本發(fā)明涉及一種胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因的改造，還涉及含有該基因的表達(dá)載體的構(gòu)建、畢赤酵母中穩(wěn)定分泌表達(dá)及制備重組胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白的方法，以及重組胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)作用，本發(fā)明屬于動物基因工程與動物病毒學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：胸腺激素是由胸腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的多肽激素的總稱，又稱胸腺肽(thymopeptide)。目前應(yīng)用的胸腺肽大多是從小?；蜇i胸腺中提取純化得到的多肽物質(zhì),其生物活性主要是誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成熟和調(diào)控免疫平衡。在人醫(yī)臨床主要用于自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎小球腎炎和重癥肌無力等,也用于惡性腫瘤、病毒性肝炎及抗生素不能有效控制的感染等疾病的輔助治療，在獸醫(yī)尚無臨床應(yīng)用。胸腺素(Thymosin,T)是由25個以上的氨基酸殘基組成，在胸腺肽的各種有效組分中，其活性最高。根據(jù)等電點不同，胸腺素可分為α、β和γ家族。α家族中以胸腺素α1(Tα1)的研究最多，Tα1由28個氨基酸殘基組成，最初是Goldstein從小牛胸腺組織第五組分(ThymosinFraction5,TF5)中分離提純的一種多肽,分子量為3.1KDa，等電點為4.2[GoldsteinAL,etal.Thymosinalpha1:isolationandsequenceanalysisofanimmunologycallyactivethymicpolypetide[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,74(2):725-729；LowTL,etal.ThechemistryandbiologyofthymosinⅡ.Aminoacidsequenceanalysisofthymosinalpha1andpolypeptidebetal[J].JBiolChem,1979,254(3):987-995.]。不同動物之間胸腺素α1的多肽序列高度保守[GoldsteinAL,etal.Fromlabtobedside:emergingclinicalapplicationsofthymosinalpha1.ExpertOpinBiolTher,2009；9(5):593-608.]。1957年Issacs和Lindenmann從流感病毒感染的雞胚細(xì)胞培養(yǎng)液中分離到一種生物活性物質(zhì)，因其干擾同源和異源病毒復(fù)制，因而命名為干擾素(Interferon,IFN)[Isaacs,A,etal.Virusinterference.I.Theinterferon.Proc.R.Soc.LondonSer.1957.B147:258-267.]。干擾素α(IFN-α)屬于I型干擾素，主要功能為“抗病毒細(xì)胞因子”。謝海燕、吳丹等克隆了豬IFN-α基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并成功地表達(dá)了豬IFN-α；葛麗等克隆了豬IFN-α，構(gòu)建了真核表達(dá)載體，并成功地表達(dá)了豬IFN-α；曹瑞兵等克隆并改造了豬IFN-α基因，實現(xiàn)了在原核系統(tǒng)中的高效表達(dá)；姚清俠等在酵母表達(dá)體系中獲得有生物學(xué)活性的重組豬干擾素α(PorcineInterferona,PoIFN-a)并對其抑制FMDV，PRV，PRRSV的活性進行了研究。干擾素是一種非特異性廣譜抗病毒生物制劑，可用于治療許多病毒性疾病。楊國師等研究發(fā)現(xiàn)用豬白細(xì)胞干擾素預(yù)防注射，能大大降低乳豬發(fā)病率，而且以7日齡乳豬開始進行預(yù)防注射效果最佳。鄭永波等用豬白細(xì)胞干擾素進行臨床試驗，試驗結(jié)果表明如果直接用干擾素進行治療，能提高對患病動物的治愈率，若用干擾素配合抗生素及抗病毒藥物對患病動物進行治療，更能顯著提高對患病動物的治愈率。張泉軍等通過試驗和臨床擴大試驗發(fā)現(xiàn)，豬白細(xì)胞干擾素對哺乳仔豬和斷奶仔豬某些病毒性腹瀉或病毒與細(xì)菌混合感染引發(fā)的腹瀉，均有良好的預(yù)防和治療作用。目前有兩個大腸桿菌表達(dá)豬干擾素-胸腺素α1融合蛋白的專利申請已公開(申請?zhí)柗謩e為：CN200910217774.9和CN201410063007.8)，這兩個專利申請均使用原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)GST-豬干擾素α-胸腺素α1融合蛋白，表達(dá)的目的蛋白均為包涵體，需要經(jīng)過包涵體的變性、復(fù)性、透析、過柱純化、蛋白酶切除GST和目的蛋白再純化(專利申請?zhí)枮镃N200910217774.9，見其說明書第11頁；專利申請?zhí)朇N201410063007.8，見其說明書第3頁)，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的是，包涵體的變性和復(fù)性步驟存在諸多不確定因素，整個純化過程非常復(fù)雜且難以進行質(zhì)量控制，會大大提高目的蛋白的生產(chǎn)成本。本發(fā)明是以畢赤酵母高效分泌表達(dá)了胸腺素α1-豬干擾素α(Tα1-PoIFNα)融合蛋白，在搖瓶中重組目的蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到210mg/L，在發(fā)酵罐中重組目的蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到1100mg/L，所表達(dá)的Tα1-PoIFNα融合蛋白是分泌的，且以可溶的形式存在于培養(yǎng)上清中，只需要經(jīng)過過濾純化即可，生產(chǎn)成本很低。迄今為止，國內(nèi)外未見以畢赤酵母來高效分泌表達(dá)Tα1-PoIFNα融合蛋白的報道。綜上所述可以得出結(jié)論，本發(fā)明是國內(nèi)外以畢赤酵母高效分泌表達(dá)Tα1-PoIFNα融合蛋白的首次報道，本發(fā)明高效分泌表達(dá)的重組Tα1-PoIFNα融合蛋白具有很高的抗病毒活性和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性。本發(fā)明高效穩(wěn)定分泌表達(dá)的重組Tα1-PoIFNα融合蛋白為提供具有治療豬病毒性疾病和免疫調(diào)節(jié)功能的綠色無殘留生物制品奠定了基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種人工合成的胸腺素α1-豬干擾素α(Tα1-PoIFNα)融合蛋白基因；本發(fā)明的另一目的是提供含上述人工合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的DNA重組載體和宿主細(xì)胞；本發(fā)明的再一目的是提供一種制備Tα1-PoIFNα融合蛋白及活性檢測的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：本發(fā)明的一種胸腺素α1-豬干擾素α(Tα1-PoIFNα)融合蛋白基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明的一種Tα1-PoIFNα融合蛋白基因是在不改變胸腺素α1和豬干擾素α天然氨基酸序列的前提下，對進行Tα1-PoIFNα融合蛋白基因進行DNA分析及RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測后進行改造得到的，其能夠使Tα1-PoIFNα融合蛋白在畢赤酵母中穩(wěn)定分泌表達(dá)。本發(fā)明還提供了一種包含所述的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的重組表達(dá)載體。優(yōu)選的，所述的重組表達(dá)載體為甲醇調(diào)節(jié)型重組酵母表達(dá)載體，更優(yōu)選的，所述的重組載體是將SEQIDNO.1所示的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9K中得到的，所述重組表達(dá)載體含有EcoRI和NotI酶切位點，一個強啟動子AOX1啟動子以及一個G418抗性選擇位點。進一步的，本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為包含SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，或者為包含含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞為真核生物細(xì)胞。更優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞為甲醇營養(yǎng)型重組酵母細(xì)胞GS115。更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因在制備Tα1-PoIFNα融合蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種制備Tα1-PoIFNα融合蛋白的方法，其特征在于是將SEQIDNO.1所示的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因克隆至表達(dá)載體，然后將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌，進行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，收集純化即得。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的方法包括以下步驟：(1)人工合成Tα1-PoIFNα融合蛋白基因，所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)將合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9K中，電轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞后，用MD板及G418+YPD平板篩選，激活培養(yǎng)后在搖瓶中小量或發(fā)酵罐中大量以甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并進行無菌檢驗；(3)無菌收集培養(yǎng)上清，經(jīng)過濾或純化后制備重組Tα1-PoIFNα融合蛋白，整個過程中進行蛋白無菌檢驗；(4)用單克隆抗體對Tα1-PoIFNα融合蛋白進行免疫檢測；(5)檢測重組Tα1-PoIFNα融合蛋白的抗病毒活性和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，在步驟(1)所述的基因的5’端加入了EcoRI限制性內(nèi)切酶位點，在其3’端加入了NotI限制性內(nèi)切酶位點。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的在搖瓶中以甲醇誘導(dǎo)小量表達(dá)的條件為每間隔24h加入100％甲醇至甲醇終濃度為0.5～1％(v/v)，即加入量為每毫升培養(yǎng)液中加5～10μL100％甲醇，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，26～30℃250～300r/min震蕩培養(yǎng)96～120h，收獲培養(yǎng)上清，經(jīng)過濾或純化后制備重組Tα1-PoIFNα融合蛋白。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的在發(fā)酵罐中以甲醇誘導(dǎo)大量表達(dá)的步驟及條件為：1)甘油培養(yǎng)擴增菌體：發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置分別為攪拌速度600～1000r/min，溫度26～28℃,控制方式均為P-I-D，維持溶解氧值(DO)在30％至40％；2)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)：按照8～12mL/L比例在甲醇中加入PTM1培養(yǎng)基，混勻后，以2.4～3.6mL/h/L/初始發(fā)酵液的速率加入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)，以使酵母適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境，隨后補加甲醇的速率升為4.8～7.2mL/h/L初始發(fā)酵液，最后提高補加甲醇的速率至10～12mL/h/L/初始發(fā)酵液，開始誘導(dǎo)表達(dá)后，每天取表達(dá)上清用于蛋白分析，誘導(dǎo)表達(dá)72～96h后，結(jié)束發(fā)酵；收獲培養(yǎng)上清，經(jīng)過濾或純化后制備重組Tα1-PoIFNα融合蛋白。具體的，所述方法包括以下步驟：(1)在不改變天然氨基酸序列的前提下人工合成Tα1-PoIFNα融合蛋白基因Tα1-PoIFNα，該人工合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。然后在其5’端加入了EcoRI限制性內(nèi)切酶位點，在其3’端加入了NotI限制性內(nèi)切酶位點；將該人工合成的基因克隆至pUC57中獲得pUC-Tα1-PoIFNα。(2)將包含Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的質(zhì)粒pUC-Tα1-PoIFNα和pPIC9K用EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖電泳后膠回收Tα1-PoIFNα和pPIC9K片段，連接Tα1-PoIFNα和pPIC9K得到表達(dá)載體pPIC9K-Tα1-PoIFNα。(3)畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化以SalI或SacI線性化pPIC9K-Tα1-PoIFNα，與GS115感受態(tài)細(xì)胞混合后，用BioRadGenePulser電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布MD平板，待長出單菌落后分別轉(zhuǎn)接至不同濃度G418+YPD抗性平板上，26～30℃孵育2～3d。(4)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)從抗性板中挑選單菌落進行活化后誘導(dǎo)培養(yǎng)，檢測上清中目的蛋白的表達(dá)情況，上清以12000g離心3min，取上清進行純化，以純化蛋白進行SDS-PAGE檢測。(5)重組Tα1-PoIFNα融合蛋白的免疫學(xué)檢測對收獲的上清以12000g離心3min，取上清進行SDS-PAGE，以PoIFNα的單抗經(jīng)過Western-blot檢測目的蛋白的反應(yīng)原性。(6)重組Tα1-PoIFNα融合蛋白的活性檢測對收獲的上清以12000g離心3min，再取上清過濾，檢測過濾后上清中PoIFNα的抗病毒活性和Tα1的調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性。在用于重組Tα1-PoIFNα融合蛋白的搖瓶小量制備時，包括以下步驟：(1)用滅菌牙簽挑G418+YPD平板上生長的具有G418抗性的單菌落，挑于3mL的BMGY液體培養(yǎng)基中進行激活培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26～30℃，在搖床中250轉(zhuǎn)/min振蕩過夜，至OD600＝2～6，細(xì)胞處于對數(shù)生長期；(2)將步驟(1)的培養(yǎng)菌液在1500g和室溫條件下離心3min收集沉淀，重懸于5mL的BMMY中，控制溶氧量和防止污染，在30mL的試管中繼續(xù)在搖床中振蕩培養(yǎng)；(3)每間隔24h加入100％甲醇至終濃度為1％(v/v)，即加入量為每毫升培養(yǎng)液中加10μL100％甲醇，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，26～30℃250r/min震蕩培養(yǎng)96～120h，收獲培養(yǎng)上清，經(jīng)過濾或純化后制備重組衣殼蛋白。在用于重組Tα1-PoIFNα融合蛋白的大量制備時，本發(fā)明采用了5L發(fā)酵罐進行發(fā)酵表達(dá)，步驟為1)甘油培養(yǎng)擴增菌體：發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置分別為攪拌速度600～1000r/min，溫度26～28℃,控制方式均為P-I-D，維持溶解氧值(DO)在30％至40％；2)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)：按照8～12mL/L比例在甲醇中加入PTM1培養(yǎng)基，混勻后，以2.4～3.6mL/h/L/初始發(fā)酵液的速率加入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)，維持此低速率甲醇補加2～3h，以使酵母適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境，隨后補加甲醇的速率升為4.8～7.2mL/h/L初始發(fā)酵液，以此速率維持2h，最后提高補加甲醇的速率至10～12mL/h/L/初始發(fā)酵液，同時檢測DO值和發(fā)酵液溫度并判斷甲醇是否過量，開始誘導(dǎo)表達(dá)后，每天取表達(dá)上清用于蛋白分析。誘導(dǎo)表達(dá)72～96h后，結(jié)束發(fā)酵；收獲培養(yǎng)上清，經(jīng)過濾或純化后制備重組Tα1-PoIFNα融合蛋白。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明是國內(nèi)外有關(guān)Tα1-PoIFNα融合蛋白在酵母中高效分泌表達(dá)并具有高生物活性的首次報道。(2)本發(fā)明高效穩(wěn)定分泌表達(dá)的Tα1-PoIFNα融合蛋白為提供具有治療豬病毒性疾病及免疫調(diào)節(jié)功能的綠色無殘留生物制品奠定了基礎(chǔ)。(3)本發(fā)明方法簡單易行，成本較低。附圖說明圖1為畢赤酵母表達(dá)的本發(fā)明Tα1-PoIFNα融合蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；M為預(yù)染蛋白Marker，1為Tα1-PoIFNα融合蛋白發(fā)酵表達(dá)上清，2為Tα1-PoIFNα融合蛋白搖瓶表達(dá)上清；圖2為畢赤酵母表達(dá)的本發(fā)明Tα1-PoIFNα融合蛋白Western-blot結(jié)果；M為預(yù)染蛋白Marker，1為Tα1-PoIFNα融合蛋白發(fā)酵表達(dá)上清，2為Tα1-PoIFNα融合蛋白搖瓶表達(dá)上清；圖3為畢赤酵母表達(dá)的Tα1-PoIFNα融合蛋白過濾后上清的抗病毒活性檢測結(jié)果。10-7、10-8分別表示將表達(dá)的包含重組蛋白的過濾后上清做10-7和10-8倍稀釋后作用MDBK細(xì)胞，然后以VSV感染；Negative為空白未感染VSV的MDBK細(xì)胞，無病變，作為陰性對照；Positive為感染VSV的MDBK細(xì)胞，幾乎100％病變，作為陽性對照；10-7、10-8、Negative和Positive圖片的拍攝時間近乎一致。具體實施方式下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，絕不限制本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所設(shè)定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1經(jīng)過改造的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的合成對Tα1-PoIFNα融合蛋白基因進行DNA分析及RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測后進行改造，在不改變天然氨基酸序列的前提下人工合成Tα1-PoIFNα融合蛋白基因，命名為Tα1-PoIFNα，該人工合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。實施例2Tα1-PoIFNα融合蛋白的小量制備1、Tα1-PoIFNα融合蛋白基因工程酵母菌種的構(gòu)建(1)材料和方法：畢赤酵母菌PichiapastorisGS115，pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒，均購自美國Invitrogen公司。DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、SacI購自TaKaRa公司，T4DNA連接酶購自NEB公司。BMGY、BMMY、YPD培養(yǎng)基，見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自Axgen公司。一抗為抗豬干擾素α單克隆抗體，為自制，二抗為兔抗鼠IgG-HRP抗體，購自Sigma公司；(2)表達(dá)載體pPIC9K-Tα1-PoIFNα的構(gòu)建(a)將實施例1合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因Tα1-PoIFNα的5’端加入EcoRI限制性內(nèi)切酶位點，在其3’端加入了NotI限制性內(nèi)切酶位點后克隆至pUC57中獲得pUC-Tα1-PoIFNα；(b)將包含Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的質(zhì)粒pUC-Tα1-PoIFNα和pPIC9K分別用EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后分別膠回收Tα1-PoIFNα和pPIC9K目的片段，將回收的Tα1-PoIFNα和pPIC9K的目的片段連接得到表達(dá)載體pPIC9K-Tα1-PoIFNα；(3)重組畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化使用來源于TaKaRa公司的限制性內(nèi)切酶SacI將重組質(zhì)粒pPIC9K-Tα1-PoIFNα線性化后，與畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，用BioRadGenePulser電轉(zhuǎn)儀電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化參數(shù)為1.5kV、25uF、200Ω；電擊后，立即加入lmL冰浴的山梨醇，溫育后，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于MD平板上，26～30℃孵育3d，待平板上的單菌落長出后，將其分別依次點種在含抗生素G418250、500、1000、2000、3000mg/L的G418+YPD平板上，26～30℃孵3d，然后將G4182000mg/LG418+YPD平板上的單菌落再分別依次點種在G4182500、3000mg/L的G418+YPD平板上，26～30℃孵育3d；該重組酵母菌株抵抗G418的能力與其整合質(zhì)?？截悢?shù)成正比。(4)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)用滅菌牙簽挑G418+YPD平板上生長的含有本發(fā)明所述的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因Tα1-PoIFNα的G418抗性單菌落，挑于3mL的BMGY液體培養(yǎng)基中進行激活培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，250r/min振蕩過夜，至OD600≈6.0，細(xì)胞處于對數(shù)生長期，得到的培養(yǎng)菌液在1500g和室溫條件下離心3min收集沉淀，重懸于5mL的BMMY中，防止污染，在30mL的試管中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每間隔24h加入100％甲醇至甲醇終濃度為1％(v/v)，即加入量為每毫升培養(yǎng)基中加入10μL100％甲醇，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)4d，28℃250r/min振蕩培養(yǎng)96h收獲上清，然后以12000g離心3min取上清通過SDS-PAGE電泳檢測Tα1-PoIFNα融合蛋白(見圖1)，結(jié)果表明所表達(dá)的重組蛋白的大小與預(yù)期一致，蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到210mg/L；電泳后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進行Western-blot鑒定(見圖2)，一抗為抗豬干擾素α單克隆抗體，二抗為兔抗鼠lgG-HRP抗體，結(jié)果表明表達(dá)得到的重組蛋白能夠與抗豬干擾素α單克隆抗體以及兔抗鼠lgG-HRP抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。實施例3Tα1-PoIFNα融合蛋白的大量制備1、材料：含有Tα1-PoIFNα融合蛋白基因Tα1-PoIFNα的菌種：GS115(pPIC9K-Tα1-PoIFNα)(實施例2制備)；儀器：發(fā)酵罐、電泳儀；培養(yǎng)基：YPD、BMGY、BSM和PTM1發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配置方法見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊；2、方法：2.1種子培養(yǎng)和酵母細(xì)胞生物量的積累將凍存的工程菌在YPD瓊脂板上劃線,26℃培養(yǎng)。至菌落長到2mm,挑取單克隆菌落加入到10mLYPD培養(yǎng)液(種子培養(yǎng)基)中,26℃、250r/min振蕩培養(yǎng)24h。將上述培養(yǎng)物1mL接種到200mLYPD培養(yǎng)液中,26℃、250r/min振蕩培養(yǎng)24h,使其A600≈10。配制2LBSM培養(yǎng)基,加入5L發(fā)酵罐,121℃、30min高壓滅菌培養(yǎng)基及發(fā)酵罐。待發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基冷卻到室溫時,用氨水調(diào)節(jié)BSM培養(yǎng)基的pH值至所需數(shù)值,而后加入PTM1培養(yǎng)基和生物素貯備液。將上述100mLYPD培養(yǎng)菌種加入發(fā)酵罐,開始發(fā)酵罐培養(yǎng),此為第一階段即甘油培養(yǎng)擴增菌體,發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置分別為攪拌速度800r/min，溫度26℃,控制方式均為P-I-D，維持溶解氧值(DO)在30％至40％，必要時通入純氧。此階段每天至少取樣1次，測A600和細(xì)胞濕重，分析酵母菌生長狀態(tài)，肉眼和鏡下觀察菌液，并留上清用于蛋白分析。約24h后DO值上升至接近100％,按照每升12mLPTM1培養(yǎng)基的比例在高壓滅菌后的50％甘油中加入PTM1培養(yǎng)基,混勻后，以18.2mL/h/L初始發(fā)酵液的速率加入到發(fā)酵罐中，至菌體濕重達(dá)200g/L。停止補加甘油后，觀測DO值上升至接近100％后，繼續(xù)維持“甘油饑餓”狀態(tài)30min，轉(zhuǎn)入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段。2.2甲醇誘導(dǎo)表達(dá)按照12mL/L比例在甲醇中加入PTM1培養(yǎng)基，混勻后，以3.6mL/h/L初始發(fā)酵液的速率加入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)，維持此低速率甲醇補加2h，以使酵母適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境。補加甲醇的速率升為7.2mL/h/L初始發(fā)酵液，以此速率維持2h。提高補加甲醇的速率至11mL/h/L初始發(fā)酵液，同時檢測DO值和發(fā)酵液溫度并判斷甲醇是否過量(停補甲醇觀測DO值變化,若停補甲醇后，DO值在1min內(nèi)上升幅度大于10％，說明碳源受限，反之說明甲醇過量)，若碳源受限，則加快補甲醇的速率，若甲醇過量則應(yīng)調(diào)慢補甲醇的速率，直到合適的速度。開始誘導(dǎo)表達(dá)后，每隔12h取樣1次，測A600和細(xì)胞濕重，分析酵母菌生長狀態(tài)，肉眼和鏡下觀察菌液，并取表達(dá)上清用于蛋白分析。誘導(dǎo)表達(dá)72h后，結(jié)束發(fā)酵，經(jīng)檢測在發(fā)酵罐中重組目的蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到1100mg/L。通過SDS-PAGE電泳(見圖1)檢測和Western-blot(見圖2)鑒定表達(dá)上清中的Tα1-PoIFNα融合蛋白。3、重組Tα1-PoIFNα融合蛋白的大量制備及活性檢測將收獲的發(fā)酵上清以12000g離心30min后過濾，分別取過濾后上清進行SDS-PAGE和抗病毒活性及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性檢測(玫瑰花環(huán)試驗)。1)抗病毒活性試驗：采用MDBK細(xì)胞/VSV檢測系統(tǒng)，微量細(xì)胞病變(cytopathogeniceffect,CPE)抑制法測定重組蛋白的抗病毒活性。在96孔板中以10倍(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9)倍比稀釋表達(dá)的過濾后上清(每孔50μL，設(shè)8個重復(fù))，隨后每孔加入100μLMDBK細(xì)胞懸液(5×104細(xì)胞)，設(shè)細(xì)胞和病毒對照，37℃、5％CO2培養(yǎng)24h，棄去孔中液體，每孔加入200μLVSV懸液(200TCID50/0.2mL)，細(xì)胞對照孔加入200μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)36～48h，當(dāng)病毒對照孔中的MDBK細(xì)胞幾乎全部發(fā)生病變時判定結(jié)果，根據(jù)細(xì)胞的病變程度，記錄不同濃度時的保護性。細(xì)胞的病變程度分為：無明顯的CPE、有25％左右的CPE、有50％左右的CPE、有75％左右的CPE、有100％左右的CPE。結(jié)果計算：根據(jù)Reed-Muench法計算。保護50％CPE的重組蛋白稀釋度中的干擾素量即為1個抗病毒活性單位(IU)。結(jié)果表明，過濾后上清的抗病毒活性為1.2×108IU/mL(見圖3)。2)玫瑰花環(huán)試驗：Tα1具有促進細(xì)胞表面受體表達(dá)的活性。根據(jù)玫瑰花環(huán)試驗可測定融合蛋白刺激淋巴細(xì)胞表面受體表達(dá)的活性，據(jù)此判斷融合蛋白中胸腺素α1的生物學(xué)活性。取試管6支，其中3支各加入Hank's液0.1mL作為對照。另外3支各加樣品溶液0.1mL作測定管，每管加脫E受體的淋巴細(xì)胞懸液0.2mL，搖勻37℃孵育1h，加入綿羊紅細(xì)胞懸液0.2mL500r/min離心3min，放入4℃冰箱過夜，次日取出棄上清，每管中加入固定液1滴，輕搖靜置10min，加入染色液2滴并搖勻，靜置15min后開始計數(shù)。視野中淡藍(lán)色的較大細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，共數(shù)計數(shù)板16個大方格上淋巴細(xì)胞個數(shù)(200個)，統(tǒng)計其中的E玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞數(shù)(結(jié)合3個以上綿羊紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞)計玫瑰花環(huán)形成率，取各管平均值。按照公式計算Tα1的活性：樣品活性＝[(樣品測定管平均讀數(shù)-對照管平均讀數(shù))/100]×100％，測定結(jié)果如表1所示：表1Tα1-PoIFNα重組融合蛋白的Tα1活性玫瑰花環(huán)形成平均數(shù)(％)活性(％)Hank’s液7-無重組蛋白淋巴細(xì)胞對照6-含重組蛋白的過濾后上清2215以上結(jié)果表明，包含重組蛋白的過濾后上清具有明顯的Tα1活性。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>一種胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因及其重組蛋白的制備方法<130>KLPI161371<170>PatentIn3.5<210>1<211>624<212>DNA<213>Tα1-PoIFNα<400>1tctgatgctgctgttgatacttcttctgagattactactaaggatttgaaggagaagaag60gaggttgttgaggaggctgagaacggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttct120ggttcttgtgatttgccacaaactcactctttggctcacactagagctttgagattgttg180gctcaaatgagaagaatttctccattctcttgtttggatcacagaagagatttcggttct240ccacacgaggctttcggtggtaaccaagttcaaaaggctcaagctatggctttggttcac300gagatgttgcaacaaactttccaattgttctctactgagggttctgctgctgcttggaac360gagtctttgttgcaccaattctacactggtttggatcaacaattgagagatttggaggct420tgtgttatgcaagaggctggtttggagggtactccattgttggaggaggattctattaga480gctgttagaaagtacttccacagattgactttgtacttgcaagagaagtcttactctcca540tgtgcttgggagattgttagagctgaggttatgagatctttctcttcttctagaaacttg600caagatagattgagaaagaaggag624當(dāng)前第1頁1 2 3