專利名稱：布萊凱特黑牛coq2基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)，特別涉及一種布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
布萊凱特黑牛是一種優(yōu)質(zhì)肉牛新品種，其牛肉含有豐富的蛋白質(zhì)，氨基酸組成比豬肉更接近人體需要，能提高機(jī)體抗病能力，同時(shí)CoQltl含量也相對(duì)較高，具有營(yíng)養(yǎng)心肌、增強(qiáng)抵抗力的功能，是我國(guó)肉牛品種中不可多得的優(yōu)質(zhì)肉牛新種質(zhì)，因此如何利用分子生物學(xué)技術(shù)更加快速高效的培育肉質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)更加優(yōu)良的肉牛品種是當(dāng)務(wù)之急。CoQ10以其·獨(dú)特的生物學(xué)功能和醫(yī)學(xué)功能，備受廣大研究者青睞。在細(xì)胞電子傳遞鏈上，CoQltl將電子從復(fù)合物II傳遞到復(fù)合物III上，還能作為抗氧化劑與自由基結(jié)合，使磷脂膜和蛋白免受脂質(zhì)過氧化損害。在醫(yī)藥領(lǐng)域，CoQltl主要用于治療帕金森綜合癥和保護(hù)心臟，它能夠保護(hù)神經(jīng)元，對(duì)抗毒素導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡，并能為心肌提供充足的氧氣，防止突發(fā)性心臟病。在與其生物合成途徑相關(guān)的若干種酶中對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶是主要限速酶，影響著CoQltl的合成速度及合成量，C0Q2基因是該酶在真核生物中的編碼基因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在患有腦肌病、腎病和嚴(yán)重缺乏CoQltl的兩兄弟體內(nèi)發(fā)現(xiàn)與CoQltl合成相關(guān)的對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因C0Q2發(fā)生了純合子突變，這是C0Q2突變導(dǎo)致CoQltl缺乏及人類疾病的首次直接證明。但對(duì)于哺乳動(dòng)物C0Q2基因遺傳突變對(duì)體內(nèi)CoQltl合成量和合成速度影響的研究報(bào)道至今未發(fā)現(xiàn)，因此本試驗(yàn)根據(jù)EsemblGenome Browser數(shù)據(jù)庫(kù)公布的普通牛C0Q2基因的遺傳突變位點(diǎn)信息,對(duì)布萊凱特黑牛C0Q2基因第一外顯子部分序列進(jìn)行了多態(tài)性分析，為后期多態(tài)性與肉質(zhì)性狀和CoQltl合成速度及合成量的相關(guān)性分析奠定理論基礎(chǔ)，以期實(shí)現(xiàn)布萊凱特黑牛C0Q2基因分子標(biāo)記輔助育種。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化。單核苷酸多態(tài)性具有數(shù)量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，是一種進(jìn)行分子遺傳育種的優(yōu)良手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，尋找到與布萊凱特黑牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的SNP，為其分子標(biāo)記育種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性序列，是在布萊凱特黑牛C0Q2基因第一外顯子第55位為G或T的堿基多態(tài)性序列。布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法包括以下步驟:以包含C0Q2基因的待測(cè)布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增布萊凱特黑牛C0Q2基因第一外顯子JtPCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)并對(duì)基因分型；對(duì)基因分型的純合子測(cè)序得到布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性序列。所述的引物對(duì)P為:上游引物:5’-TGCCGCTGACCTGACGCTC-3’下游引物:5’ -CCCCACAGCCATGCCTGAG-3，。所述PCR 反應(yīng)體系為:50ng/ μ L 的基因組 DNAl μ L，2XGC buffer I 10 μ L,2.5mmol/L 的 dNTP3.2 μ L, IOpmoI/L 上下游混合引物 0.6 μ L, 5U/ μ L 的 LA Taq 酶 0.2 μ L，ddH205 μ L,總計(jì) 20 μ L。所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0所述SSCP檢測(cè)應(yīng)用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性序列及檢測(cè)方法還可以包括對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)等位基因的基因頻率、基因型頻率和遺傳多態(tài)性指標(biāo)的檢測(cè)。所述的遺傳多態(tài)性指標(biāo)為純合度Ho、雜合度He、有效等位基因數(shù)Ne和多態(tài)信息含量 PIC。所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性序列及檢測(cè)方法還可以包括C0Q2基因第一外顯子變異前后對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。所述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析采用軟件DNAStar Lasergene7。本發(fā)明的有益效果是:首次在布萊凱特黑牛C0Q2基因第一外顯子第55bp發(fā)現(xiàn)G — T的堿基突變，對(duì)應(yīng)密碼子發(fā)生GCG — TCG的突變，使對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列第4位氨基酸由疏水性氨基酸Ala突變?yōu)闃O性不帶電荷氨基酸Ser，屬錯(cuò)義突變。進(jìn)而對(duì)其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致突變后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比突變前減少了 I個(gè)α-螺旋、I個(gè)β-折疊，增加了 I個(gè)β_轉(zhuǎn)角。而這種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變勢(shì)必引起蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)及四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而可能影響到布萊凱特黑牛對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化性質(zhì)，導(dǎo)致牛肉中CoQltl合成量和合成速度及肉質(zhì)的不同。因此這一結(jié)果對(duì)后期研究酶結(jié)構(gòu)的改變，及其改變對(duì)CoQltl合成量和合成速度及肉質(zhì)的影響具有重大意義，特別是作為優(yōu)質(zhì)肉牛品種選育的標(biāo)記基因，為布萊凱特黑牛優(yōu)良種質(zhì)的選育提供重要技術(shù)支持。針對(duì)上述布萊凱特黑牛C0Q2基因SNP多態(tài)性，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、成本低廉、精確度高。


圖1是布萊凱特黑?；蚪MDNA瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果；圖2是布萊凱特黑牛C0Q2基因第一外顯子部分片段擴(kuò)增結(jié)果；圖3是C0Q2基因第一外顯子PCR-SSCP多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果；圖4a和圖4b分別是C0Q2基因第一外顯子擴(kuò)增片段AA和BB基因型測(cè)序峰圖；圖5是第一外顯子第55bp突變前(G)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖；圖6是第一外顯子第55bp突變后(T)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。1.基因組DNA提取分別采取92頭成年布萊凱特黑牛耳樣，使用天根生化科技(北京)有限公司的組織基因組DNA提取試劑盒從布萊凱特黑牛耳組織中提取基因組DNA，具體步驟如下:(I)稱取IOmg布萊凱特黑牛耳樣組織放于1.5mL離心管內(nèi)，用消毒后的手術(shù)剪盡量剪碎，取200 μ L緩沖液GA加入其中，震蕩，使其徹底懸浮。(2)加入20yL的蛋白酶K溶液，混勻。放入水浴鍋內(nèi)56°C水浴1.5h，期間顛倒混勻樣品2-3次，至完全消化，然后簡(jiǎn)短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠。(3)加入200 μ L緩沖液GB，顛倒混勻，70°C水浴鍋內(nèi)放置lOmin，溶液變清亮，簡(jiǎn)短
離心除去管蓋內(nèi)水珠。(4)取200 μ L無(wú)水乙醇加入上述溶液，振蕩器上振蕩混勻15sec，簡(jiǎn)短離心除去管蓋內(nèi)水珠。(5)將上一步所得溶液和絮狀物全部都加入到一個(gè)吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，于離心機(jī)12000rpm離心30sec，倒掉廢液后將吸附柱再放回收集管中。(6)向吸附柱中加入500 μ L已加了無(wú)水乙醇的緩沖液⑶，12000rpm離心30sec，棄廢液后吸附柱放于收集管中。 (7)加入700 μ L已加了無(wú)水乙醇的漂洗液PW進(jìn)行漂洗，12000rpm離心30sec,棄廢液后吸附柱再放入收集管中。(8)重復(fù)操作步驟7，再漂洗一遍。(9)吸附柱放于收集管中后，12000rpm離心2min，倒掉廢液后，將吸附柱放于室溫10分鐘，徹底晾干材料中殘余的漂洗液，聞一下無(wú)乙醇的氣味。(10)將上述吸附柱放入一個(gè)干凈的剪去上蓋的離心管中，懸空向吸附柱吸附膜中間部位滴加100 μ L洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min。(11)為增加基因組DNA的得率，將上述得到的溶液再次懸空加入到吸附柱吸附膜上，室溫放置2min, 12000rpm離心2min。(12)將得到的基因組DNA溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管內(nèi)，取2μ L該溶液以
0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度及濃度，剩下的放于_20°C冰箱中保存。部分基因組DNA電泳結(jié)果如圖1所示，可知所提取基因組DNA條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明DNA完整性較好，濃度較高，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。2.引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Esembl Genome Browser數(shù)據(jù)庫(kù)和GenBank上公布的普通牛C0Q2基因序列，使用Primer Premier5.0對(duì)C0Q2基因第一外顯子部分序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì),擴(kuò)增包括第一外顯子(長(zhǎng)298bp) 113bp及19bp的上游5’調(diào)控序列，共132bp的序列片段，并由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行引物的合成。引物序列為:上游引物(SEQID N0.:1):5，-TGCCGCTGACCTGACGCTC-3，下游引物(SEQID N0.:2):5’ -CCCCACAGCCATGCCTGAG-3’3.PCR 擴(kuò)增
由于該引物擴(kuò)增片段中GC含量高達(dá)72%，使用普通的Taq酶里的10XPCR Buffer無(wú)法擴(kuò)增出產(chǎn)物。TaKaRa LA Taq能夠擴(kuò)增具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)模板DNA (GC rich、重復(fù)序列)，2XGCbuffer是PCR反應(yīng)用緩沖液。PCR 反應(yīng)體系為:基因組 DNAl μ L，2 X GC buffer I 10 μ L, dNTP (2.5mmol/L)3.2yL，上下游混合引物(lOpmol/L) 0.6 μ L，Taq 酶(5U/μ L) 0.2 μ L, ddH205 yL，總計(jì)20 μ L0PCR 反應(yīng) 程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，64°C退火 30s，72°C延伸 30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖2所示，PCR產(chǎn)物特異性較好，片段長(zhǎng)度與預(yù)期一致，可以用來(lái)進(jìn)行后面的試驗(yàn)。4.PCR-SSCP 分析將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照體積比1:1比例加入變性上樣緩沖液，變性后產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)分析(SSCP)。并進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而對(duì)其基因分型，挑選其中純合子進(jìn)行克隆測(cè)序。4.1聚丙烯酰胺凝膠電泳(I)玻璃板處理:將配套的玻璃板、梳子及邊條洗凈晾干，用酒精棉球擦一遍，晾干后，吸取少量(約1000 μ L)剝離硅烷于吸水紙上，迅速全面的擦拭凹板(上玻璃板)，室溫放置5-10min ;然后吸取少量稀釋親和硅烷溶液于吸水紙上，迅速全面的擦拭平板(下玻璃板)一遍，待2-3min，再吸取少量擦拭一遍，室溫放置5_10min。(2)組裝玻璃板:將平板平放于高于桌面的一水平介質(zhì)上，平板兩邊放好邊條，蓋上凹板，板兩邊用12個(gè)夾子對(duì)稱固定好。(3)聚丙酰胺凝膠的配制 從4°C冰箱中拿出已配好的30%丙烯酰胺、10%過硫酸銨和TEMED，用移液管移取20mL30%丙烯酰胺、10mL5XTBE、20mL蒸餾水，在用移液器移取350 μ L10%過硫酸銨、20 μ L TEMED,迅速攪拌混勻。注意:丙烯酰胺、過硫酸銨和TEMED均有神經(jīng)毒性，取用時(shí)要佩戴手套和口罩。(4)灌膠:用移液管吸取上述凝膠液，從玻璃板凹口一端緩慢注入，同時(shí)用洗耳球輕輕敲擊板上表面，使膠液在板內(nèi)移動(dòng)迅速且均勻，直至板內(nèi)充滿膠液。(5)插入梳子:從凹口端慢慢插入梳子平頭端，要盡量避免氣泡產(chǎn)生，如若產(chǎn)生氣泡，則要拿掉有氣泡一邊的幾個(gè)夾子，用小鐵鏟慢慢撬起玻璃板，直至氣泡消失，再輕輕放下玻璃板，夾好夾子，從另凹口另一端加入缺少的膠液。待膠液充滿板內(nèi)且沒有氣泡時(shí)，室溫水平放置待膠凝固。(6)預(yù)電泳:待膠凝好后，將梳子平頭端慢慢拔出，迅速插入梳齒端，梳齒插入膠中約l-2mm。取下板兩邊夾子，將玻璃板移至垂直電泳槽內(nèi)，兩邊固定好，然后在上下電泳槽內(nèi)倒入適量的IXTBE緩沖液，用注射器吸取電泳液清洗點(diǎn)樣孔，以除去其中的氣泡及碎膠，最后插好電極，300V電泳30min。(7)PCR產(chǎn)物處理:向PCR產(chǎn)物中按照體積比1:1比例加入變性上樣緩沖液(9.8ml去離子甲酰胺、0.2ml0.5mol/L EDTA (pH8.0)、0.0025g 二甲苯青FF、0.0025g溴酚藍(lán)置于棕色瓶?jī)?nèi)，混勻)，PCR儀中98°C變性lOmin，然后迅速插入冰中冰浴lOmin。(8)點(diǎn)樣:用移液器吸取2.5 μ L變性后PCR產(chǎn)物，依次點(diǎn)入點(diǎn)樣孔中。
(9)電泳:4°C，先 500V 電泳 lOmin，壓樣;再 300V 電泳 Ilh0(10)結(jié)束電泳:關(guān)閉電泳儀，回收電泳緩沖液，擰開電泳槽兩邊固定玻璃板的螺絲，取下玻璃板放于桌面水平介質(zhì)上，拔掉梳子和兩邊的邊條，用小鐵鏟從玻璃板平口底端一邊小心撬起凹板，準(zhǔn)備銀染。4.2聚丙烯酰胺凝膠銀染(I)固定:將除去上邊凹板的玻璃板放于盛有2L固定/終止液的水槽中，固定lOmin，期間輕輕來(lái)回振蕩幾次。然后取出玻璃板放于盛有2L蒸餾水的水槽中，輕輕沖洗玻璃板兩次，沖洗掉多余固定液及未固定住的DNA。(2)染色:將玻璃板放于盛有2L染色液的水槽中染色20min，期間輕輕來(lái)回振蕩幾次。然后在蒸餾水中迅速清洗兩次，沖掉膠表面多余染色液。(3)顯色:將玻璃板迅速放入盛有2L顯色液(臨用前現(xiàn)加入3mL甲醛)的水槽內(nèi)顯色，期間不斷輕輕振蕩，直至出現(xiàn)清晰地條帶。一般5-10min，時(shí)間不宜過長(zhǎng)，防止顯色背景過深。(4)終止:將出現(xiàn)清晰條帶的玻璃板迅速放到第一步固定用的固定/終止液中終止顯色。(5)回收各銀染試劑，并將玻璃板從固定/終止液中撈出，放于水平面上自然晾干。(6)標(biāo)記好樣本序號(hào)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯 酰胺凝膠電泳銀染后呈現(xiàn)不同的條帶，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，C0Q2基因第一外顯子內(nèi)檢測(cè)到兩個(gè)等位基因(A和B)，3種基因型(AA、BB和AB)。4.3條帶統(tǒng)計(jì)根據(jù)銀染結(jié)果分析各樣本的條帶數(shù)量及位置，確立各樣本的基因型，及各基因型的樣本數(shù)目。5.純合子克隆測(cè)序5.1PCR 擴(kuò)增各引物擴(kuò)增片段經(jīng)SSCP分析后，挑選兩個(gè)純合子基因型樣本，每個(gè)基因型挑選兩個(gè)個(gè)體重復(fù)，按照上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取3 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，力口
Iμ L6 X Loading buffer混勻，點(diǎn)樣于2%的瓊脂糖凝膠中，120V電泳25min。5.2PCR產(chǎn)物切膠回收使用天根生化科技(北京)有限公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，步驟如下:(I)每個(gè)引物取上述4個(gè)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果較好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入到一個(gè)新的小離心管中，加入15 μ L6XLoading buffer,混勻，加入點(diǎn)樣孔寬度為2cm的
1.5%瓊脂糖凝膠中，120V電泳30min。放入EB溶液中染色18min。(2)離心管稱重后，標(biāo)上標(biāo)簽，在紫外燈下，切取目的DNA片段條帶，盡量切掉不含DNA條帶的凝膠，放入干凈離心管中，稱重。(3)向離心管中加入3倍體積的溶膠液PN，50°C水浴放置lOmin，期間不斷翻轉(zhuǎn)離心管幾次，確保凝膠全部溶解。(4)吸附柱的平衡:將吸附柱放入收集管中，加入500 μ L平衡液BL，12000rpm離心Imin，倒掉廢液后，再將吸附柱放回收集管中。(5)將步驟(2)所得溶液冷卻至室溫后，加入到平衡好的吸附柱中，室溫放置2min，然后12000rpm離心60sec，倒掉廢液，再將吸附柱放回收集管中。(6)向吸附柱中加入60(^1^已加入無(wú)水乙醇的漂洗液？1，靜置31^11后，12000印111離心60sec，倒掉廢液，再將吸附柱放回收集管中。(7)重復(fù)操作步驟5。(8)將吸附柱放回收集管后，12000rpm離心2min。將吸附柱放置于室溫IOmin左右，徹底晾干，以防止殘留漂洗液影響后續(xù)試驗(yàn)。(9)將晾干的吸附柱放入到一個(gè)剪掉上蓋的離心管中，向吸附膜中央位置懸空滴加40 μ L洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到目的DNA溶液。(IO)將上步離心得到的目的DNA溶液重新滴加到吸附膜上，室溫靜置2min，12000rpm離心2min，將目的DNA溶液收集到一個(gè)新的離心管內(nèi)。(11)取上述目的DNA溶液5 μ L，加入I μ L6 X Loading buffer，上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，剩下的目的DNA溶液放于_20°C保存?zhèn)溆谩?.3目的DNA與T-載體的連接、轉(zhuǎn)化(I)超凈工作臺(tái)滅菌:先用75%的酒精將工作臺(tái)臺(tái)面及要用到的儀器擦拭一遍，將滅菌的槍頭、離心管、離心管架等物品放入超凈工作臺(tái)中，然后打開紫外燈照射20min，再打開風(fēng)機(jī)吹5min即可。(2)從_20°C 冰箱中取出T-載體連接試劑盒，放于冰上溶解。在滅菌后的超凈工作臺(tái)上，向200μ L離心管內(nèi)依次加入以下連接體系:Solution I 2.5 μ L，PCR純化產(chǎn)物2.0μ L (50ng/y L),pMD19-T Vector (50ng/μ L)0.5 μ L，總量為 5 μ L?；靹?，16°C 靜置反應(yīng) 30mino(3)從_80°C冰箱中拿出T0P10感受態(tài)細(xì)胞放在冰上，待其剛好解凍時(shí)(約5-10min)，將上述連接體系全量5 μ L加入到50 μ L感受態(tài)細(xì)胞中混勻后將樣品轉(zhuǎn)入1.5mL的離心管內(nèi)，然后迅速放于冰中冰浴30min。(4)打開水浴鍋，溫度設(shè)置為42°C，同時(shí)提前打開恒溫培養(yǎng)箱和恒溫?fù)u床，溫度設(shè)定為37°C。(5)冰浴結(jié)束后迅速放入42°C水浴鍋內(nèi)熱激45sec，再迅速放入冰中冰浴2min，期間不要搖晃樣品，要輕拿輕放。(6) 4°C冰箱中取出未加氨節(jié)青霉素(Amp)的LB液態(tài)培養(yǎng)基,并向從冰中取出的樣品中加入450 μ L不含Amp的液態(tài)LB培養(yǎng)基，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)90min。(7)重復(fù)操作步驟I。(8)取100 μ L上述培養(yǎng)物用涂布器均勻涂布于倒好的固態(tài)LB培養(yǎng)基上(加有Amp+、ITPG和X-gal)，剩余的培養(yǎng)物可以保存在4°C冰箱中，以備涂板效果不好時(shí)再次使用。(9)涂好的板正放于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，然后倒置培養(yǎng)過夜(約14-16h)。5.4重組質(zhì)粒的鑒定(I)取出培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)皿，觀察平板上細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。如生長(zhǎng)密度，可根據(jù)需要調(diào)整下次涂板的菌液量；細(xì)菌分布情況，可據(jù)此判斷涂板時(shí)是否涂布的均勻；陽(yáng)性菌落，陽(yáng)性菌落為白斑，陰性菌落為藍(lán)斑；菌落大小，可據(jù)此調(diào)整平板培養(yǎng)時(shí)間。(2)將培養(yǎng)好的平板用封口膜封口，并放于4°C冰箱中保存8小時(shí)，待藍(lán)白斑更為明顯時(shí)挑菌。(3)在滅菌后的超凈工作臺(tái)中，從培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)皿上挑取白色單個(gè)菌落接種于盛有500 μ L37°C預(yù)熱的液態(tài)LB/Amp+培養(yǎng)基的1.5mL離心管中，用封口膜封口后放于37°C搖床中200rpm/min培養(yǎng)過夜。(4)將平板封口后放于4°C冰箱中保存，以備測(cè)序失敗再次挑菌。(5)菌液PCR檢測(cè):在滅菌的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作，PCR反應(yīng)體系為:2XGCbuffer I 10μ L，dNTP(2.5mmol/L)3.2μ L，上下游混合引物(lOpmol/L) 0.6 μ L, LA Taq 酶(5U/ μ L) 0.2 μ L, ddH204 μ L,菌液 2 μ L,總計(jì) 20 μ L。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，64°C退火 30s，72°C延伸 30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。(3)結(jié)果鑒定:菌 液PCR結(jié)果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，依據(jù)擴(kuò)增片段有無(wú)和大小，鑒定外源目的DNA是否插入質(zhì)粒中。5.5克隆片段序列測(cè)定將上述陽(yáng)性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣本送測(cè)3個(gè)重復(fù)，以確保測(cè)序準(zhǔn)確性。AA和BB兩種純合型PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果如圖4a和4b，發(fā)現(xiàn)B等位基因在擴(kuò)增片段第74bp處發(fā)生G — T的突變，即第一外顯子第55位堿基處發(fā)生突變。該突變導(dǎo)致編碼基因密碼子由GCG突變?yōu)門CG，從而使氨基酸由Ala突變?yōu)镾er，AA基因型為GG純合子，BB基因型為TT純合子。AA基因型的核苷酸序列如SEQ ID N0.:3所示，BB基因型的核苷酸序列如SEQ IDN0.:4所示。6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析對(duì)該多態(tài)位點(diǎn)等位基因的基因頻率、基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)等遺傳多態(tài)性指標(biāo)。結(jié)果見表1，AB型個(gè)體在群體中的頻率最高，A、B等位基因頻率相當(dāng)。試驗(yàn)群體C0Q2基因第一外顯子上的突變位點(diǎn)雜合度為0.500，PIC為0.375，屬中度多態(tài)。表1C0Q2基因第一外顯子多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率、基因頻率及遺傳多態(tài)性指標(biāo)
權(quán)利要求
1.一種布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性序列，其特征在于，所述序列是布萊凱特黑牛C0Q2基因第一外顯子第55位為G或T的堿基多態(tài)性序列。
2.—種布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 以包含C0Q2基因的待測(cè)布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增布萊凱特黑牛C0Q2基因第一外顯子；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)并對(duì)基因分型；對(duì)基因分型的純合子測(cè)序得到布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的引物對(duì)P為: 上游引物:5，-TGCCGCTGACCTGACGCTC-3，； 下游引物:5’ -CCCCACAGCCATGCCTGAG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系為:50ng/yL 的基因組DNAlyL，2XGC buffer I 10μ L,2.5mmol/L 的 dNTP3.2μ L，lOpmol/L 上下游混合引物 0.6 μ L，5U/μ L 的 LA Taq 酶 0.2 μ L，ddH205 μ L，總計(jì)20 μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述SSCP檢測(cè)應(yīng)用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，還包括對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)等位基因的基因頻率、基因型頻率和遺傳多態(tài)性指標(biāo)的檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的遺傳多態(tài)性指標(biāo)為純合度Ho、雜合度He、有效等位基因數(shù)Ne和多態(tài)信息含量PIC。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，還包括C0Q2基因第一外顯子變異前后對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的布萊凱特黑牛C0Q2基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析采用軟件DNAStar Lasergene7。
全文摘要
本發(fā)明公開了布萊凱特黑牛COQ2基因第一外顯子部分序列的多態(tài)位點(diǎn)及其檢測(cè)方法，以包含COQ2基因的待測(cè)布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增布萊凱特黑牛COQ2基因第一外顯子；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)并對(duì)基因分型；對(duì)基因分型的純合子測(cè)序得到布萊凱特黑牛COQ2基因單核苷酸多態(tài)性序列。根據(jù)PCR-SSCP及測(cè)序結(jié)果分析顯示，COQ2基因第一外顯子第55位為G或T。COQ2基因?qū)oQ10合成量和合成速度及肉質(zhì)的影響具有重大意義，因此對(duì)其SNP的檢測(cè)及分析可以作為優(yōu)質(zhì)肉牛品種選育的分子標(biāo)記，為布萊凱特黑牛優(yōu)良種質(zhì)的選育提供重要技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103146698SQ201310103088
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者董雅娟, 牛召珊 申請(qǐng)人:董雅娟