專利名稱：用于微生物發(fā)酵的啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物基因工程領(lǐng)域中的啟動子及其應(yīng)用，特別是涉及一種用于微生物發(fā)酵的啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代的微生物基因工程涉及一系列的基因操作，包括利用強(qiáng)啟動子對某些關(guān)鍵酶進(jìn)行過量表達(dá)，例如，在實(shí)驗(yàn)室甚至在商業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，都會利用來自噬菌體的T7啟動子， 以大腸桿菌為宿主細(xì)胞進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)。但T7啟動子有其局限性，它在大腸桿菌進(jìn)行厭氧生長時的轉(zhuǎn)錄效率不高，許多外源蛋白利用厭氧發(fā)酵獲得的表達(dá)多是利用了宿主細(xì)胞在有氧生長時積累的mRNA ;該啟動子的另一個缺點(diǎn)是需要價格不廉的誘導(dǎo)物才能進(jìn)行。另夕卜，該啟動子的作用特點(diǎn)也不適合那些需要在厭氧環(huán)境下進(jìn)行催化反應(yīng)的酶蛋白的生產(chǎn)， 因?yàn)檫@類對氧化還原電位敏感的酶蛋白，在有氧環(huán)境下表達(dá)時，蛋白結(jié)構(gòu)因?yàn)檠趸木壒释荒艿玫秸_折疊，或因?yàn)橹辉趨捬醐h(huán)境下才表達(dá)的伴侶蛋白的缺失而失活，因此，這類蛋白往往需要特殊的厭氧啟動子進(jìn)行表達(dá)。
出于對減少污染物排放、石油資源的日益枯竭等主客觀因素的影響下，對利用生物質(zhì)廢棄物為原料，以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大宗化學(xué)中間體的研究十分迫切，一些化學(xué)品的生物法生產(chǎn)甚至已完全替代以前的石油化工法。盡管如此，這一綠色產(chǎn)業(yè)的興起還需要大量的基礎(chǔ)研究和下游的中試發(fā)酵優(yōu)化研究，這其中非常重要的一個環(huán)節(jié)是開發(fā)出高效的厭氧啟動子元件，而國內(nèi)外對于專門用于厭氧發(fā)酵的高效啟動子所作的研究并不多，很多研究機(jī)構(gòu)還是使用傳統(tǒng)的高效啟動子，如T7啟動子進(jìn)行厭氧環(huán)境下蛋白的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)室中，誘導(dǎo)物所占生產(chǎn)成本不被視作問題，但實(shí)際的綠色化工產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)則對成本十分敏感，同時因?yàn)檫@類化學(xué)中間體在微生物細(xì)胞內(nèi)的合成通常是由一個包含電子傳遞在內(nèi)的生化反應(yīng)完成的，因此，常常需要經(jīng)過厭氧發(fā)酵才能完成，此時T7啟動子在耗時常達(dá)數(shù)天的發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用中的實(shí)際效率不能令人滿意。因此，開發(fā)出高效地用于厭氧發(fā)酵的特殊啟動子不僅是一種重要的基礎(chǔ)研究，更是當(dāng)前綠色生物產(chǎn)業(yè)的一種實(shí)際需求。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于微生物發(fā)酵的啟動子及其應(yīng)用。該啟動子可用于微生物的厭氧或兼性厭氧發(fā)酵，以生產(chǎn)化學(xué)中間體。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明中的用于微生物發(fā)酵的啟動子，包括選自下列核苷酸序列中的一種:
I)如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；
2)如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；
3)如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；
4)如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；
5)在嚴(yán)格條件下與 SEQ ID N0.1 、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的核苷酸序列雜交且具有相同啟動子功能的核苷酸序列；
6)對 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失或添加修飾且具有相同啟動子功能的核苷酸序列；
7)與 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有相同啟動子功能的核苷酸序列。
其中，SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列如下:
ccttctcttttactcgtttagcaaccggctaaacatccccaccgcccggccaaaagaaaaataggtcca tttttatcgctaaa agataaatccacacagtttgtattgttttgtgcaaaagtttcactacgctttattaacaata ctttctggcgacgtgcgccagtg cagaaggatgagctttcgttttcagcatctcacgtgaagcgatggtttgcctt gctacagggacgtcgcttgccgaccataag cgcccggtgtcctgccggtgtcgcaa
SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列如下:
tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgatg aaataaagttagttt attggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaacttgttcacttaaatca acccgggaacaa
SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列如下:
ccttctcttttactcgtttagcaaccggctaaacatccccaccgcccggccaaaagaaaaataggtcca tttttatcgctaaa agataaatccacacagtttgtattgttttgtgcaaaagtttcactacgctttattaacaata ctttctggcgacgtgcgccagtg cagaaggatgagctttcgttttcagcatctcacgtgaagcgatggtttgcctt gctacagggacgtcgcttgccgaccataag cgcccggtgtcctgccggtgtcgcaaaattcgaggaaacatatg
SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列如下:
Gaattctagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtat atgatgaaataaagt Tagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaacttgttcactt aaatcaacccgggaacaaggag gaataacatatg
所述用于微生物發(fā)酵的啟動子，優(yōu)選為如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。
所述如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，其制備方法如下:
提取大腸桿菌BW25113細(xì)胞的基因組DNA作為模板，利用該模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到，其中，PCR擴(kuò)增中的上游引物序列如SEQ ID N0.7所示、下游引物序列如SEQ ID N0.8所/Jn ο
另外，本發(fā)明還公開 了一種引物對，該引物對是擴(kuò)增上述啟動子全長或其任意片段的引物對。
本發(fā)明還公開了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有上述啟動子，優(yōu)選為含有上述啟動子的質(zhì)粒 pENA-TA、pCNA-PHC 或 pENX-TA。
本發(fā)明還公開了一種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞含有上述表達(dá)載體，優(yōu)選為含有上述表達(dá)載體(如含有上述啟動子的質(zhì)粒pENA-TA、pCNA-PHC及pENX-TA)的大腸桿菌BW25113 細(xì)胞。
本發(fā)明還公開了一種調(diào)控用于發(fā)酵的微生物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括: 將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入用于發(fā)酵的微生物中；其中，用于發(fā)酵的微生物，包括:產(chǎn)丁醇的大腸桿菌。
本發(fā)明還公開了一種上述啟動子的應(yīng)用，所述啟動子在調(diào)控用于發(fā)酵的微生物中目的基因表達(dá)的用途；其中，目的基因包括:用于合成丁醇的酶基因。
本發(fā)明還公開了一種上述啟動子的應(yīng)用，所述啟動子在制備用于厭氧或兼性厭氧發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)中間體的微生物中的應(yīng)用(或上述啟動子在微生物的厭氧或兼性厭氧發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)中間體中的應(yīng)用)。優(yōu)選地，所述啟動子在制備用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)中間體的微生物中的應(yīng)用；其中，所述微生物包括:大腸桿菌；化學(xué)中間體包括:丁醇。
本發(fā)明中，出于微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)中的啟動子需要問題，經(jīng)過篩選天然啟動子， 開發(fā)出兩種可高效轉(zhuǎn)錄、用于微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的啟動子Phya (SEQ ID N0.1所示)和Pxya (SEQ ID N0.2所示)。其中，啟動子Phya (SEQ ID N0.1所示)可從大腸桿菌BW25113中以 PCR方式獲得。
另外，對于啟動子Phya和Pxya經(jīng)人工設(shè)計(jì)改進(jìn)后，本發(fā)明還提供了這兩種啟動子的優(yōu)化序列，其中包含為方便DNA克隆所設(shè)計(jì)的內(nèi)切酶位點(diǎn)序列，即優(yōu)化后的啟動子Phya 和Pxya的序列分別如SEQ ID N0.3所示和SEQ ID N0.4所示。
啟動子Pxya可進(jìn)行高效的厭氧轉(zhuǎn)錄，但與Phya不同的是，其在有氧環(huán)境下也有轉(zhuǎn)錄活性，適合在厭氧環(huán)境時工作，但在有氧環(huán)境下蛋白功能不受影響的工業(yè)酶類表達(dá)；啟動子Phya感受培養(yǎng)基中的氧化還原電位，只在厭氧環(huán)境下自發(fā)啟動，適合需要對氧氣敏感的蛋白質(zhì)的表達(dá)及其所進(jìn)行的催化反應(yīng)的進(jìn)行。
作為本發(fā)明的啟動子改進(jìn):啟動子還包括序列表所示的核苷酸序列中添加、刪除和缺失等操作所產(chǎn)生有核苷酸序列變化的突變休和衍生物，或與其它核苷酸序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與以上所述序列進(jìn)行雜交，獲得的具有相同功能的核苷酸序列。
使用啟動子Phya和Pxya，可以讓包括大腸桿菌在內(nèi)的微生物能夠在厭氧環(huán)境下， 高效表達(dá)所需的催化酶，且無需誘導(dǎo)物，如以產(chǎn)丁醇大腸桿菌為目標(biāo)時，分別使用了 Phya 和Pxya，構(gòu)建了產(chǎn)丁醇合成途徑生物酶的表達(dá)質(zhì)粒(如說明書附圖)，這些表達(dá)質(zhì)粒成功地表達(dá)五個合成丁醇的酶，在宿主細(xì)胞構(gòu)建了外源的丁醇合成途徑，從而以葡萄糖為底物，發(fā)酵生產(chǎn)出丁醇。這兩種啟動子的序列可以部分修改或優(yōu)化，以方便表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，經(jīng)部分修改或優(yōu)化后的啟動子序列仍然可以高效表達(dá)，基因工程大腸桿菌的產(chǎn)丁醇水平不變。
同樣，許多化學(xué)中間體也可以由生物質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生，隨著石油資源的枯竭及對環(huán)境污染問題的重視，生物發(fā)酵法生產(chǎn)這些化工原料的技術(shù)研究日益重要。而許多化學(xué)中間體原料的生成是由厭氧環(huán)境的電子傳遞過程中催化產(chǎn)生的，許多基因工程菌利用外源特異性的酶催化這些反應(yīng)，因此，高效的厭氧啟動子就成了構(gòu)筑基因工程菌必不可少的單元。
綜上所述，本發(fā)明從包括大腸桿菌的微生物細(xì)胞內(nèi)的原始啟動子出發(fā)，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，開發(fā)出基于兩種啟動子的人工合成啟動子序列，成功用于大腸桿菌產(chǎn)丁醇的研究實(shí)例，并證實(shí)了這兩種啟動子在厭氧環(huán)境下的可靠性，而且本發(fā)明的啟動子在厭氧發(fā)酵過程中，無需誘導(dǎo)物，能夠高效地啟動其下游基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。


下面結(jié)合附圖 與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明:
圖1是克隆了 Phya啟動子的表達(dá)質(zhì)粒pENA_TA和pCNA-PHC圖2是克隆了 Pxya啟動子的表達(dá)質(zhì)粒pENX-TA圖。
具體實(shí)施方式
下面再舉具體實(shí)例對本發(fā)明方法予以說明。
實(shí)施例中所用分子生物學(xué)的方法均為公知的常用技術(shù)。另外，關(guān)于實(shí)驗(yàn)材料，除非特別說明均購自商業(yè)公司。
實(shí)施例1構(gòu)建質(zhì)粒pENA-TA和pCNA-PHC并生成產(chǎn)丁醇大腸桿菌菌株
1、質(zhì)粒 pEN-TA/pCN-PHC 的構(gòu)建
首先，由上海生工生物技術(shù)公司利用DNA化學(xué)合成法生成基因片段ter/AdhE2(gp TA基因片段，如SEQ ID N0.5所示)和phaA/hbd/crt (即PHC基因片段，如SEQ ID N0.6 所示)，并將這兩種線性DNA克隆到質(zhì)粒pGEM-T (購自上海生工生物工程公司)中，生成 pGEM-T-TA 及 pGEM-T-PHC 質(zhì)粒。
取來自Novagen公司的pETDuet-Ι和pGEM-T-TA質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Ndel/Xhol 同時雙切，經(jīng)0.7% (0.7g/100mL)的瓊脂糖凝膠電泳回收，以T4DNA連接酶連接質(zhì)粒DNA pETDuet-Ι和TA片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(購自上海生工生物工程公司)，在含氨節(jié)青霉素(100mg/L)的LB培養(yǎng)板上長出轉(zhuǎn)化子,挑取單克隆菌落、以Axygen質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，再由Ndel/Xhol雙酶切及DNA測序(由上海生工生物工程公司提供服務(wù))，鑒定出正確的陽性克隆，獲得的質(zhì)粒命名為pEN-TA。
同樣的，取pACYQ)uet_l (購自Novagen公司)和pGEM-T-PHC質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Ndel/Kpnl同時雙切，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳回收，以T4DNA連接酶連接質(zhì)粒 pACY⑶uet-Ι的DNA片段和PHC片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐氯霉素(30mg/L)的LB培養(yǎng)板上長出轉(zhuǎn)化子,挑取單克隆菌落、以Axygen質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，再由Ndel/Kpnl雙酶切及DNA測序(由上海生工生物工程公司提供服務(wù))，獲得的質(zhì)粒命名為pCN-PHC。
質(zhì)粒pEN-TA和pCN_PHC經(jīng)電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，由含氨芐青霉素 ΙΟΟμ g/ml、氯霉素30μ g/ml的LB瓊脂平板篩選獲得，取菌液進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增。
2、啟動子Phya的克隆
本實(shí)施例中，以 啟動子Phya (SEQ ID N0.1所示)的序列為基礎(chǔ)，并且在其兩端加上了限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和Ndel，形成了優(yōu)化后帶有酶切位點(diǎn)序列的啟動子Phya (SEQ ID N0.3所示)，以用于厭氧表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
優(yōu)化的啟動子Phya (SEQ ID N0.3所示)，可以大腸桿菌BW25113 (購自美國大腸桿菌菌種保藏中心，CGSC)的基因組為模板，通過PCR方式獲得。
其中，優(yōu)化的啟動子Phya (SEQ ID N0.3所示)的引物序列為:
上游引物:ctcgaattccttctcttttactcgtttag(SEQ ID N0.7 所不)
下游引物:tttagttccatatggcacgtctctcctccttgcgac (SEQ ID N0.8 所不)
DNA模板的制取方法為:取大腸桿菌BW25113生長至對數(shù)生長期(0D600在0.5-1.0之間)的菌液1.0ml, IOOOOg離心2min,去上清，以0.1ml水重懸細(xì)胞，取1.0 μ I加入到PCR混合液中。
PCR反應(yīng)體系如下:
IO Pfxbuffer (購自 Invitrogen 公丨丨'j.Mg:!4 (-..dNTP mixture 1' ) 5.0 μ 上游引物 (ΙΟμΜ)3.0 μ 下游引物 (ΙΟμΜ)3.0 μ DNA 模板1.0 μ!Pfx 聚合酶(511/μ1)0 5 μ 加水至50 μ
在Mastercycler普通PCR儀(Eppendorf )上運(yùn)行以下程序:
I) 95°C, 2min
2)94°C,20sec
3)55°C,45sec
4)68°C,25sec
5)循環(huán)從2)到4)，30次
6)68°C,3min
7)4°C，保存。
PCR產(chǎn)物經(jīng)Axygen PCR清潔試劑盒回收純化后，將DNA克隆到質(zhì)粒pGEM_T (購自上海生工生物工程公司)中，得到質(zhì)粒并命名為pGEM-T-Phya即該質(zhì)粒中含有優(yōu)化的啟動子 Phya (SEQ ID N0.3 所示)。
3、構(gòu)建質(zhì)粒pENA-TA和pCNA-PHC并生成產(chǎn)丁醇菌株
提純后的質(zhì)粒pGEM-T-Phya、pEN-TA及pCN_PHC分別以EcoRI和NdeI雙酶切，純化線性質(zhì)粒pEN-TA的DNA片段、質(zhì)粒pCN-PHC的DNA片段以及Phya片段后，將線性質(zhì)粒 pEN-TA及pCN-PHC的DNA片段分別與Phya片段以T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)挑菌、提取質(zhì)粒、酶切驗(yàn)證和DNA測序，鑒定出正確的陽性克隆，最后獲得終產(chǎn)物質(zhì)粒并分別命名為PENA-TA即該質(zhì)粒中含有優(yōu)化的啟動子Phya (SEQ ID N0.3所示)和pCNA-PHC即該質(zhì)粒中含有優(yōu)化的啟動子Phya (SEQ ID N0.3所示)。
將質(zhì)粒pENA-TA和pCNA-PHC經(jīng)電轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞，由含氨芐青霉素100 μ g/ml、氯霉素30 μ g/ml的LB瓊脂平板篩選，獲得產(chǎn)丁醇菌株，即含質(zhì)粒 pENA -TA/pCNA-PHC 的大腸桿菌 BW25113。
實(shí)施例2質(zhì)粒pENX-TA的構(gòu)建及相關(guān)產(chǎn)丁醇菌株的生成
啟動子Pxya(SEQID N0.2所示)是由綜合比較同源的革蘭氏陽性菌的木糖利用基因簇的啟動子Pxyl-A后，經(jīng)人工優(yōu)化后，并由上海生工生物技術(shù)公司經(jīng)化學(xué)合成法獲得。
本實(shí)施例中，以SEQ ID N0.2所不的序列為基礎(chǔ),在其序列兩端加上用于克隆的限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和Ndel，形成優(yōu)化的啟動子Pxya序列(SEQ ID N0.4所示)，以用于厭氧表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
優(yōu)化的啟動子Pxya序列(SEQ ID N0.4所示)被克隆入T載體pUCM-Τ (購自上海生工生物工程公司)，然后，如同實(shí)施例1，對該載體和質(zhì)粒pEN-TA進(jìn)行EcoRI/Ndel雙酶切， 并純化酶切后的線性質(zhì)粒pEN-TA的DNA片段及Pxya片段，然后將線性質(zhì)粒pEN-TA的DNA 片段和Pxya片段以T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中， 經(jīng)挑菌、提取質(zhì)粒、酶切驗(yàn)證和DNA測序，鑒定出正確的終產(chǎn)物質(zhì)粒，命名為pENX-TA即該質(zhì)粒中含有優(yōu)化的Pxya序列(SEQ ID N0.4所示)。
同樣，將質(zhì)粒pENX-TA和pCNA-PHC經(jīng)電轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞，由含氨芐青霉素ΙΟΟμ g/ml、氯霉素30 μ g/ml的LB瓊脂平板篩選，獲得產(chǎn)丁醇菌株，即含質(zhì)粒 pENX-TA/pCNA-PHC 的大腸桿菌 BW25113。
實(shí)施例3啟動子在大腸桿菌產(chǎn)丁醇發(fā)酵中的應(yīng)用
為讓大腸桿菌利用培養(yǎng)基中的葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)丁醇，表達(dá)質(zhì)粒組合pENA-TA/ pCNA-PHC 或 pENX-TA/pCNA-PHC 經(jīng)電轉(zhuǎn)(Bio-Rad MicroPulsel65_2100，電轉(zhuǎn)條件:2000V， 25μF)到大腸桿菌BW25113。經(jīng)下述方法培養(yǎng)及發(fā)酵，表達(dá)產(chǎn)丁醇的外源酶蛋白，并生產(chǎn)丁醇。
1、大腸桿菌在種子培養(yǎng)基中的培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基為50ml LB培養(yǎng)基，抗生素濃度為氨芐青霉素50 μ g/ml、氯霉素 25 μ g/ml，37°C搖床好氧培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)每分鐘，培養(yǎng)12小時。
2、在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行好氧生長
在5L發(fā)酵罐中，裝入3L配制好的LB培養(yǎng)基，50ml過夜培養(yǎng)后的菌液接種到2L LB 培養(yǎng)基中，370C，通風(fēng)量4L/分鐘，攪拌槳轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)每分鐘，經(jīng)4小時左右培養(yǎng)到OD6tltl為3.0。
3、無氧發(fā)酵產(chǎn)丁醇
將發(fā)酵罐中的空氣進(jìn)氣閥關(guān)閉，扎緊各類輸出管道，設(shè)定發(fā)酵液pH為5.5，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵48小時。其中，該發(fā)酵過程中，轉(zhuǎn)速調(diào)低至150rpm，在無氧發(fā)酵開始后I小時，pH迅速降低，之后PH將在氫氧化鈉的調(diào)節(jié)下維持在5.5，并且流加葡萄糖在10g/L/24hr。
經(jīng)48小時的發(fā)酵后，最終的發(fā)酵液以島津的氣相色譜GC2010，利用FID氫火焰檢測器，在氫氣為載氣的情況下，測得大腸桿菌BW25113 (含質(zhì)粒pENA-TA/pCNA-PHC)產(chǎn)正丁醇的峰值濃度為2.0g/L,而大腸桿菌BW25113 (含質(zhì)粒pENX-TA/pCNA-PHC)產(chǎn)正丁醇的峰值濃度為2.8g/L。
權(quán)利要求
1.一種用于微生物發(fā)酵的啟動子，其特征在于，包括選自下列核苷酸序列中的一種:1)如SEQID N0.1所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；2)如SEQID N0.2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；3)如SEQID N0.3所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；4)如SEQID N0.4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；5)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的核苷酸序列雜交且具有相同啟動子功能的核苷酸序列；6)對SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失或添加修飾且具有相同啟動子功能的核苷酸序列；7)與SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有相同啟動子功能的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于:所述啟動子為如SEQID N0.K SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于:所述如SEQID N0.3所示的核苷酸序列， 其制備方法如下:提取大腸桿菌BW25113細(xì)胞的基因組DNA作為模板，利用該模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到，其中，PCR擴(kuò)增中的上游引物序列如SEQ ID N0.7所示、下游引物序列如SEQ ID N0.8所示。
4.一種引物對，其特征在于:所述引物對是擴(kuò)增如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的啟動子全長或其任意片段的引物對。
5.—種表達(dá)載體,其特征在于:所述表達(dá)載體含有如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的啟動子。
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體,其特征在于:所述表達(dá)載體為含有如權(quán)利要求1-3 任一項(xiàng)所述的啟動子的質(zhì)粒pENA-TA、pCNA-PHC或pENX-TA。
7.—種重組細(xì)胞，其特征在于:所述重組細(xì)胞含有如權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體。
8.—種調(diào)控用于發(fā)酵的微生物中基因表達(dá)的方法，其特征在于:所述方法包括:將如權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入用于發(fā)酵的微生物中；其中，用于發(fā)酵的微生物，包括:產(chǎn)丁醇的大腸桿菌。
9.一種如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的啟動子的應(yīng)用，其特征在于:所述啟動子在調(diào)控用于發(fā)酵的微生物中目的基因表達(dá)的用途；其中，目的基因包括:用于合成丁醇的酶基因。
10.一種如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的啟動子的應(yīng)用，其特征在于:所述啟動子在制備用于厭氧或兼性厭氧發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)中間體的微生物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于:所述啟動子在制備用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)中間體的微生物中的應(yīng)用；其中，所述微生物包括:大腸桿菌；化學(xué)中間體包括:丁醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于微生物發(fā)酵的啟動子及其應(yīng)用，該啟動子包括選自下列核苷酸序列中的一種1)如SEQ ID NO.1、2、3或4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的核苷酸序列；2)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO.1、2、3或4所示的核苷酸序列雜交且具有相同啟動子功能的核苷酸序列；3)對SEQ ID NO.1、2、3或4所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失或添加修飾且具有相同啟動子功能的核苷酸序列；4)與SEQ ID NO.1、2、3或4所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有相同啟動子功能的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動子用在厭氧發(fā)酵中，無需誘導(dǎo)物，能高效地啟動其下游基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。
文檔編號C12N15/113GK103205428SQ20131010331
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者孫俊松, 王慶龍, 劉莉, 沈兆兵, 史吉平, 姜標(biāo) 申請人:上海中科高等研究院