yīng)時間(反應(yīng)終止時間與反應(yīng)起始時間的差值，min)；V，加樣體積，0.05mL。β-半乳糖苷酶活的定義為每個細(xì)胞每分鐘分解1μmolONPG所需要的酶量。每個菌株測量三次，取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果見表1。不同試驗菌株進(jìn)行上述步驟，相應(yīng)的β-半乳糖苷酶酶活具有顯著差異，LAC1627的酶活水平顯著高于其他各個菌株。表1試驗菌株酶活(MillerUnit)LAC91447.72±3.33LAC163026.17±2.71LAC162931.20±1.17LAC162816.11±1.67LAC1627132.09±4.61LAC91322.59±4.23實施例3、衰減子突變體調(diào)控gfp基因的表達(dá)一、構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建如下六個重組質(zhì)粒：pACYC184-PPL-thrLA-gfp914、pACYC184-PPL-thrLA-gfp1630、pACYC184-PPL-thrLA-gfp1629、pACYC184-PPL-thrLA-gfp1628、pACYC184-PPL-thrLA-gfp1627和pACYC184-PPL-thrLA-gfp913。pACYC184-PPL-thrLA-gfp914與pACYC184-PPL-thrLA-lacZ914的區(qū)別僅在于：用特異DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。pACYC184-PPL-thrLA-gfp1630與pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1630的區(qū)別僅在于：用特異DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。pACYC184-PPL-thrLA-gfp1629與pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1629的區(qū)別僅在于：用特異DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。pACYC184-PPL-thrLA-gfp1628與pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1628的區(qū)別僅在于：用特異DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。pACYC184-PPL-thrLA-gfp1627與pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1627的區(qū)別僅在于：用特異DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。pACYC184-PPL-thrLA-gfp913與pACYC184-PPL-thrLA-lacZ913的區(qū)別僅在于：用特異DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。特異DNA分子X為：以pAD123質(zhì)粒為模板，采用WY1751和WY1748組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的正數(shù)第22位核苷酸至倒數(shù)第10位核苷酸(其中具有序列表的序列16所示的gfp基因)。WY1751:TTGGGTTCTGGTTCTGGTTCTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACT；WY1748:CGCGGATCCCTTGCATGCCTGCAGGAGAT。二、構(gòu)建重組菌將pACYC184-PPL-thrLA-gfp914導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為GFP914。將pACYC184-PPL-thrLA-gfp1630導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為GFP1630。將pACYC184-PPL-thrLA-gfp1629導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為GFP1629。將pACYC184-PPL-thrLA-gfp1628導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為GFP1628。將pACYC184-PPL-thrLA-gfp1627導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為GFP1627。將pACYC184-PPL-thrLA-gfp913導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為GFP913。將pACYC184質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為GFP對照。三、流式細(xì)胞儀分析GFP在細(xì)胞群體中的表達(dá)試驗菌株為：GFP914、GFP1630、GFP1629、GFP1628、GFP1627、GFP913或GFP對照(空白對照)。1、將試驗菌株接種至含34mg/L氯霉素的液體LB培養(yǎng)基，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)2h,離心收集菌體。2、取步驟1得到的菌體，用pH7.2的PBS緩沖液懸浮，得到OD600nm值為0.5的菌懸液。3、取步驟2得到的菌懸液，用流式細(xì)胞分析儀(FACSCalibur型，美國BD公司)計數(shù)50000個細(xì)胞，使用FlowJ軟件分析實驗結(jié)果。各個試驗菌株相應(yīng)的結(jié)果見圖1和表2(50000個細(xì)胞的平均值)。圖1中，菌群熒光分布曲線從右至左分別為GFP1627、GFP913、GFP914、GFP1630、GFP1629、GFP1628和GFP對照。GFP1627的熒光水平比其它菌株提高了30至1280倍。表2平均熒光強度GFP91450.55GFP163039.15GFP162928.45GFP16281.40GFP16271798.40GFP91357.95實施例4、制備蘇氨酸一、制備thrA突變基因1、以大腸桿菌K12W3110的基因組為模板，采用WY914和WY926組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2、以大腸桿菌K12W3110的基因組為模板，采用WY925和WY832組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、將步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后作為模板，采用WY914和WY832組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)測序，步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的HindⅢ和EcoRV酶切識別位點之間的核苷酸如序列表的序列17第172至5132所示。序列表的序列17中，第337-2799位核苷酸編碼ThrA*蛋白，第2801-3733位核苷酸編碼ThrB蛋白，第3734-5020位核苷酸編碼ThrC蛋白。ThrA*蛋白(突變蛋白)如序列表的序列18所示，與ThrA蛋白(野生蛋白)相比，突變蛋白只存在一個氨基酸殘基的差異，即第253位氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)榱私M氨酸。ThrB蛋白如序列表的序列19所示。ThrC蛋白如序列表的序列20所示。WY914：CCCAAGCTTACAGAGTACACAACATCCATG；WY925：GAAGTCGATGTCCTACCAGGCGATGGAGCTTTCCTAC；WY926：GTAGGAAAGCTCCATCGCCTGGTAGGACATCGACTTC；WY832：CCCGATATCGCATTTATTGAGAATTTCTCC。二、構(gòu)建具有thrA突變基因的重組質(zhì)粒1、取重組質(zhì)粒pACYC184-PPL，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRV雙酶切，回收載體骨架(約4.2kb)。2、取步驟一的3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRV雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。3、將步驟1的載體骨架和步驟2的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC914。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC914進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和EcoRV酶切位點之間插入了特異DNA分子Ⅰ；特異DNA分子Ⅰ自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列17第172-5132位核苷酸所示的DNA分子。4、制備重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1630。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1630進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和EcoRV酶切位點之間插入了特異DNA分子Ⅱ；特異DNA分子Ⅱ自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列17第198-5132位核苷酸所示的DNA分子。5、制備重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1629。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1629進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和EcoRV酶切位點之間插入了特異DNA分子Ⅲ；特異DNA分子Ⅲ自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列17第236-5132位核苷酸所示的DNA分子。6、制備重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1628。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1628進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和EcoRV酶切位點之間插入了特異DNA分子Ⅳ；特異DNA分子Ⅳ自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列17第256-5132位核苷酸所示的DNA分子。7、制備重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1627。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1627進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和EcoRV酶切位點之間插入了特異DNA分子Ⅴ；特異DNA分子Ⅴ自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列17第294-5132位核苷酸所示的DNA分子。8、制備重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC913。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pACYC184-PPL-thrLA*BC913進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pACYC184的XbaI和EcoRV酶切位點之間插入了特異DNA分子Ⅵ；特異DNA分子Ⅵ自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子PPL，限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切識別序列，序列表的序列17第310-5132位核苷酸所示的DNA分子。三、構(gòu)建重組菌將pACYC184-PPL-thrLA*BC914導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為TA914。將pACYC184-PPL-thrLA*BC1630導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為TA1630。將pACYC184-PPL-thrLA*BC1629導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為TA1629。將pACYC184-PPL-thrLA*BC1628導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為TA1628。將pACYC184-PPL-thrLA*BC1627導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為TA1627。將pACYC184-PPL-thrLA*BC913導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為TA913。將pACYC184質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliK-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重組菌，將其命名為TA對照。四、蘇氨酸工程菌的搖瓶發(fā)酵試驗試驗菌株為：TA914、TA1630、TA1629、TA1628、TA1627、TA913或TA對照。1、取試驗菌株，劃線接種于含34mg/L氯霉素的固體LB培養(yǎng)基平板，37℃靜置培養(yǎng)12小時。2、完成步驟1后，挑取平板上的菌苔，接種至LB培養(yǎng)基斜面中，37℃靜置培養(yǎng)10-12h。3、完成步驟2后，挑取平板上的菌苔，接種至液體LB培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到種子液。4、完成步驟3后，將種子液按照3％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/L、硫酸銨15.0g/L、磷酸二氫鉀2.0g/L、七水硫酸鎂2.0g/L、酵母粉2.0g/L、異亮氨酸0.6g/L、蛋氨酸0.6g/L、賴氨酸鹽酸鹽1.2g/L、碳酸鈣15.0g/L、微量元素混合液5mL/L，余量為水。微量元素混合液：FeSO4·7H2O10g/L、CaCl21.35g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、MnSO4·4H2O0.5g/L、CuSO4·5H2O1g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O0.106g/L、Na2B4O7·10H2O0.23g/L、CoCl2·6H2O0.48g/L、35％HCl10mL/L，余量為水。培養(yǎng)過程中，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值使其維持在6.8-7.0。培養(yǎng)過程中，每隔3-4h取樣一次，使用生物傳感分析儀SBA-40D檢測葡萄糖含量，當(dāng)體系中的葡萄糖含量低于5g/L時，補加葡萄糖并使體系中的葡萄糖濃度達(dá)到10g/L。培養(yǎng)24h后取樣，12000g離心2分鐘，取上清液，檢測蘇氨酸濃度。結(jié)果見表3(三次重復(fù)試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。TA1627生產(chǎn)蘇氨酸的能力最高，發(fā)酵上清中的蘇氨酸濃度高達(dá)9.52±1.35。表3發(fā)酵上清中的蘇氨酸濃度(g/L)TA9135.46±0.53TA9146.11±0.41TA16279.52±1.35TA16280.57±0.11TA16292.22±0.03TA16303.15±0.35TA對照0.21±0.07蘇氨酸濃度的檢測方法：高效液相法，在參考文獻(xiàn)(氨基酸和生物資源，2000，22，59-60)中氨基酸檢測方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，具體方法如下(2,4-二硝基氟苯(FDBN)柱前衍生高效液相法)：取10μL上清液于2mL離心管中，加入200μL0.5MNaHCO3水溶液和100μL1％(體積比)FDBN-乙腈溶液，于60℃水浴中暗處恒溫加熱60min，然后冷卻至室溫，然后加入700μL0.04mol/LKH2PO4水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/LKOH水溶液調(diào)整pH)并搖勻，靜置15min，然后過濾并收集濾液。濾液用于上樣，進(jìn)樣量為15μL。色譜柱為C18柱(ZORBAXEclipseXDB-C18，4.6*150mm,Agilent,USA)；柱溫：40℃；紫外檢測波長：360nm；流動相A為0.04mol/LKH2PO4水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/100mLKOH水溶液調(diào)整pH)，流動相B為55％(體積比)乙腈水溶液，流動相總流量為1mL/min。洗脫過程：洗脫起始時刻(0min)流動相A占流動相總流量的體積份數(shù)為86％、流動相B占流動相總流量的體積份數(shù)為14％；洗脫過程分為4個階段，每個階段中流動相A和流動相D占流動相總流量的體積份數(shù)均為線性變化；第1階段(從起始時刻開始共進(jìn)行2min)結(jié)束時流動相A占流動相總流量的體積份數(shù)為88％、流動相B占流動相總流量的體積份數(shù)為12％，第2階段(從第1階段結(jié)束時刻開始共進(jìn)行2min)結(jié)束時流動相A占流動相總流量的體積份數(shù)為86％、流動相B占流動相總流量的體積份數(shù)為14％，第3階段(從第2階段結(jié)束時刻開始共進(jìn)行6min)結(jié)束時流動相A占流動相總流量的體積份數(shù)為70％、流動相B占流動相總流量的體積份數(shù)為30％，第4階段(從第3階段結(jié)束時刻開始共進(jìn)行10min)結(jié)束時流動相A占流動相總流量的體積份數(shù)為30％、流動相B占流動相總流量的體積份數(shù)為70％。以市售L-蘇氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品(購自sigma,貨號8917)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的蘇氨酸濃度。最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。序列表<160>20<210>1<211>2305<212>DNA<213>大腸桿菌<400>1cgttaatgaaatatcgccagttccacatccatgcgcaatcagcggtactcagtgatagtg60cggtcatggcaatgcttaagcagaaataatcgtgtcaccattggtgggtactaaacctga120agttcagcccaccgggatgagaaaaaatcgcctacgcccccacatacgccagattcagca180acggatacggtttccccaaatcgtccacctcagagcgtcccgtaaccttaaaacccacct240tcttatagaacccaaccgcctgctcattttgctcattaacgttggttgtcagttccggtg300ccatcgagagcgcatgctccaccagcacccgacctacgccgcagccgcgcacatcaggat360cgataaacagcgcatccatatgctgcccacttagcaacataaatccaaccggctgatccc420gctcattaaccgcgacccacaacggcgcttccggcaggaaggaacgaactaggtcctcca480gctcggtccgatactctgctgatagaaaatcgtgagtggcatcgacagaacgacaccaaa540tcgcaacgagttcctccccttcctcatgccgtgagcggcgaatactaataaccattttct600ctccttttagtcattcttatattctaacgtagtcttttccttgaaactttctcaccttca660acatgcaggctcgacattggcaaattttctggttatcttcagctatctggatgtctaaac720gtataagcgtatgtagtgaggtaatcaggttatgccgattcgtgtgccggacgagctacc780cgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatgacaacttctcgtgcgtctgg840tcaggaaattcgtccacttaaggttctgatccttaacctgatgccgaagaagattgaaac900tgaaaatcagtttctgcgcctgctttcaaactcacctttgcaggtcgatattcagctgtt960gcgcatcgattcccgtgaatcgcgcaacacgcccgcagagcatctgaacaacttctactg1020taactttgaagatattcaggatcagaactttgacggtttgattgtaactggtgcgccgct1080gggcctggtggagtttaatgatgtcgcttactggccgcagatcaaacaggtgctggagtg1140gtcgaaagatcacgtcacctcgacgctgtttgtctgctgggcggtacaggccgcgctcaa1200tatcctctacggcattcctaagcaaactcgcaccgaaaaactctctggcgtttacgagca1260tcatattctccatcctcatgcgcttctgacgcgtggctttgatgattcattcctggcacc1320gcattcgcgctatgctgactttccggcagcgttgattcgtgattacaccgatctggaaat1380tctggcagagacggaagaaggggatgcatatctgtttgccagtaaagataagcgcattgc1440ctttgtgacgggccatcccgaatatgatgcgcaaacgctggcgcaggaatttttccgcga1500tgtggaagccggactagacccggatgtaccgtataactatttcccgcacaatgatccgca1560aaatacaccgcgagcgagctggcgtagtcacggtaatttactgtttaccaactggctcaa1620ctattacgtctaccagatcacgccatacgatctacggcacatgaatccaacgctggatta1680atcttctgtgatagtcgatcgttaagcgattcagcaccttacctcaggcaccttcgggtg1740ccttttttatttccgaaacgtacctcagcaggtgaataaattttattcatattgttatca1800acaagttatcaagtatttttaattaaaatggaaattgtttttgattttgcattttaaatg1860agtagtcttagttgtgctgaacgaaaagagcacaacgatccttcgttcacagtggggaag1920ttttcggatccatgacgaggagctgcacgatgactgaacaggcaacaacaaccgatgaac1980tggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccgaagcggtag2040aatttctgactgagctggtgacgcattttacgccacaacgcaataaacttctggcagcgc2100gcattcagcagcagcaagatattgataacggaacgttgcctgattttatttcggaaacag2160cttccattcgcgatgctgattggaaaattcgcgggattcctgcggacttagaagaccgcc2220gcgtagagataactggcccggtagagcgcaagatggtgatcaacgcgctcaacgccaatg2280tgaaagtctttatggccgatttcga2305<210>2<211>309<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2MetProIleArgValProAspGluLeuProAlaValAsnPheLeuArg151015GluGluAsnValPheValMetThrThrSerArgAlaSerGlyGlnGlu202530IleArgProLeuLysValLeuIleLeuAsnLeuMetProLysLysIle354045GluThrGluAsnGlnPheLeuArgLeuLeuSerAsnSerProLeuGln505560ValAspIleGlnLeuLeuArgIleAspSerArgGluSerArgAsnThr65707580ProAlaGluHisLeuAsnAsnPheTyrCysAsnPheGluAspIleGln859095AspGlnAsnPheAspGlyLeuIleValThrGlyAlaProLeuGlyLeu100105110ValGluPheAsnAspValAlaTyrTrpProGlnIleLysGlnValLeu115120125GluTrpSe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