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一種胸腺素α1?豬干擾素α融合蛋白基因及其重組蛋白的制備方法與流程

文檔序號:12097484閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因,其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種包含權(quán)利要求1所述的胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因的重組表達(dá)載體,優(yōu)選的,所述的重組表達(dá)載體為甲醇調(diào)節(jié)型重組酵母表達(dá)載體。

3.如權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體,其特征在于,所述的重組表達(dá)載體是將權(quán)利要求1所述的胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9K中得到的,所述重組表達(dá)載體含有EcoRI和Not I酶切位點(diǎn),一個(gè)強(qiáng)啟動子AOX1啟動子以及一個(gè)G418抗性選擇位點(diǎn)。

4.一種宿主細(xì)胞,其特征在于,所述宿主細(xì)胞為包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的宿主細(xì)胞,或者為包含權(quán)利要求2或3中所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞,優(yōu)選的,所述的細(xì)胞為真核細(xì)胞,更優(yōu)選的,所述的細(xì)胞為甲醇營養(yǎng)型重組酵母細(xì)胞GS115。

5.權(quán)利要求1所述的胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因在制備重組胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白中的應(yīng)用。

6.一種制備重組胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白的方法,其特征在于是將權(quán)利要求1所述的胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因克隆至表達(dá)載體,然后將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌,進(jìn)行重組的胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá),收集純化即得。

7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于包括以下步驟:

(1)人工合成胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因,所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

(2)將合成的胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白基因克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9K中,電轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞后,用MD板及G418+YPD平板篩選,激活培養(yǎng)后在搖瓶中小量或發(fā)酵罐中大量以甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行無菌檢驗(yàn);

(3)無菌收集培養(yǎng)上清,經(jīng)過濾或純化后制備重組胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白,整個(gè)過程中進(jìn)行蛋白無菌檢驗(yàn);

(4)用單克隆抗體對胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白進(jìn)行免疫檢測;

(5)檢測重組胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白的抗病毒活性和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性。

8.如權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于在步驟(1)所述的基因的5’端加入了EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),在其3’端加入了Not I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

9.如權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于所述的在搖瓶中以甲醇誘導(dǎo)小量表達(dá)的條件為每間隔24h加入100%甲醇至甲醇終濃度為0.5~1%(v/v),即加入量為每毫升培養(yǎng)液中加5~10μL100%甲醇,進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),26~30℃250~300r/min震蕩培養(yǎng)96~120h,收獲培養(yǎng)上清,經(jīng)過濾或純化后制備重組胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白。

10.如權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于所述的在發(fā)酵罐中以甲醇誘導(dǎo)大量表達(dá)的步驟及條件為:1)甘油培養(yǎng)擴(kuò)增菌體:發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置分別為攪拌速度600~1000r/min,溫度26~28℃,控制方式均為P-I-D,維持溶解氧值(DO)在30%至40%;2)甲醇誘導(dǎo)表達(dá):按照8~12mL/L比例在甲醇中加入PTM1培養(yǎng)基,混勻后,以2.4~3.6mL/h/L/初始發(fā)酵液的速率加入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá),以使酵母適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境,隨后補(bǔ)加甲醇的速率升為4.8~7.2mL/h/L初始發(fā)酵液,最后提高補(bǔ)加甲醇的速率至10~12mL/h/L/初始發(fā)酵液,開始誘導(dǎo)表達(dá)后,每天取表達(dá)上清用于蛋白分析,誘導(dǎo)表達(dá)72~96h后,結(jié)束發(fā)酵;收獲培養(yǎng)上清,經(jīng)過濾或純化后制備重組胸腺素α1-豬干擾素α融合蛋白。

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