專利名稱：一株可耐受糠醛產(chǎn)l-乳酸的芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株可耐受糠醛產(chǎn)L-乳酸的芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳酸(Lactic Acid)又名二羥基丙酸，是世界三大有機酸之一。作為一種傳統(tǒng)的多用途精細化學(xué)品，乳酸可作為酸味劑、芳香劑、防腐劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、生物可降解性材料、藥物和農(nóng)藥等，應(yīng)用于食品、制藥、釀造、制革、紡織、環(huán)保和農(nóng)業(yè)中。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品安全性高，而且能專一性的得到光學(xué)純?nèi)樗幔谴笠?guī)模生產(chǎn)乳酸的主要方法。L-乳酸的生產(chǎn)成本是制約聚乳酸規(guī)?；瘧?yīng)用的關(guān)鍵因素之一。提高發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸過程中發(fā)酵液中L-乳酸的濃度有利于降低成本。纖維生物質(zhì)原料具有非糧資源的優(yōu)勢，有利于降低乳酸生產(chǎn)的原料成本，是控制L-乳酸生產(chǎn)成本的有效途徑。但是，纖維素水解液在制取過程中，會產(chǎn)生大量的糠醛物質(zhì)。而糠醛對微生物會產(chǎn)生抑制作用，降低產(chǎn)量和產(chǎn)率。因此，篩選出能耐受高濃度糠醛、生產(chǎn)高濃度L-乳酸的菌株對于利用纖維素原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株可耐受糠醛產(chǎn)L-乳酸的芽孢桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)具體為芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38,是從山東省臨沂市某污水處理廠的活性底泥中篩選得到的。該芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38已于2013年3月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN0.7312。 芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312在營養(yǎng)瓊脂上菌落平坦，乳白色，菌落形狀不規(guī)則，革蘭氏陽性。兼性厭氧。耐受糠醛，能在6.0g/L的糠醛濃度條件下生長且不明顯抑制產(chǎn)酸。可利用葡萄糖、蔗糖、木糖和一些其他糖產(chǎn)酸。其16S rRNA基因序列如序列表中序列I所示。本發(fā)明的再一個目的是提供一種菌劑。本發(fā)明所提供的菌劑，其活性成分為所述芽孢桿菌(Baci I Ius sp.) P38CGMCCN0.7312。本發(fā)明的還一個目的是提供一種生產(chǎn)L-乳酸的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)L-乳酸的方法，具體是將所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38CGMCC N0.7312，或所述菌劑接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵液中獲得L-乳酸。 在所述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基可含有糠醛，也可不含有糠醛。在所述方法中，所 述糠醛在所述發(fā)酵培養(yǎng)基的終濃度小于等于6.0g/L，具體如1、2、3、4、5 或 6g/L。在所述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和用于控制發(fā)酵液pH的中和劑；在本發(fā)明中，所述碳源具體為葡萄糖；所述葡萄糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為 40g/L-60g/L,如 50g/L ；在本發(fā)明中，所述氮源具體為酵母粉；所述酵母粉在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為 5g/L-10g/L，如 10g/L ；在本發(fā)明中，所述中和劑具體為碳酸鈣；所述碳酸鈣在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為所述葡萄糖質(zhì)量的60%。具體的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:糠醛0_6g/L ;葡萄糖40-60g/L ;酵母粉5-10g/L ;碳酸鈣所述葡萄糖濃度的60% ；pH7.6。更加具體的，在本發(fā)明的一個實施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:葡萄糖50g/L ;酵母粉10g/L ;碳酸鈣所述葡萄糖濃度的60% ；pH7.6。

在本發(fā)明的另一個實施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:糠醛6g/L ;葡萄糖50g/L ;酵母粉10g/L ;碳酸鈣所述葡萄糖濃度的60% ；pH7.6。在所述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度可為30_50°C，如37_50°C或30_42°C，再如37-42°C。在本發(fā)明的一個實施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度具體為30°C、37°C、42°C*50°C。在所述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間可為12-72小時，如36_72h，再如36h或72h。在所述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的方式可為靜置培養(yǎng)。在所述方法中，還可將所述芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312先接入如下種子培養(yǎng)基中，在42°C靜置培養(yǎng)36小時，再接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基；所述種子培養(yǎng)基每升中含有:葡萄糖50.0克，酵母粉10.0克，碳酸鈣30.0克，余量為水；所述種子培養(yǎng)基的ρΗ7.6。本發(fā)明的又一個目的是提供所述菌劑的制備方法。本發(fā)明所提供的所述菌劑的制備方法，具體包括如下步驟:將所述芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312作為活性成分，得到所述菌劑。本發(fā)明利用芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312可在6g/L糠醛條件下生產(chǎn)L-乳酸，以葡萄糖為底物，在42°C條件下直接發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，72小時內(nèi)，L-乳酸濃度為34.3g/L，光學(xué)純度大于99.9%，轉(zhuǎn)化率大于83%。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌(Bacillussp.) P38CGMCC N0.7312可耐高濃度糠醛，發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸，有利于降低L-乳酸生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。保藏說明分類命名:芽孢桿菌拉丁名:(Bacillussp.)參椐的生物材料:P38保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期:2013年3月13日
保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.731

圖1為芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312在6g/L糠醛條件下直接利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，發(fā)酵液中相應(yīng)葡萄糖和L-乳酸濃度的變化。其中，乳酸即表示L-乳酸。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所涉及的各個參數(shù)的測定方法如下:葡萄糖含量的測定:發(fā)酵液離心后稀釋，采用生物傳感分析儀SBA-40C (山東省科學(xué)院生物研究所)測定。生 物傳感分析儀SBA-40C是以固定化酶為傳感器的分析儀器，葡萄糖與氧氣、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和雙氧水。反應(yīng)放出的雙氧水與白金一銀電極接觸，并產(chǎn)生電流信號，該電流信號與葡萄糖濃度成線性比例關(guān)系，通過測定電流信號強度可得出葡萄糖濃度。L-乳酸含量的測定:采用Agilentl260液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定，有機酸柱(美國Bio-Rad公司，Aminex HPX-87H，ff(5ym)4.6IDX250_，有機酸分離用)，流動相為0.005mol/L硫酸，流速0.6ml/min,進樣量5 μ L，紫外檢測器，檢測波長210nm，操作溫度65°C。L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，貨號為L1750。L-乳酸光學(xué)純度的測定:采用Agilentl260液相色譜儀，配備手性分離柱(日本三菱化學(xué)公司，MCI GEL-CRS10ff,4.6mm IDX50mm，光學(xué)異構(gòu)體分離用)。具體操作條件為:2mM的硫酸銅作為流動相，流速0.5ml/min,進樣量10 μ 1，紫外檢測器，檢測波長254nm，操作溫度25°C。利用L-乳酸和D-乳酸標準品做出標準曲線，再根據(jù)標準曲線計算出發(fā)酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。光學(xué)純度(optical purity)是衡量旋光性樣品中一個對映體超過另一個對映體的量的量度，它可用對映體過量值(enantiomeric excess)表示。本發(fā)明中L-乳酸的光學(xué)純度按以下公式計算:L-乳酸含量+ (L-乳酸含量+D-乳酸含量)X 100%。糖酸轉(zhuǎn)化率定義為:L_乳酸產(chǎn)量(克/升)+總葡萄糖的消耗量(克/升)X 100%。下述實施例中所用到的酵母粉均購自安琪酵母股份有限公司。實施例1、芽孢桿菌(Bacillus sp.)的分離篩選和鑒定本實施例中所用到的培養(yǎng)基組成如下:篩選培養(yǎng)基(g/L):纖維素水解液50.0mL，酵母粉10.0,CaC0330.0，余量為蒸餾水，pH7.6。115°C高溫滅菌10分鐘。其中，纖維素水解液的制備方法如下:將干燥的玉米秸桿與質(zhì)量百分含量為1%的稀硫酸按1:5的質(zhì)量比混合，在120-130°C保溫2-3小時進行水解，之后通過中和脫酸、活性炭脫色、減壓蒸發(fā)濃縮、經(jīng)離子交換脫離子后得到纖維素水解液，所得纖維素水解液中的總還原糖含量為1300g/L。糠醛濃度梯度培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50.0，酵母粉10.0,CaC0330.0，糠醛(1.0,2.0,
3.0,4.0,5.0,6.0,7.0，8.0 或 9.0)，余量為蒸餾水，ρΗ7.6。115°C高溫滅菌 10 分鐘。
固體培養(yǎng)基:在篩選培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂。一、芽孢桿菌(Bacillus sp.)的分離篩選從中國山東省臨沂市某污水處理廠的活性底泥，取約Iml活性底泥樣品3份，分別接種于三個裝有20ml無菌水的IOOml三角瓶中，混勻并分別于30°C，40°C和50°C靜置過夜，取樣后用無菌水稀釋10000倍涂布于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24小時，將產(chǎn)生溶鈣圈(部分單菌落由于產(chǎn)酸將菌落周圍培養(yǎng)基中的碳酸鈣溶解而形成透明圈)的單菌落劃線接種到新的固體培養(yǎng)基平板上，分別在不同溫度條件下靜置培養(yǎng)24小時，劃線純化后取溶鈣圈明顯的單菌落接種到新的固體培養(yǎng)基斜面上擴增培養(yǎng)并編號，之后取菌接種到制備好的糠醛濃度梯度培養(yǎng)基平板(在糠醛濃度梯度培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂)上，36小時培養(yǎng)結(jié)束時，觀察各菌株在各糠醛濃度梯度培養(yǎng)基平板上的生長情況及溶鈣圈的大小，并將目的菌株接種到相應(yīng)糠醛濃度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時取樣檢測菌株生長情況，并測定培養(yǎng)液中L-乳酸濃度。最終在42°C的培養(yǎng)體系中，獲得一株能夠耐受6g/L糠醛生長并產(chǎn)L-乳酸的菌株。將該菌株命名為P38。二、芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38 的鑒定從形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性幾個方面對步驟一獲得的菌株P(guān)38進行鑒定。其中，形態(tài)特征觀察和生理生化特性鑒定參見“伯杰細菌鑒定手冊”(第八版)和“常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京:科學(xué)出版社，2001.2)中描述的方法。1、形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果表明步驟一分離篩選得到的菌株為革蘭氏陽性菌，能夠形成孢子、又能產(chǎn)生乳酸、兼性厭氧。在固體培養(yǎng)基表面表面菌落平坦，菌落形狀不規(guī)則，乳白色。耐糠醛，能夠在O 6g/L的糠醛濃度下生長而無明顯抑制產(chǎn)酸現(xiàn)象。2、生理生化特征鑒定經(jīng)生理生化特征鑒定，結(jié)果表明步驟一分離篩選得到的菌株P(guān)38可利用葡萄糖、蔗糖、木糖和一些其他糖產(chǎn)酸，主要產(chǎn)物是L-乳酸。能夠在30°C -50°C生長。3、16S rRNA基因序列同源性分析TE緩沖液:10mmol/L的三輕甲基氨基甲燒(Tris)、lmmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用鹽酸調(diào)整pH為8.0。16S rRNA基因序列同源性分析的具體操作如下:從固體培養(yǎng)的平板上取適量步驟一分離得到的菌株P(guān)38加到50 μ I TE緩沖液中，95°C處理10分鐘，獲得處理液。以上述處理液作為模板，利用購自上海生工生物工程有限公司的真細菌引物27f和1492r，進行PCR擴增。所述的27f引物序列為:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；所述1492r引物序列為:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。在50 μl反應(yīng)體系依次混勻下列試劑:35.75 μl H2O, 5 μl的PCR反應(yīng)緩沖液，4 μl dNTP混合液，2 μl的27f弓丨物，2 μl的1492r弓丨物，1 μl模板，0.25 μl Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘。將混合物在94°C加熱5分鐘。94°C變性1分鐘，50°C退火1分鐘，72°C延伸2分鐘，總共30個循環(huán)。最后一個循環(huán)后，于72°C下保溫10分鐘，使反應(yīng)混合物擴增充分，得到菌株P(guān)38的16S rRNA基因的PCR擴增產(chǎn)物，將產(chǎn)物測序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟件完成，序列比對通過美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)在線完成。測序結(jié)果表明，步驟一獲得的菌株P(guān)38的16S rRNA基因序列長度為1424bp，如序列表中序列I所示。鑒于上述形態(tài)、生理生化特征分析和16S rRNA基因序列同源性分析結(jié)果，將步驟一分離篩選得到的菌株P(guān)38鑒定為芽孢桿菌(Bacillus sp.)。該芽孢桿菌(Bacillussp.)已于2013年3月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN0.7312。 實施例2、芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的最佳反應(yīng)溫度的測定(三角瓶)本實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下:液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50.0，酵母粉10.0, CaC0330.0，余量為蒸餾水，pH7.6。115 °C高溫滅菌10分鐘。固體平板培養(yǎng)基:在上述液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂。本發(fā)明菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的最佳反應(yīng)溫度的測定方法包括以下步驟:(I)平板培養(yǎng):芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38CGMCC N0.7312菌種接種于固體平板培養(yǎng)基上，42 °C培養(yǎng)24小時；(2)種子培養(yǎng):將步驟(I)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有50ml液體培養(yǎng)基的IOOml三角瓶中，42°C靜置培養(yǎng)36小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng):在裝有50ml液體培養(yǎng)基的IOOml三角瓶中接入5ml步驟(2)的種子培養(yǎng)液，放置于30°C、37°C、42°C、50V或60V靜置培養(yǎng)36小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束時，取發(fā)酵液，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液，根據(jù)上述方法檢測發(fā)酵液中生成的L-乳酸的濃度。實驗重復(fù)進行三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示，30°C培養(yǎng)溫度下，L-乳酸產(chǎn)量為21克/升；37°C培養(yǎng)溫度下，L-乳酸產(chǎn)量為36克/升；42°C培養(yǎng)溫度下，L-乳酸產(chǎn)量為44克/升；50°C培養(yǎng)溫度下，L-乳酸產(chǎn)量為40克/升；60°C培養(yǎng)溫度下，L-乳酸產(chǎn)量為O克/升。以上結(jié)果顯示芽孢桿菌(Bacillussp.) P38CGMCC N0.7312利用葡萄糖的最佳發(fā)酵溫度為42°C。實施例3、芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38CGMCC N0.7312在糠醛梯度濃度條件下產(chǎn)酸情況(三角瓶)本實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下:液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50.0，酵母粉10.0, CaC0330.0，余量為蒸餾水，pH7.6。115 °C高溫滅菌10分鐘。固體平板培養(yǎng)基:在上述液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂。糠醛濃度梯度培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50.0，酵母粉10.0，CaC0330.0，糠醛(0，1.0，
2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0，8.0 或 9.0)，余量為蒸餾水，ρΗ7.6。115°C高溫滅菌 10 分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟:( I)斜面培養(yǎng):同實施例2 ；(2)種子培養(yǎng):同實施例2 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng):在裝有50ml含有不同糠醛濃度發(fā)酵培養(yǎng)基的IOOml三角瓶中分別接入5ml步驟(2)的種子培養(yǎng)液，放置于42°C靜置培養(yǎng)72小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束時，取發(fā)酵液，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中L-乳酸濃度。實驗重復(fù)進行三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示，在Og/L的糠醛條件下，L-乳酸產(chǎn)量為29g/L ;在lg/L的糠醛條件下，L-乳酸產(chǎn)量為28g/L ;在2g/L的糠醛條件下，L-乳酸產(chǎn)量為27g/L ;在3g/L的糠醛條件下，L-乳酸產(chǎn)量為27g/L ;在4g/L的糠醛條件下，L-乳酸產(chǎn)量為27g/L ;在5g/L的糠醛條件下，L-乳酸產(chǎn)量為27g/L ;在6g/L的糠醛條件下，L-乳酸產(chǎn)量為27g/L ;而當(dāng)糠醛濃度超過6g/L后，菌體L-乳酸產(chǎn)量顯著降低，糠醛濃度達到9g/L后，菌體不產(chǎn)L-產(chǎn)酸。這一結(jié)果表明，芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38CGMCC N0.7312可以最高耐受6g/L的糠醛，并且在6g/L的糠醛濃度條件下，L-乳酸發(fā)酵水平與不加糠醛的對照相比沒有明顯降低，這一結(jié)果顯示了該菌良好的糠醛耐受能力，具有工業(yè)應(yīng)用潛力。實施例4、芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312在6g/L糠醛條件下直接利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下:液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50.0，酵母粉10.0, CaC0330.0，余量為蒸餾水，pH7.6。115 °C高溫滅菌10分鐘。固體平板培養(yǎng)基:在上述液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50.0，酵母粉10.0,CaC0330.0，糠醛6.0，余量為蒸餾水，pH7.6。115°C高溫滅菌10分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟:(I)斜面培養(yǎng):同實施例2 ；(2)種子培養(yǎng):同實施例2 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng):向裝有0.9升的發(fā)酵培養(yǎng)基的3升錐形瓶中加入100毫升步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液，42°C靜置培養(yǎng)72小時。發(fā)酵結(jié)束時，取發(fā)酵液，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液(發(fā)酵體系)中L-乳酸濃度及其光學(xué)純度、糖酸轉(zhuǎn)化率。同時在發(fā)酵過程中，定時取樣，檢測發(fā)酵液中L-乳酸的濃度以及葡萄糖的消耗情況。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖1和表I所示，從結(jié)果可以看出，芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCCN0.7312能夠耐受6.0g/L糠醛，在42°C條件下以葡萄糖為底物直接發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，72小時發(fā)酵結(jié)束，L-乳酸濃度為34.3克/升發(fā)酵液，其光學(xué)純度達到99.9%，糖酸轉(zhuǎn)化率超過83%?？梢?，本發(fā)明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312可耐受6g/L糠醛，發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸，有利于降低L-乳酸生產(chǎn)成本，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。表I利用葡萄糖發(fā)酵L-乳酸3次重復(fù)實驗的結(jié)果
權(quán)利要求
1.芽孢桿菌(Bacillussp.)P38，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.7312。
2.一種菌劑，其特征在于:所述菌劑的活性成分為權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312。
3.一種生產(chǎn)L-乳酸的方法，是將權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38CGMCCN0.7312，或權(quán)利要求2所述的菌劑接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵液中獲得L-乳酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有糠醛。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述糠醛在所述發(fā)酵培養(yǎng)基的終濃度小于等于6.0g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和用于控制發(fā)酵液pH的中和劑； 所述碳源具體為葡萄糖；所述葡萄糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為40-60g/L ;或 所述氮源具體為酵母粉；所述酵母粉在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為5-10g/L ;或 所述中和劑具體為碳酸鈣；所述碳酸鈣在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為所述葡萄糖質(zhì)量的 60%。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:糠醛0-6g/L ;葡萄糖40-60g/L ;酵母粉5-10g/L ;碳酸鈣所述葡萄糖濃度的60% ；pH7.6。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-50。。。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為12-72小時；或 所述發(fā)酵培養(yǎng)的方式為靜置培養(yǎng)。
10.權(quán)利要求2所述菌劑的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.) P38CGMCC N0.7312作為活性成分，得到所述菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可耐受糠醛產(chǎn)L-乳酸的芽孢桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌具體為芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.7312。本發(fā)明利用芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38CGMCC No.7312可在6g/L糠醛條件下生產(chǎn)L-乳酸，以葡萄糖為底物，在42℃條件下直接發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，L-乳酸濃度為34.3g/L，光學(xué)純度大于99.9%，轉(zhuǎn)化率大于83%。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)P38CGMCC No.7312可耐高濃度糠醛，發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸，有利于降低L-乳酸生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12P7/56GK103173395SQ20131010465
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者彭麗麗, 王麗敏, 于波, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所