專利名稱：一種改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法。
背景技術(shù)：
豬精子凍融后，由于受到一系列冷凍損傷導(dǎo)致精子大量死亡或活力下降，而采用蛋黃作為冷凍保護(hù)劑時，豬精子細(xì)胞骨架豬中肌動蛋白的表達(dá)量及微管蛋白的表達(dá)量不盡理想，無法達(dá)到實際使用要求。凍融精子受精率低下的主要原因之一是細(xì)胞骨架受到損傷。研究顯示低密度脂蛋白LDL能改善凍融精子冷凍效率，但它對凍融精子細(xì)胞骨架完整性影響方面的研究報道甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，旨在解決目前豬精子凍融后，由于受到一系列冷凍損傷導(dǎo)致精子大量死亡或活力下降，而采用蛋黃作為冷凍保護(hù)劑時，豬精子細(xì)胞骨架豬中肌動蛋白的表達(dá)量及微管蛋白的表帶量不盡理想，無法達(dá)到實際使用要求的問題。本發(fā)明的目的在于提供一種改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:利用成 年豬獲取豬精液；從鴿子卵中提取LDL ；采用低密度脂蛋白LDL作冷凍保護(hù)劑進(jìn)行豬精子冷凍。進(jìn)一步，成年健康、性欲旺盛的豬獲取豬精液的具體步驟為:采自成年健康、性欲旺盛的豬，鏡檢精子活力大于80%，精液直接在非獲能或獲能液稀釋到40xl06精子/mL，然后精子在溫度38.5°C,5% C02氣體條件下孵化。進(jìn)一步，從鴿子卵中提取LDL的具體步驟為:第一步、手工打破鴿子卵并除去卵清，將卵黃在濾紙上滾動除去卵清和粘連在卵黃膜上的系帶，然后在卵黃膜上穿孔，將未損壞的卵黃收集在冰水預(yù)冷的燒杯中；第二步、依照McBeeand CotterillP的方法將卵黃分成乳衆(zhòng)和顆粒，用同體積0.17M的NaCl稀釋液稀釋，4°C條件下攪拌lh，然后在4°C、IOOOOg條件下離心45min，將上清液與沉淀分離；第三步、上清液再次同條件離心徹底除去顆粒，向上清液中加入同體積40%(NH4)2S04，4°C下攪拌lh，然后4°C、IOOOOg條件下離心30min，除去沉淀，上清液在去離子水中透析6h，水每兩小時更換一次，6h后再次4°C、IOOOOg條件下離心30min，上層漂浮物即為 LDL。進(jìn)一步，采用低密度脂蛋白LDL作冷凍保護(hù)劑進(jìn)行豬精子冷凍的具體步驟為:精液取回后PBS洗滌，800g離心lOmin，去上清液，留沉淀備用；Tris_檸檬酸-葡萄糖與9%鴿子蛋LDL混合，稀釋至1.5X109個/ml，緩慢降溫至4°C制成冷凍劑；按2: I的比例在沉淀中加入含體積分?jǐn)?shù)3%甘油冷凍劑，4°C平衡Ih后以-80°C凍存。進(jìn)一步，該方法還進(jìn)一步包括卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)方法，步驟為:用注射器抽吸法采集卵巢表面直徑2_8mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞先在含有促卵泡素(FSH)的TCM199成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)20_22h后，換成不含F(xiàn)SH的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至42-46h ;培養(yǎng)條件為38.5°C，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。進(jìn)一步，該方法還進(jìn)一步包括精子獲能方法，步驟為:豬精液經(jīng)離心后精子溶解在不含葡萄糖的TALP培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組分:100mMNaCl, 3.1mM KCl, 1.5mM MgCl2, 25mM NaHCO3,0.29mM KH2P04，21.6mM 乳酸鈉，0.1mM sodiumpyruvate, 2m MCaCl2, 20Hepes pH7.4, 50 u g/mlBSA, lOU/ml penicillin 和 20 u g/ml 肝憐脂；精子在獲能培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，條件為39°C和5% C02。進(jìn)一步,該方法還進(jìn)一步包括頂體反應(yīng)方法,步驟為:頂體反應(yīng)誘導(dǎo)在添加IOiiM Ca2+離子載體A23187培養(yǎng)20min進(jìn)行，結(jié)合生物素的豌豆凝集素作為探針檢測精子頂體反應(yīng)；引起頂體反應(yīng)的樣本涂抹在顯微鏡載波片上；精子涂片風(fēng)干以后，浸入無水甲醇30秒而后快速風(fēng)干；甲醇固定的涂片和封阻液培養(yǎng)PBSlOmin ;然后置于含1% BSA的PBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)30min ;過氧化物酶結(jié)合的抗生物素蛋白培養(yǎng)IOmin ;精子頂體帽染成紅色的是頂體完整的精子，精子赤道部位染成紅色的或無色的是頂體反應(yīng)的精子。進(jìn)一步，該方法還進(jìn)一步包括精子孵化和冷卻處理方法，步驟為:精子懸浮在NCM和CM 中，在檢測酪氨酸磷酸化或頂體反應(yīng)前，孵化3h ;所有孵化發(fā)生在這些條件下，計算機控制的水浴以冷卻率為0.30C min—1，將精子從室溫冷卻到5°C ；冷卻后馬上將精子放回恒溫箱內(nèi)孵化IOmin后，進(jìn)行檢測。本發(fā)明提供的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，該方法通過添加9%的低密度脂蛋白LDL作為冷凍保護(hù)劑，改善豬精子凍融后細(xì)胞骨架的完整性，可明顯提高豬精子細(xì)胞骨架肌動蛋白的表達(dá)量，同時也是微管蛋白的表達(dá)量更接近于新鮮精液，有效地提高了豬精子凍融后的存活率、活力及受精率，最大限度地滿足了現(xiàn)實使用的需要，具有較強的推廣及應(yīng)用價值。


圖1是本發(fā)明實施例提供的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法的示意圖。圖2是本發(fā)明實施例提供的SDS-PAGE分析結(jié)果，圖中M是標(biāo)準(zhǔn)蛋白，I是鮮精，2是獲能精子，3是-80°C冷凍精液，_196°C冷凍精液；圖3是本發(fā)明實施例提供的Western blot肌動蛋白分析結(jié)果，圖中I是鮮精，2是獲能精子，3是-80°C冷凍精液，_196°C冷凍精液；圖4是本發(fā)明實施例提供的Western blot微管蛋白分析結(jié)果，圖中I是鮮精，2是獲能精子，3是-80°C冷凍精液，4是-196°C冷凍精液；圖5是本發(fā)明實施例提供的SDS-PAGE分析結(jié)果，圖中M標(biāo)準(zhǔn)蛋白，I是鮮精，2是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑-80°C凍融后的結(jié)果，3是蛋黃作為冷凍保護(hù)劑凍融后的結(jié)果，4是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_196°C凍融后的結(jié)果；圖6是本發(fā)明實施例提供的Western blot微管蛋白分析結(jié)果，I是鮮精，2是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_80°C凍融后的結(jié)果，3是蛋黃作為冷凍保護(hù)劑凍融后的結(jié)果，4是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_196°C凍融后的結(jié)果；圖7是本發(fā)明實施例提供的Western blot肌動蛋白分析結(jié)果，I是鮮精，2是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_80°C凍融后的結(jié)果，3是蛋黃作為冷凍保護(hù)劑凍融后的結(jié)果，4是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_196°C凍融后的結(jié)果。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定發(fā)明。本發(fā)明的目的在于提供一種改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，該方法包括以下步驟:SlOl:成年健康、性欲旺盛的豬獲取豬精液；S102:從鴿 子卵中提取LDL ；S103:采用低密度脂蛋白LDL作冷凍保護(hù)劑進(jìn)行豬精子冷凍。下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。本發(fā)明通過添加9%的LDL替代蛋黃作為冷凍保護(hù)劑，探究9%的LDL對細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果表明，溫度對細(xì)胞骨架中微管蛋白的影響較小(圖3)，而對肌動蛋白的影響較大(圖4)，以9%的LDL替代蛋黃作為冷凍保護(hù)劑可明顯提高豬精子細(xì)胞骨架肌動蛋白的表達(dá)量(圖6)，同時也是微管蛋白的表帶量更接近于新鮮精液(圖7)。圖1是本發(fā)明實施例提供的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法的示意圖。圖2是本發(fā)明實施例提供的SDS-PAGE分析結(jié)果，圖中M是標(biāo)準(zhǔn)蛋白，I是鮮精，2是獲能精子，3是-80°C冷凍精液，_196°C冷凍精液；圖3是本發(fā)明實施例提供的Western blot肌動蛋白分析結(jié)果，圖中I是鮮精，2是獲能精子，3是-80°C冷凍精液，_196°C冷凍精液；圖4是本發(fā)明實施例提供的Western blot微管蛋白分析結(jié)果，圖中I是鮮精，2是獲能精子，3是-80°C冷凍精液，4是-196°C冷凍精液；圖5是本發(fā)明實施例提供的SDS-PAGE分析結(jié)果，圖中M標(biāo)準(zhǔn)蛋白，I是鮮精，2是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑-80°C凍融后的結(jié)果，3是蛋黃作為冷凍保護(hù)劑凍融后的結(jié)果，4是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_196°C凍融后的結(jié)果；圖6是本發(fā)明實施例提供的Western blot微管蛋白分析結(jié)果，I是鮮精，2是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_80°C凍融后的結(jié)果，3是蛋黃作為冷凍保護(hù)劑凍融后的結(jié)果，4是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_196°C凍融后的結(jié)果；圖7是本發(fā)明實施例提供的Western blot肌動蛋白分析結(jié)果，I是鮮精，2是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_80°C凍融后的結(jié)果，3是蛋黃作為冷凍保護(hù)劑凍融后的結(jié)果，4是添加9% LDL作為冷凍保護(hù)劑_196°C凍融后的結(jié)果。本發(fā)明實施例的具體實現(xiàn)方法如下:1、獲取豬精液豬精液由吉林延吉市韓吉牧業(yè)有限公司提供，采自成年健康、性欲旺盛的豬。鏡檢精子活力大于80%者方可用于試驗。富含精子的精液直接在非獲能或獲能液稀釋到40xl06精子/mL。然后精子在溫度38.5°C，濕度5% C02氣體條件下孵化。2、LDL 的提取蛋黃中LDL的提取是根據(jù)Moussa等所用的方法。手工打破卵并除去卵清。將卵黃在濾紙上小心滾動以除去卵清和粘連在卵黃膜上的系帶，然后在卵黃膜上穿孔，將未損壞的卵黃收集在冰水預(yù)冷的燒杯中。依照McBeeand CotterillP的方法將卵黃分成乳衆(zhòng)和顆粒。用同體積0.17M的NaCl稀釋，4°C條件下攪拌lh，然后在4°C、IOOOOg條件下離心45min。將上清液與沉淀分離。上清液再次同條件離心徹底除去顆粒。向上清液中加入同體積40%硫酸銨，4°C下攪拌lh，然后4°C，IOOOOg條件下離心30min。除去沉淀，上清液在去離子水中透析6h，水每兩小時更換一次。6h后再次4°C、IOOOOg條件下離心30min，上層漂浮物即為LDL。3、豬精子冷凍
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精液取回后PBS洗滌，800g離心lOmin，去上清液，取沉淀分兩組加入冷凍保護(hù)齊U。第一組為TCG(TriS-檸檬酸-葡萄糖)+9%鴿子蛋LDL，對照組TCG+20%卵黃，稀釋至1.5X109個/ml。緩慢降溫至4°C，分別以2: I的比例加入含體積分?jǐn)?shù)3%甘油的上述2種冷凍劑，4°C平衡Ih后裝入0.5ml精細(xì)管中，再將各組分別以_80°C和_196°C凍存。4、卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)用注射器抽吸法采集卵巢表面直徑2-8_卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞先在含有促卵泡素(FSH)的TCM 199成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)20_22h后，換成不含F(xiàn)SH的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至42-46h。培養(yǎng)條件為38.50C、C02體積分?jǐn)?shù)為5%的空氣、相對飽和濕度。5、精子獲能精子體外獲能是依據(jù)Parrish et al.(1988)描述的方法。豬精液經(jīng)離心后精子溶解在不含葡萄糖的TALP培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組分:100mM NaCl, 3.1mM KCl, 1.5mM MgCl2, 25mMNaHCO3,0.29mM KH2P04,21.6mM乳酸鈉，0.1mMsodium pyruvate, 2m MCaCl2,20Hepes pH7.4,50 u g/ml BSA, lOU/ml penicillin和20 u g/ml肝磷脂。精子在獲能培養(yǎng)基培養(yǎng)4h(39°C和 5% CO2)。6、頂體反應(yīng):頂體反應(yīng)誘導(dǎo)在添加IOiiM Ca2+離子載體A23187培養(yǎng)20min進(jìn)行，結(jié)合生物素的豌豆凝集素(pisum sativum agglutinin,PSA)作為探針檢測精子頂體反應(yīng)。引起頂體反應(yīng)的樣本涂抹在顯微鏡載波片上；精子涂片風(fēng)干以后，浸入無水甲醇30秒而后快速風(fēng)干；甲醇固定的涂片和封阻液培養(yǎng)PBS (含1% BSA) IOmin ;然后置于含1% BSA的PBS (含結(jié)合生物素的PSA(50 ii g/ml))培養(yǎng)液中培養(yǎng)30min ;過氧化物酶結(jié)合的抗生物素蛋白(I: 400)培養(yǎng)lOmin。精子頂體帽染成紅色的是頂體完整的精子，精子赤道部位染成紅色的或無色的是頂體反應(yīng)的精子。7、精子孵化和冷卻處理
精子懸浮在NCM和CM中。在檢測酪氨酸磷酸化或頂體反應(yīng)前，孵化3h(39°C和5%C02)。所有孵化發(fā)生在這些條件下，除非另有說明。計算機控制的水浴以冷卻率為.0.3CmirT1，將精子從室溫冷卻到5°C。冷卻后馬上將精子放回恒溫箱(39°C和5% CO2)內(nèi)孵化IOmin后,進(jìn)行檢測。8、精子蛋白質(zhì)提取分別收集新鮮、凍融和獲能的豬精液樣本,用PBS(phosphate buffered saline)洗滌2次后，凍存于-20°C冰箱，24h內(nèi)即進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。用含0.5mol/L的tris_HCl、0.28mol/L2巰基乙醇、5mol/L鹽酸胍的裂解液裂解精子；再用三氯乙酸/丙酮法沉淀蛋白質(zhì)，提取沉淀的蛋白質(zhì)凍干，將凍干的蛋白質(zhì)沉淀以裂解緩沖液(8mol/L 尿素、40g/LCHAPS(C32H58N2S07) ,40mmol/LTris)溶解后，在沸水中變性5min，-20 V保存。PBS沖洗固定精子的載玻片，用含3 % BSA的PBS液封閉Ih后，在37°C與一抗G-和F-肌動蛋白(A2668)、血影蛋白(S1515)和a-微管蛋白(T9026)共培養(yǎng)Ih (熒光素抗體用3% BSA水溶液稀釋)。用PBS洗滌后，載玻片與含羊抗鼠IgG(F5387)或者羊抗兔IgG(F7512)的二抗(FITC ；P5282)進(jìn)一步共培養(yǎng)。反復(fù)用PBS沖洗，為了使培養(yǎng)的樣本在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)不同顏色，用含或不含碘化丙啶的復(fù)染色劑Vectashield封閉載玻片。載玻片用熒光顯微鏡作常規(guī)檢查。顯微照片由共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。9、SDS-PAGE 電泳分析SDS-PAGE電泳采用Laemmli電泳緩沖體系，分離膠含量為100g/L，濃縮膠含量為50g/L，上樣量為40L。連接電源，使陽極在下，陰極在上。在恒壓下(濃縮膠80V，分離膠120V)電泳2h，至指示染料移到凝膠板下口約Iem處時停止。電泳完畢后，取下一板膠片放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，在搖床上搖動染色0.5-lh，然后置脫色液中脫色至蛋白帶清晰為止；另一板膠片做Western blot免疫印跡分析。10> Western blot 免疫印跡(1)將膠片移入轉(zhuǎn)移緩沖液(48mmol/LTris Na0H、39mmol/L 甘氨酸、0.037g/L SDS、200ml/L甲醇)中浸潤5min，將轉(zhuǎn)移緩沖液潤濕的6張Whatman濾紙、硝酸纖維素膜及凝膠按3層濾紙、硝酸纖維素膜(正面朝上)、凝膠、3層濾紙，按順序依次鋪在半干式電泳凝膠轉(zhuǎn)移儀的石墨平板上，每鋪一層，要用玻璃棒趕走每層間的氣泡。鋪好后，將轉(zhuǎn)印裝置接通電源，轉(zhuǎn)印1-1.5h。將蛋白質(zhì)Marker切下單獨染色(考馬斯亮藍(lán)染色)；將印跡膜放入封閉液中于室溫震蕩器上放置過夜，用PBS緩沖液洗3遍后加入一抗(肌動蛋白)于37孵育lh，用15mL 8.5g/LNaCl洗3遍后，加入酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG)，于37°C孵育lh。洗膜方法同上，然后加底物(DAB)顯色。11> Western blot 蛋白質(zhì)免疫印跡(2)應(yīng)用SDS-電泳和免疫印記技術(shù)檢測一抗的生物化學(xué)特性。SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳依據(jù)Laemmli (1970)的方法、免疫印跡法是依據(jù)Towbin et al.(1979)的方法進(jìn)行。精子樣本用PBS洗滌兩次，懸浮在非還原裂解液加熱到100°C保持5分鐘。在SDS-PAGE凝膠孔中點入相當(dāng)于106個精子細(xì)胞的樣本。電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，通過與一抗、二抗培養(yǎng)后檢測，抗體選擇抗鼠IgG (A0168)或抗兔(A0545) IgG過氧化物酶聯(lián)合物。非特定的部位用PBS封閉液(5%脫脂奶和0.05%吐溫-20)封閉，蛋白質(zhì)條帶通過增強化學(xué)熒光的方法顯現(xiàn)。
12、DNA彗星實驗精子單細(xì)胞凝膠電泳(彗星實驗)將細(xì)管凍精解凍后，調(diào)整精子密度為“個”，然后根據(jù)Haines、Philip等等介紹的方法,適當(dāng)進(jìn)行修改后分析精子DNA的損傷情況.
13、體外受精將培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞用移卵管反復(fù)吹打，除去卵母細(xì)胞外面的卵丘細(xì)胞挑選胞質(zhì)飽滿均勻有第一極體的卵母細(xì)胞移入到預(yù)平衡的獲能液(不加肝素)中洗滌3-5次。然后用移卵管移入上蓋礦物油并在CO2培養(yǎng)箱中預(yù)孵4-6h以上的獲能液小滴中，每滴放入10-15枚卵母細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱(38°C，5% CO2,100%飽和濕度)中，等待受精。對于已經(jīng)獲能的精子，調(diào)整精子濃度到1-1.5xl06個/mL左右。然后取50mL加入到等待受精的卵母細(xì)胞微滴中，于CO2培養(yǎng)箱(38°C，5% CO2,100%飽和濕度)中，共同孵育6h。14、胚胎培養(yǎng)受精后6h，將卵母細(xì)胞移入NCSU23中輕輕吹打，去除附著在受精卵周圍的精子，并用NCSU23洗滌3次，然后放入至少平衡2h的微滴(4ug/mLBSA)中，每滴約10枚受精卵，培養(yǎng)條件為38°C，5% CO2,100%飽和濕度。每隔24h檢查I次，培養(yǎng)48h統(tǒng)計卵裂率。以上所述 僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 利用成年豬獲取豬精液； 從鴿子卵中提取LDL; 采用低密度脂蛋白LDL作冷凍保護(hù)劑進(jìn)行豬精子冷凍。
2.如權(quán)利要求1所述的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，成年健康、性欲旺盛的豬獲取豬精液的具體步驟為:采自成年健康、性欲旺盛的豬，鏡檢精子活力大于80 %，精液直接在非獲能或獲能液稀釋到40xl06精子/mL，然后精子在溫度38.5°C,5% C02氣體條件下孵化。
3.如權(quán)利要求1所述的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，從鴿子卵中提取LDL的具體步驟為: 第一步、手工打破鴿子卵并除去卵清，將卵黃在濾紙上滾動除去卵清和粘連在卵黃膜上的系帶，然后在卵黃膜上穿孔，將未損壞的卵黃收集在冰水預(yù)冷的燒杯中； 第二步、依照McBeeand CotterillP的方法將卵黃分成乳衆(zhòng)和顆粒,用同體積0.17M的NaCl稀釋液稀釋，4°C條件下攪拌lh，然后在4°C、IOOOOg條件下離心45min，將上清液與沉淀分離； 第三步、上清液再次同條件離心徹底除去顆粒，向上清液中加入同體積40%(NH4)2S04，4°C下攪拌lh，然后4°C、IOOOOg條件下離心30min，除去沉淀，上清液在去離子水中透析6h，水每兩小時更換一次，6h后再次4°C、IOOOOg條件下離心30min，上層漂浮物即為 LDL。
4.如權(quán)利要求1所述的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，采用低密度脂蛋白LDL作冷凍保護(hù)劑進(jìn)行豬精子冷凍的具體步驟為:精液取回后PBS洗滌，800g離心lOmin，去上清液，留沉淀備用；Tris_檸檬酸-葡萄糖與9%鴿子蛋LDL混合，稀釋至1.5X109個/ml，緩慢降溫至4°C制成冷凍劑；按2: I的比例在沉淀中加入含體積分?jǐn)?shù)3%甘油冷凍劑，4°C平衡Ih后以-80°C凍存。
5.如權(quán)利要求1所述的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，該方法還進(jìn)一步包括卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)方法，步驟為: 用注射器抽吸法采集卵巢表面直徑2-8mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞先在含有促卵泡素(FSH)的TCM199成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)20-22h后，換成不含F(xiàn)SH的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至42-46h ;培養(yǎng)條件為38.5°C，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求1所述的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，該方法還進(jìn)一步包括精子獲能方法，步驟為: 豬精液經(jīng)離心后精子溶解在不含葡萄糖的TALP培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組分:100mM NaCl,3.1mM KCl, 1.5mM MgCl2, 25mM NaHCO3,0.29mM KH2P04，21.6mM 乳酸鈉，0.1mM sodiumpyruvate, 2m MCaCl2, 20Hepes pH7.4, 50 u g/ml BSA, lOU/ml penicillin和 20 u g/ml 肝憐脂；精子在獲能培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，條件為39°C和5% C02。
7.如權(quán)利要求1所述的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，該方法還進(jìn)一步包括頂體反應(yīng)方法，步驟為: 頂體反應(yīng)誘導(dǎo)在添加IOuM Ca2+離子載體A23187培養(yǎng)20min進(jìn)行，結(jié)合生物素的豌豆凝集素作為探針檢測精子頂體反應(yīng)；引起頂體反應(yīng)的樣本涂抹在顯微鏡載波片上；精子涂片風(fēng)干以后，浸入無水甲醇30秒而后快速風(fēng)干；甲醇固定的涂片和封阻液培養(yǎng)PBSlOmin;然后置于含1% BSA的PBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)30min ;過氧化物酶結(jié)合的抗生物素蛋白培養(yǎng)IOmin ;精子頂體帽染成紅色的是頂體完整的精子，精子赤道部位染成紅色的或無色的是頂體反應(yīng)的精子。
8.如權(quán)利要求1所述的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，其特征在于，該方法還進(jìn)一步包括精子孵化和冷卻處理方法，步驟為: 精子懸浮在NCM和CM中，在檢測酪氨酸磷酸化或頂體反應(yīng)前，孵化3h ;所有孵化發(fā)生在這些條件下，計算機控制的水浴以冷卻率為0.30C mirT1，將精子從室溫冷卻到5°C ;冷卻后馬上將精子放回恒 溫箱內(nèi)孵化IOmin后，進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，該方法包括以下步驟成年健康、性欲旺盛的豬獲取豬精液；從鴿子卵中提取LDL；采用低密度脂蛋白LDL作冷凍保護(hù)劑進(jìn)行豬精子冷凍。本發(fā)明提供的改善保存豬精子凍融后細(xì)胞骨架完整性的方法，通過添加9％的低密度脂蛋白LDL作為冷凍保護(hù)劑，改善豬精子凍融后細(xì)胞骨架的完整性，可明顯提高豬精子細(xì)胞骨架肌動蛋白的表達(dá)量，同時也是微管蛋白的表達(dá)量更接近于新鮮精液，有效地提高了豬精子凍融后的存活率、活力及受精率，最大限度地滿足了現(xiàn)實使用的需要，具有較強的推廣及應(yīng)用價值。
文檔編號C12N5/075GK103190391SQ20131010304
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者金 一, 崔明勛, 尹熙俊, 方南洙, 金花子, 金英海, 吳俊波 申請人:金 一