本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種利用基因工程技術(shù)內(nèi)源表達(dá)GABA以改良乳酸菌耐脅迫性能的基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乳酸菌(Lacticacid bacteria,LAB)是一群形態(tài)、代謝性能和生理學(xué)特征不完全相同的革蘭氏陽性菌的總稱。乳酸菌普遍存在于人類和動物的腸道中，被人們一致認(rèn)同是安全級的微生物。

乳酸菌具有抑制病原微生物在腸上皮細(xì)胞表面黏附、定植和侵襲腸上皮細(xì)胞的功能，乳酸菌的代謝產(chǎn)物也具有阻止病原微生物入侵生物屏障作用。由于乳酸菌對動植物和人體均具有良好的益生作用，乳酸菌又被稱為“益生菌”，在乳制品及相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)、制作植物發(fā)酵型蛋白飲料、蔬菜深加工等領(lǐng)域有廣泛的開發(fā)運(yùn)用。

但是在大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，乳酸菌無法避免的面臨各種不利條件影響其生長發(fā)育。包括“低溫脅迫”和“酸脅迫”。乳酸菌是嗜溫微生物，溫度過高過低都會影響乳酸菌的生長增殖。但是在工業(yè)化的生產(chǎn)、運(yùn)輸過程中為了保證乳酸菌制品的質(zhì)量，必須對其進(jìn)行低溫貯存，這樣不可避免的會對乳酸菌造成一定的傷害。在冷凍過程會導(dǎo)致細(xì)胞膜上形成大量冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的生理、代謝功能受到損傷。同時溫度下降會導(dǎo)致細(xì)胞中的水分含量減少，胞內(nèi)外的電解質(zhì)濃度增加，造成“溶質(zhì)效應(yīng)”。此外，低溫時，DNA糖基鍵的斷裂使堿基產(chǎn)生了質(zhì)子化作用，DNA產(chǎn)生脫嘌呤和脫嘧啶反應(yīng)，使得DNA在自我修復(fù)過程中的錯誤率極大提高了，這可能會產(chǎn)生生物突變體，也是細(xì)胞喪失生命力的重要因素之一。

與此同時，乳酸菌作為嗜中性微生物，是發(fā)酵生產(chǎn)酸性物質(zhì)的典型菌株，乳酸菌在增殖過程中所產(chǎn)生的乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)發(fā)揮著雙重作用。一方面，乳酸菌代謝所產(chǎn)生的高濃度酸抑制了其他微生物的生長增殖，增強(qiáng)了食品的貨架保存期，并且可以與醛類、酮類等食品中的一些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生了芳香類化合物，賦予了食品獨(dú)特的風(fēng)味。但是如果外界的生長環(huán)境過于偏酸性時乳酸菌的代謝和生長就會遭到抑制；同時，由于乳酸菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，高濃度的酸會使細(xì)胞質(zhì)中大量積累質(zhì)子，隨即會使得細(xì)胞內(nèi)呈酸性即pH值降低，使得跨膜△pH受到影響，消耗乳酸菌內(nèi)的質(zhì)子推動力。進(jìn)一步影響乳酸菌的生物活性和增殖能力。

目前國內(nèi)外鮮有直接提高乳酸菌抗性的報導(dǎo)。但是卻有研究者通過別的研究方法來間接的幫助乳酸菌抵御外界脅迫環(huán)境。例如，可與通過調(diào)控氨基酸代謝來提高乳酸菌的抵御酸脅迫能力；通過調(diào)控細(xì)胞膜上脂肪酸的組成進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的生理功能來提高乳酸菌的抗性；通過引入別的代謝途徑來改善乳酸菌的抗性等，但是尚無報道表明能同時提高乳酸菌的抗酸和抗低溫能力，因此提供一種提高乳酸菌綜合脅迫抗性的方法尤為重要。

γ-氨基丁酸作為一種廣泛存在于生物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸，主要由L-谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)脫羧而成，作為三羧酸循環(huán)的重要支路參與氨基酸代謝。同時參與到多種生物體的生長發(fā)育和抵御環(huán)境脅迫過程中，異源表達(dá)高產(chǎn)GABA的GAD基因有助于參與乳酸菌抗脅迫能力的改良。因此，研究GABA在乳酸菌增殖過程中所扮演的角色具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提高乳酸乳球菌耐受低溫脅迫和酸脅迫能力的GAD基因及其應(yīng)用，向乳酸菌中引入含有所述GAD基因的質(zhì)粒，通過在乳酸菌中過量表達(dá)合成γ-氨基丁酸的谷氨酸脫羧酶CsGAD以提高乳酸菌耐低溫脅迫能力和耐酸脅迫能力，從而提高乳酸乳球菌在低溫和酸性環(huán)境下的存活率，為工業(yè)化生產(chǎn)提供良好的保證。

本發(fā)明所請求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的之一請求保護(hù)一種提高乳酸菌耐脅迫能力的GAD基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明目的之二是請求保護(hù)一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如

SEQ ID NO.2所示.。

本發(fā)明的目的之三是請求保護(hù)一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的目的之所四是請求保護(hù)一種構(gòu)建重組菌的方法，包括以下步驟：a、將所述GAD基因連接到表達(dá)載體上獲得重組質(zhì)粒；b將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中獲得重組菌。

本發(fā)明的目的之所五是請求保護(hù)該基因在提高乳酸菌耐脅迫能力中的應(yīng)用。

所述應(yīng)用中，乳酸菌耐脅迫能力是指耐低溫脅迫能力和耐酸脅迫能力。

本發(fā)明的目的之六是請求保護(hù)一種生產(chǎn)食品級γ-氨基丁酸的方法，該方法是向乳酸菌中引入含有GAD基因的構(gòu)建體，通過GAD基因在乳酸菌中過量表達(dá)合成γ-氨基丁酸，由于乳酸菌的表達(dá)系統(tǒng)本身是食品級的，可以以達(dá)到生產(chǎn)富含具有保健效果γ-氨基丁酸的乳酸菌的目的。

與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果表現(xiàn)在：

本發(fā)明GAD基因，通過在乳酸菌中過量表達(dá)合成γ-氨基丁酸的谷氨酸脫羧酶CsGAD以提高乳酸菌耐低溫脅迫能力和耐酸脅迫能力，從而提高乳酸乳球菌在低溫和酸性環(huán)境下的存活率，同時產(chǎn)生的γ-氨基丁酸可用于多種保健食品的開發(fā)應(yīng)用，為工業(yè)化生產(chǎn)提供良好的保證。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例中正常培養(yǎng)條件下重組菌與對照菌的生長曲線。

圖2是本發(fā)明實施例中對數(shù)期中期重組菌與對照菌在低溫冷凍脅迫下生長情況對比。

圖3是本發(fā)明實施例中穩(wěn)定期前期重組菌與對照菌在低溫冷凍脅迫下生長情況對比。

圖4是本發(fā)明實施例中穩(wěn)定期后期重組菌與對照菌在低溫冷凍脅迫下生長情況對比。

圖5是本發(fā)明實施例中重組菌與對照菌在酸脅迫下生長情況對比。

圖6是重組菌電泳圖譜。

圖6中，M：Marker(蛋白分子量標(biāo)記)；1：空載體誘后；2：重組載體誘前；3：重組載體誘后；4：重組載體誘前上清；5：重組載體誘后上清；6：重組載體誘前沉淀；7：重組載體誘后沉淀。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖通過具體實施方式對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步解釋說明。

1.重組表達(dá)菌株的構(gòu)建：

擴(kuò)增本發(fā)明人前期克隆自茶葉葉片中的CsGAD基因序列，該并將其連接到乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8148上，獲得重組質(zhì)粒pNZ8148-CsGAD，再將其電轉(zhuǎn)化入宿主菌L.lactis NZ9000中，得到重組菌株L.lactis NZ9000-CsGAD(乳酸菌L.lactisNZ9000以及表達(dá)質(zhì)粒載體pNZ8048購于湖南長沙贏潤生物技術(shù)有限公司)。詳細(xì)步驟如下：

(1)根據(jù)已經(jīng)獲得的茶樹GAD基因序列，序列如SEQ ID NO.1所示，運(yùn)用Primer 5.0軟件在序列的5’和3’設(shè)計一對引物：

CsGAD-up CCG CCATGG ATGGTTCTCTCAAAGATTGC NcoI酶切位點(diǎn)

CsGAD-down CCC AAGCTT CTAGCAAATCACTTGTGT HindIII酶切位點(diǎn)

利用高保真酶從提取的茶樹葉片cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物利用普通Taq酶進(jìn)行加“A”反應(yīng)(常規(guī)操作)后再次回收連接入克隆載體pMD19-T，構(gòu)建pMD19-CsGAD質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素平板培養(yǎng)過夜后挑取陽性克隆測序。

(2)確定測序結(jié)果與原始序列無誤后，對提取的高濃度pMD19-CsGAD質(zhì)粒和pNZ8148質(zhì)粒(商品化的空表達(dá)載體)進(jìn)行NcoI和HindIII酶的雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得pNZ8148-CsGAD表達(dá)載體，再次轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后挑菌測序。

(3)測序確定結(jié)果無誤后，搖菌提取pNZ8148-CsGAD質(zhì)粒，利用電穿孔儀轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000感受態(tài)細(xì)胞，30℃培養(yǎng)并挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切的驗證。電泳檢測片段大小正確后表明獲得重組乳酸菌L.lactis NZ-CsGAD。

2.PNZ8048-CsGAD的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測

將經(jīng)測序正確的導(dǎo)入目的質(zhì)粒的乳酸菌命名為重組菌，將導(dǎo)入NZ9000空載體的乳酸菌命名為對照菌。對獲得的重組乳酸菌L.lactis NZ-CsGAD利用nisin(乳酸鏈球菌素，一種天然生物活性抗菌肽)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后利用垂直板電泳對表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測，通過與對照菌總蛋白量進(jìn)行對比，確定重組菌中GAD蛋白的表達(dá)。

(1)活化重組乳酸菌L.lactis NZ-CsGAD至5ml GM17液體培養(yǎng)基中(含有10ng/mL Chl⁺)，30℃靜置培養(yǎng)過夜，隨后按照5％接種量放大培養(yǎng)至50ml GM17培養(yǎng)基(含有10ng/mL Chl+，2ng/mL nisin)，以導(dǎo)入NZ9000空載體的乳酸菌作為對照菌同時進(jìn)行處理。誘導(dǎo)培養(yǎng)8h后收集細(xì)胞，用無菌生理鹽水洗滌2次后加入50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)，冰浴下超聲破碎5min，離心取上清，加入上樣緩沖液后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

上述GM17肉湯培養(yǎng)基是M17肉湯培養(yǎng)基補(bǔ)充濃度為5g/L的葡萄糖溶液，即為GM17肉湯培養(yǎng)基，M17肉湯培養(yǎng)基為常見商業(yè)用乳酸菌培養(yǎng)基，成分為每升水中加入：植物蛋白胨5g，酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗壞血酸0.5g，牛肉膏2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.01g，甘油磷酸二鈉19g。

(2)通過電泳圖譜檢測發(fā)現(xiàn)(如圖6所示)PNZ8048-CsGAD重組菌相比對照菌而言，上清液中有一明顯的表達(dá)條帶，經(jīng)與蛋白Marker對比，分子量約為56KD，與目標(biāo)蛋白GAD的分子量一致，說明CsGAD蛋白成功在乳酸菌L.lactis中被表達(dá)。

3.重組菌生長活力檢測

對表達(dá)成功的重組菌進(jìn)行生長曲線的測定，以導(dǎo)入NZ9000空載體的乳酸菌作為對照菌。按照上述方法在正常情況下對重組菌和對照菌進(jìn)行培養(yǎng)，并測定它們的生長曲線，如圖1所示，重組菌與對照菌的生長曲線相比發(fā)生了明顯的變化(對照菌中同樣添加nisin)。其中對照菌大概在6h達(dá)到了穩(wěn)定期，而重組菌大約在8h達(dá)到穩(wěn)定期，但是重組菌到達(dá)穩(wěn)定期的最大生物量(OD600)大約是對照菌的1.5倍，說明重組PNZ8048-CsGAD質(zhì)粒在表達(dá)GAD的蛋白情況下大大提高了乳酸菌的生長活力。

4.抗脅迫能力的比較

(1)低溫脅迫下耐受力試驗

將第3步中的重組菌培養(yǎng)液按照5％的接種量分別接種于新鮮的GM17肉湯液體培養(yǎng)基(含有10ng/mL Chl+，2ng/mL nisin)中。根據(jù)前期測定生長曲線，分別培養(yǎng)至對數(shù)期中期、穩(wěn)定期前期和穩(wěn)定期中后期，取這3個時期的發(fā)酵菌液，4℃，6000r/min離心5min分鐘后，去上清，無菌生理鹽水洗滌2次后，用等量的新鮮的GM17液體培養(yǎng)基重懸后，1mL/管分裝，置于4℃和-20℃溫度下，每隔一段時間，取出經(jīng)無菌生理鹽水洗滌、離心后，按1:10，1:100，1:1000的稀釋度點(diǎn)種于含10ng/mL氯霉素的GM17固體平板，根據(jù)所得的數(shù)據(jù)計算存活個數(shù)。

低溫脅迫實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)至穩(wěn)定前期的乳酸菌抗凍能力要好于對數(shù)期中期和穩(wěn)定后期兩個培養(yǎng)階段，其存活菌個數(shù)大大高于其他兩個階段(見圖2,3,4)，但是無論在哪個培養(yǎng)階段，無論是出于4℃冷藏還是-20℃冷凍脅迫下，重組菌的存活數(shù)目均遠(yuǎn)高于對照菌幾個數(shù)量級，說明通過在L.lactis NZ9000中表達(dá)CsGAD蛋白的方法可以極為顯著地提高乳酸乳球菌的抗凍脅迫能力。

(2)酸脅迫條件下耐受性試驗

將活化后的種子培養(yǎng)液按照5％的接種量分別接種于新鮮的GM17肉湯液體培養(yǎng)基(10ng/mL氯霉素，2ng/mL nisin)中，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD 2.0，將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液以4％的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的GM17(10ng/mLChl⁺，2ng/mL nisin，pH 5.0，乳酸調(diào)節(jié))培養(yǎng)基中。分別測定重組菌和對照菌在脅迫條件下的生長性能。

結(jié)果如圖5所示。經(jīng)生長性能試驗分析，重組乳酸菌盡管在酸性生長條件下生物量下降，達(dá)到穩(wěn)定期的時間延長，但是相對于對照菌的生物量仍然提高了約1.3倍，說明在L.lactis NZ9000中表達(dá)了CsGAD蛋白后，菌株耐酸性明顯增強(qiáng)。

依據(jù)脅迫實驗分析，可知在L.lactis NZ9000中表達(dá)了CsGAD蛋白后，菌株抵御冷凍脅迫和酸脅迫的能力顯著提高。說明通過在L.lactis NZ9000中表達(dá)CsGAD蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌脅迫抗性。

本發(fā)明通過在乳酸菌中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)GABA的GAD基因，實現(xiàn)了提高乳酸乳球菌耐低溫脅迫和酸脅迫兩種能力的目的。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種增強(qiáng)乳酸菌耐脅迫能力的GAD基因及其應(yīng)用

<130> 0

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1482

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 1

atggttctgt caaagacaac atcgggggcg agcgatgtat ccgtccactc aaccttcgct 60

tctcgatacg tccgaacacc gcttcctagg ttcaaaatgc cggaaaattc aataccaaag 120

gaagcggcat cgcagataat aaatgacgag ttgatgctgg atgggaatcc aaggctgaat 180

ttggcgtcgt tcgtgacaac gtggacggag ccagagtgcg ataagctcat catggcttcc 240

attaacaaga actatgtcga tatggatgag taccctgtca ccaccgaact ccagaaccgg 300

tgtgtaaaca tgatagcaga tttatttcat gcaccactgg gagacggaga ggctgcagta 360

ggagtgggaa cagttggatc atcggaggca ataatgctgg ctggtttagc attcaagaga 420

aagtggcaga acaagatgaa agctcttggc aaaccctatg ataatcccaa cattgtcacc 480

ggtgccaatg ttcaggtatg ttgggagaaa tttgcaaggt attttgaagt ggagttgaag 540

gaggtgaagc tgagggaagg gtactatgtg atggacccaa ctaaggctgt ggagatggtt 600

gatgagaaca ctatctgtgt tgctgctatt ttgggttcca cactaaatgg agaattcgag 660

gacgttaagc tcttgaatga cctcttgaca gagaagaaca aacaaacagg atgggataca 720

ccaatacatg tagatgcagc aagtggtgga ttcatagcac cattcttgta cccggagctg 780

gagtgggatt tcaggctgga actggtgaag agtataaatg ttagcggaca caagtatgga 840

cttgtgtatg caggtattgg ttggtgcatt tggaggagca aagagaactt gcctgatgaa 900

ctcatctttc atatcaacta tcttggagct gatcaaccca cttttaccct caacttctcc 960

aaaggttcta gtcaagtaat tgctcagtac tatcaactca ttcgcttggg ttttgaggga 1020

tacaagaaca taatggagaa ttgccaagaa aatgcaatga tgcttaaaga aggattggag 1080

aagacaggac ggttcgacat agtgtccaag gacaatggag tcccactagt ggccttctca 1140

ctgaaagaca acagctgtca caacgaattc gaagtgtcag acttgttgcg ccgctttgga 1200

tggatcgtcc ccgcctacac catgcccccc gacgcccaac acataaccgt gctgcgagtt 1260

gtcattaggg aagacttctc gcgcaccctt gcagagcgcc ttgttagtga catccagaaa 1320

gtcttgctcg agctagatag cctccctgca agggttagtg ccaagatggc tgtagtccaa 1380

gagtcagttg tcaagaaaac tgatcttgag gtgcagaggg agatcactga tgcttggaaa 1440

aggtttgtcc tcagtaggaa gaagactaat ggtgtttgct aa 1482

<210> 2

<211> 493

<212> PRT

<213> Camellia sinensis

<400> 2

Met Val Leu Ser Lys Thr Thr Ser Gly Ala Ser Asp Val Ser Val His

1 5 10 15

Ser Thr Phe Ala Ser Arg Tyr Val Arg Thr Pro Leu Pro Arg Phe Lys

20 25 30

Met Pro Glu Asn Ser Ile Pro Lys Glu Ala Ala Ser Gln Ile Ile Asn

35 40 45

Asp Glu Leu Met Leu Asp Gly Asn Pro Arg Leu Asn Leu Ala Ser Phe

50 55 60

Val Thr Thr Trp Thr Glu Pro Glu Cys Asp Lys Leu Ile Met Ala Ser

65 70 75 80

Ile Asn Lys Asn Tyr Val Asp Met Asp Glu Tyr Pro Val Thr Thr Glu

85 90 95

Leu Gln Asn Arg Cys Val Asn Met Ile Ala Asp Leu Phe His Ala Pro

100 105 110

Leu Gly Asp Gly Glu Ala Ala Val Gly Val Gly Thr Val Gly Ser Ser

115 120 125

Glu Ala Ile Met Leu Ala Gly Leu Ala Phe Lys Arg Lys Trp Gln Asn

130 135 140

Lys Met Lys Ala Leu Gly Lys Pro Tyr Asp Asn Pro Asn Ile Val Thr

145 150 155 160

Gly Ala Asn Val Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Ala Arg Tyr Phe Glu

165 170 175

Val Glu Leu Lys Glu Val Lys Leu Arg Glu Gly Tyr Tyr Val Met Asp

180 185 190

Pro Thr Lys Ala Val Glu Met Val Asp Glu Asn Thr Ile Cys Val Ala

195 200 205

Ala Ile Leu Gly Ser Thr Leu Asn Gly Glu Phe Glu Asp Val Lys Leu

210 215 220

Leu Asn Asp Leu Leu Thr Glu Lys Asn Lys Gln Thr Gly Trp Asp Thr

225 230 235 240

Pro Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Ile Ala Pro Phe Leu

245 250 255

Tyr Pro Glu Leu Glu Trp Asp Phe Arg Leu Glu Leu Val Lys Ser Ile

260 265 270

Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Ala Gly Ile Gly Trp

275 280 285

Cys Ile Trp Arg Ser Lys Glu Asn Leu Pro Asp Glu Leu Ile Phe His

290 295 300

Ile Asn Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Pro Thr Phe Thr Leu Asn Phe Ser

305 310 315 320

Lys Gly Ser Ser Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Gln Leu Ile Arg Leu

325 330 335

Gly Phe Glu Gly Tyr Lys Asn Ile Met Glu Asn Cys Gln Glu Asn Ala

340 345 350

Met Met Leu Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Gly Arg Phe Asp Ile Val

355 360 365

Ser Lys Asp Asn Gly Val Pro Leu Val Ala Phe Ser Leu Lys Asp Asn

370 375 380

Ser Cys His Asn Glu Phe Glu Val Ser Asp Leu Leu Arg Arg Phe Gly

385 390 395 400

Trp Ile Val Pro Ala Tyr Thr Met Pro Pro Asp Ala Gln His Ile Thr

405 410 415

Val Leu Arg Val Val Ile Arg Glu Asp Phe Ser Arg Thr Leu Ala Glu

420 425 430

Arg Leu Val Ser Asp Ile Gln Lys Val Leu Leu Glu Leu Asp Ser Leu

435 440 445

Pro Ala Arg Val Ser Ala Lys Met Ala Val Val Gln Glu Ser Val Val

450 455 460

Lys Lys Thr Asp Leu Glu Val Gln Arg Glu Ile Thr Asp Ala Trp Lys

465 470 475 480

Arg Phe Val Leu Ser Arg Lys Lys Thr Asn Gly Val Cys

485 490