專(zhuān)利名稱(chēng)：樹(shù)鼩il-6構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體是一種以克隆的樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，在此基礎(chǔ)上建立的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素6 (Interleukin6, IL-6)，又名P 2—干擾素，是一種由淋巴類(lèi)及非淋巴類(lèi)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的具有多種生物功能的細(xì)胞因子，它可以刺激多種細(xì)胞增殖、分化，并在機(jī)體免疫應(yīng)答、骨髓造血、自身免疫和機(jī)體防御等方面均起著重要作用。在抗感染過(guò)程中，IL-6是主要的促炎癥細(xì)胞因子，可促進(jìn)⑶4T細(xì)胞的分化及促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2及表達(dá)IL-2受體。此外，IL-6還具有促進(jìn)漿細(xì)胞分化和B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的作用。樹(shù)斷|(tree shrew, Tupaia belangeri)是一種生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀駒類(lèi)的小型動(dòng)物，形態(tài)酷似松鼠，是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的近親。由于樹(shù)駒具有體型小，經(jīng)濟(jì)易得，易馴養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)，飼養(yǎng)管理成本低、對(duì)人類(lèi)病毒易感等優(yōu)點(diǎn)，常常用于替代或減少一些非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的使用，所以很早就被用作靈長(zhǎng)類(lèi)目(包括人類(lèi))的疾病動(dòng)物模型。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、腫瘤等疾病的研究中得到廣泛應(yīng)用。丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液/體液傳播，占輸血后肝炎的70%，HCV感染是全世界范圍內(nèi)造成慢性肝病的主要原因。WHO估計(jì)全球有1.7億人感染丙型肝炎病毒。然而，到目前為止還沒(méi)有相關(guān)的疫苗和有效治愈的藥物，究其原因在于沒(méi)有理想的小動(dòng)物模型，致使其慢性感染機(jī)制不清楚，導(dǎo)致于HCV疫苗研制和臨床治療舉步維艱。有研究表明樹(shù)駒不僅可以被丙型肝炎病毒(HCV)在體內(nèi)感染，而且樹(shù)駒的原代肝細(xì)胞也可以在體外被感染，也有研究證實(shí)樹(shù)駒有效感染HCV后，可發(fā)展為慢性肝炎、肝脂肪變性、肝纖維化、肝硬化結(jié)節(jié)及腫瘤，表明樹(shù)駒是可作為模型動(dòng)物用以研究丙型肝炎發(fā)病機(jī)制，預(yù)防治療及新藥研發(fā)的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這為HCV慢性感染機(jī)制的研究提供了良好的研 究平臺(tái)。
有專(zhuān)家證實(shí)，在慢性及重型丙型肝炎感染者血清中IL-6水平明顯上升，且上升幅度與HCV病毒載量、血清中ALT水平呈正相關(guān)，同時(shí)也和病情的輕重和病程長(zhǎng)短有密切關(guān)系。也有研究發(fā)現(xiàn)，在HCV感染的慢性化及肝細(xì)胞損傷過(guò)程中，IL-6起到非常重要的促進(jìn)作用；在重型乙型肝炎患者血清中，也有類(lèi)似變化；也有研究發(fā)現(xiàn)，在重癥手足口病患兒血清中，IL-6較正常對(duì)照組明顯升高，這可能參與了重癥手足口病的病理發(fā)病過(guò)程，但目前對(duì)樹(shù)駒IL-6方面的研究鮮有報(bào)道，致使缺乏對(duì)樹(shù)駒動(dòng)物模型免疫細(xì)胞因子方面的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的空缺，本發(fā)明的目的在于建立以樹(shù)駒特異性IL-6基因構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。本發(fā)明首先以確定樹(shù)駒IL-6基因序列為目的，并根據(jù)所獲得的基因序列制備標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，在mRNA水平建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)樹(shù)駒IL-6的方法，為今后制備IL-6單克隆抗體及研究其在樹(shù)駒疾病模型中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理奠定基礎(chǔ)建立一種穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、靈敏度高的樹(shù)駒IL-6檢測(cè)方法，從細(xì)胞因子方面，進(jìn)一步證實(shí)樹(shù)駒是作為HCV和手足口病研究的合適的小動(dòng)物模型。為HCV和EV71的感染化機(jī)制、HCV藥物治療以及疫苗研究提供一定的基礎(chǔ)。為了達(dá)到本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采取熒光定量TAQMAN PCR技術(shù)，根據(jù)克隆的樹(shù)駒IL-6cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了用于檢測(cè)樹(shù)駒IL-6基因表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)其靈敏性。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:一種樹(shù)駒IL-6構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，包括如下步驟:(I)對(duì)樹(shù)駒IL-6基因片段的克隆并測(cè)序，(2)以克隆的樹(shù)駒IL-6基因片段為目標(biāo)，設(shè)計(jì)TAQMAN PCR引物和探針，(3)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到引物的退火溫度、引物濃度和探針濃度，并提純樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒計(jì)算IL-6基因片段拷貝數(shù)，(4)以計(jì)算好的樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒用10倍梯度稀釋?zhuān)渲瓶截悢?shù)為IO5 IO8Copies陽(yáng)性質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，(5)驗(yàn)證本方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性和靈敏性。步驟(I)所述克隆為以經(jīng)ConA (Concanavalin)誘導(dǎo)培養(yǎng)的樹(shù)斷!淋巴細(xì)胞總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR方 法克隆出樹(shù)駒IL-6cDNA片段，將該片段純化后，通過(guò)T-A克隆連接到PMT-19T質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci中進(jìn)行擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆子提取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行純化，獲得樹(shù)駒IL-6分子測(cè)定的外參照陽(yáng)性質(zhì)粒。步驟(2)所述引物和探針為:IL-6FP:5’ - GACAGTATTTACAAGTGCAGGGT - 3’IL-6RP:5’ - TCCAAAAGACCAGTGATGATTC - 3’IL-6Probe:5’ (FAM) - ACTGGCAAAAAACAATCTGAACCTTC-(TAMRA)3'。 步驟(3 )所述實(shí)驗(yàn)為:A.退火溫度的確定:根據(jù)本引物和探針特點(diǎn)分別設(shè)計(jì)退火溫度55°C、56°C、57°C、58°C以確定其最佳退火溫度，以PMD-19T IL-6質(zhì)粒為模板應(yīng)用PCR儀進(jìn)行梯度擴(kuò)增:dream Mix Taq酶25uL、dH2022uL、Tupaia-1L-6FP/RP 各自 luL、模板 luL，混合均勻；95 °C 5min ；95 °C 30s,55 580C 30s,720C 45s，35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;擴(kuò)增產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以58°C條件下電泳條件最清晰，條帶位置正確，無(wú)非特異擴(kuò)增，因此確定退火溫度Tm=58°C ；B.引物濃度的確定:引物濃度:以相同條件下能夠檢測(cè)到的模板濃度最低，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、清晰為引物選擇標(biāo)準(zhǔn)；以100nm、200nm、500nm3個(gè)不同濃度的IL_6Taqman PCR上下游引物濃度，分別用同一濃度IL-6重組質(zhì)粒為模板，共分為3個(gè)反應(yīng)體系列組，同時(shí)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系為 25uL:Realtime PCR Master Mixl2.5ul、Tupaia_IL_6FP/RP 各自 Iul、DEPC處理水 8.5ul、模板 2ul 混合均勻；95°C 3min ；95°C 30s, 58 °C 30s, 72 °C lmin, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin擴(kuò)增，4°C備用；擴(kuò)增產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，不同引物濃度下電泳顯示:引物200nm為最低濃度；C.探針濃度的確定:以相同模板濃度下循環(huán)閾值(Ct)最小、熒光信號(hào)比(Rn)活度最大為探針選擇標(biāo)準(zhǔn)；采用50nm、100nm、200nm3個(gè)探針濃度，分別用同一濃度IL-6重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行Taqman PCR 檢測(cè)；反應(yīng)體系為 25uL: 2X One Step RT-PCR Buffer II 12.5uL、Takara ExTaqHS0.5uL>Primer Script RT Enzyme Mix II 0.5uL、Tupaia-1L_6FP/RP各自 0.5uL、Probe溶液 0.5uL、模板 luL、Easy dilusion9uL,混合均勻；95°C 3min ；95°C 10s, 58°C 30s, 40 個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘，4°C保存?zhèn)溆?；觀察擴(kuò)增曲線和檢測(cè)報(bào)告，通過(guò)不同探針濃度擴(kuò)增曲線和Ct值顯示，該檢測(cè)體系在200nm條件下Ct值最小，Rn最大擴(kuò)增曲線良好。步驟(3)根據(jù)以下公式計(jì)算拷貝數(shù):拷貝數(shù)(copies/m) =質(zhì)量濃度(ug/uL) X阿氏常數(shù)/質(zhì)粒分子量；阿氏常數(shù)為6.02X1023 ;質(zhì)粒分子量=一個(gè)堿基對(duì)的分子量(649) X重組質(zhì)?？傞L(zhǎng)度(bp)。一種以樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針熒光定量PCR方法，包括對(duì)樹(shù)鼠句IL-6基因片段的克隆并測(cè)序，以克隆的樹(shù)駒IL-6基因?yàn)槟繕?biāo)，設(shè)計(jì)TAQMAN PCR引物和探針，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)找到最優(yōu)條件下引物的退火溫度、引物濃度、探針濃度，提純樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒計(jì)算IL-6基因片段拷貝數(shù)，以計(jì)算好的樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒用10倍梯度稀釋?zhuān)渲瓶截悢?shù)為IO5 IO8Copies陽(yáng)性質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)其靈敏性。其中，(I) PCR引物為兩條IL-6寡聚核苷酸引物F/R:F:5’ - ATGGCTACTGCTCTTCCCAC - 3’R:5’ - CTACATTAGCCGAGAAGCCC - 3’(2)以經(jīng)ConA (Concanavalin)誘導(dǎo)培養(yǎng)的樹(shù)斷!淋巴細(xì)胞總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR方法克隆出樹(shù)駒IL-6cDNA片段，將該片段純化并測(cè)序；(3)該片段純化后，通過(guò)T-A克隆連接到PMT-19T質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中進(jìn)行擴(kuò)增；篩選陽(yáng)性克隆子提取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行純化，獲得樹(shù)駒IL-6分子測(cè)定的外參照陽(yáng)性質(zhì)粒。此外，樹(shù)駒IL-6寡聚核苷酸引物和探針為:IL-6FP:5’ - GACAGTATTTACAAGTGCAGGGT - 3’IL-6RP:5’ - TCCAAAAGACCAGTGATGATTC - 3’IL-6Probe:5’ (FAM) - ACTGGCAAAAAACAATCTGAACCTTC - (TAMRA)3’該方法包括:(I)檢測(cè)體系退火溫度的確定，(2)檢測(cè)體系探針濃度和引物濃度的確定，(3)配置IO5 IO8拷貝數(shù)的IL-6質(zhì)粒，以此為模板建立了該檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線， (4)利用確定濃度的IL-6質(zhì)粒分別10倍梯度稀釋?duì)│?、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102、IO1UOtlc0Pies,得到動(dòng)力學(xué)曲線，檢測(cè)該檢測(cè)體系的靈敏性；(5)并檢測(cè)其靈敏性。
本發(fā)明以樹(shù)駒特異性IL-6基因構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，它包括的步驟概括為:A對(duì)樹(shù)駒IL-6基因片段的克隆并測(cè)序。B以克隆的樹(shù)駒IL-6基因片段為目標(biāo)，通過(guò)Primer Premier5.0軟件在該片段上設(shè)計(jì)合適的引物和探針。C設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)條件下的引物的退火溫度、引物濃度、探針濃度并提純質(zhì)粒計(jì)算IL-6基因片段拷貝數(shù)。D以計(jì)算好的樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒，以10倍梯度稀釋?zhuān)渲瓶截悢?shù)為IO5 IO8Copies陽(yáng)性質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。E驗(yàn)證本方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性和靈敏性。


下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。圖1為不同退火溫度下樹(shù)駒IL-6基因組核苷酸片段RT-PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。圖2為樹(shù)駒IL-6全基因組核苷酸序列測(cè)定結(jié)果。圖3為利用樹(shù)駒IL-6核苷酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)。圖4為不同退火溫度下IL-6基因片段擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果。圖5為不同引物濃 度下IL-6基因片段擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果。圖6為不同探針濃度擴(kuò)增曲線和Ct值。圖7為以IO5 IO8Copies為模板建立的擴(kuò)增曲線。圖8為以IO5 IO8Copies為模板建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系。圖9為檢測(cè)其靈敏性建立的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:以樹(shù)駒特異性IL-6基因構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立:實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)或彭秀玲等人，基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)，(科學(xué)技術(shù)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商建議的條件。對(duì)樹(shù)駒IL-6基因片段的克隆并測(cè)序:1.PCR引物的設(shè)計(jì)和PCR的擴(kuò)增PCR引物是根據(jù)GenBank中下載的10余條不同物種的IL-6核酸序列，通過(guò)序列比對(duì)后得到保守序列，在其中設(shè)計(jì)而獲得，由invitrogen公司合成。無(wú)菌取樹(shù)駒脾臟，分離其淋巴細(xì)胞，用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)并用ConA誘導(dǎo)刺激，從經(jīng)過(guò)ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)的樹(shù)駒淋巴細(xì)胞提取RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以提取的RNA為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA (Revert Aid H MinusFirst strand cDNA synthesis Kit 購(gòu)自 Thermo)。利用下列引物進(jìn)行梯度PCR (Dream Taq Green PCR Master Mix 購(gòu)自 Thermo):上游特異性引物:5’ - ATGGCTACTGCTCTTCCCAC _ 3’ ；下游特異性引物:5’ - CTACATTAGCCGAGAAGCCC - 3’ ；循環(huán)參數(shù)為:95 °C 3min ；95 °C 30s, 45 70 °C 30s,72°C 45s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0用樹(shù)鼠句管家基因GAPDH (Glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase)作為陽(yáng)性對(duì)照，引物為 5 ' - CCATCACCATCTTCCAGGAGCGAG - 3 '和5' - CAAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG - 3'，退火溫度為 52°C。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 564bp，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。2.PCR產(chǎn)物純化使用(TIANGENTIAgel Midi Purification kit)完成 PCR 產(chǎn)物純化。具體操作步驟如下:(I)配制1%瓊脂糖凝膠，將上述步驟I所得PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，100伏電壓電泳30分鐘。(2)紫外燈下切下含有目的DNA瓊脂糖膠塊,稱(chēng)重,放入新的1.5mL eppendorftube 中 ο(3)按300uL/100mg瓊脂糖凝膠的比例加入溶膠液PN，50°C水浴10分鐘，溫和翻轉(zhuǎn)至徹底融化。 (4)柱平衡步驟:向吸附柱CA2中加入500uL平衡液BL，12，OOOrpm離心I分鐘，
倒廢液，吸附柱重放回收集管中。(5)將上述溶膠后的溶液放入一個(gè)處理過(guò)的CA2中，室溫放2分鐘，12，OOOrpm離心I分鐘，棄廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。(6)向CA2中加入600uL漂洗液PW，(使用前檢查是否加入無(wú)水乙醇)，12，OOOrpm離心I分鐘，棄廢液。(7)重復(fù)步驟(6)。(8)將CA2放回收集管，12，OOOrpm離心2分鐘，將CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。(9)將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間懸空滴加38uL洗脫緩沖液，室溫放2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘收集DNA溶液。純化的PCR產(chǎn)物放于-80°C，待用。3純化產(chǎn)物與PMD19-T載體的連接和轉(zhuǎn)化3.1受體菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備(I)從37°C培養(yǎng)16-20小時(shí)的DH5 α新鮮平板上挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)至5mL LB培養(yǎng)液中，37 0C，200rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。(2)將培養(yǎng)物接種到200mL LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至OD值為0.3 0.5 (波長(zhǎng)260nm),然后置于水浴鍋中20分鐘。(3)用預(yù)冷的50mL離心管收集菌體，冰上冷卻10分鐘，4°C，6000rpm離心5分鐘。(4)棄上清，于超凈臺(tái)中倒置10 20秒，控干管壁上的液滴。(5)用預(yù)冷的0.1M CaC1210mL重懸菌體，冰浴10分鐘，4°C，6000rpm離心5分鐘；棄上清，于超凈臺(tái)中倒置10 20秒，控干管壁上的液滴。(7)加入預(yù)冷的0.1M CaCl2ImL/管，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置5分鐘。置于4°C。(8)立即取IOOuL新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物。
(9)轉(zhuǎn)化后14小時(shí)左右觀察轉(zhuǎn)化平板，檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率。(10)取出置于4°C的感受態(tài)細(xì)胞，加入等體積的_20°C預(yù)冷的0.lMCaC12_甘油(由
0.lMCaC12和甘油等體積混合后高壓蒸汽滅菌而成)，混合后以150uL/管分裝至_20°C預(yù)冷的無(wú)菌微量離心管中，立即置于_80°C保存。3.2純化產(chǎn)物與pMD19-T載體的連接和轉(zhuǎn)化使用pMD19-T載體(大連寶生物工程公司)與步驟2純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng):20uL 反應(yīng)體系=SolutionllOuL, pMD19_T 載體 2uL, Insert DNA8uL ;混和均勻，16。。連接I小時(shí)。3.3轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α(I) 20uL連接產(chǎn)物加入100uLDH5 α中，同時(shí)取另一支100uLDH5 α做陰性對(duì)照。冰中放30分鐘。(2) 42 V熱激90秒，再在冰上放2分鐘。(3)加入600uL SOC培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60分鐘。3000rpm離心5分鐘，棄部分
上清，使菌體剛好懸起為止。(4)用L棒將上述菌體涂布于在含有氨節(jié)的LB瓊脂平板上,過(guò)夜培養(yǎng)(12 16h),使之形成單個(gè)菌落。(5)挑 取單個(gè)菌落至5mL LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)取5mL LB液體培養(yǎng)基做陰性對(duì)照，37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)12小時(shí)。3.4陽(yáng)性重組質(zhì)粒的提取使用TIANprep Mini Plasmid kit (天根公司)完成陽(yáng)性重組質(zhì)粒的提取。具體步驟如下:(I)柱平衡:向吸附柱CP3中加入500uL平衡液BL，12，OOOrpm離心I分鐘，倒廢
液(請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子)。(2)取I 5mL菌液,加入1.5mL EP管中，12，OOOrpm離心I分鐘,吸出上清,至菌體剛好懸起為好。(3)向菌體沉淀加入250uL溶液Pl (先檢查是否加入RNaseA)，懸浮細(xì)菌沉淀。(4)向EP管加入250uL溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次使菌體充分裂解。(5)向EP管加入350uL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。12, OOOrpm離心10分鐘。(6)將上一步收集的上清液吸到吸附柱CP3中，不要洗到沉淀，12，OOOrpm離心I分鐘。(7)向吸附柱CP3中加入500uL去蛋白液Η)，12，000離心I分鐘，棄廢液。(8)向吸附柱CP3中加入600uL漂洗液PW(先檢查是否加入無(wú)水乙醇)，12，OOOrpm
離心I分鐘，棄廢液。(9)重復(fù)步驟(8)。(10)將吸附柱CP3放入收集管中，12，OOOrpm離心2分鐘，目的是將吸附柱中殘余
漂洗液去除。(11)將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的EP管中，向吸附柱膜中間部位滴加50 IOOuL洗脫緩沖液EB，室溫放2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，收集質(zhì)粒溶液。
3.5酶切鑒定目的片段20uL 酶切體系:BamH I Buffer2uL, BamH I luL, Hind III 2uL,上一步提取的質(zhì)粒15uL。在冰上加樣，37°C水浴2小時(shí)。酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。4重組質(zhì)粒的核苷酸序列測(cè)定本研究中所有重組質(zhì)粒的核苷酸序列均委托invitrogen公司完成測(cè)序工作(圖2)5根據(jù)所得樹(shù)駒IL-6核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖3)6TAQMAN PCR檢測(cè)體系的建立6.1根據(jù)重組質(zhì)粒片段564bp序列,利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物和探針，引物跨越內(nèi)含子，目的片段長(zhǎng)度為137bp，序列情況如下:Tupaia-1L-6FP:5’ - GACAGTATTTACAAGTGCAGGGT - 3'Tupaia-1L-6RP:5’ - TCCAAAAGACCAGTGATGATTC - 3'Tupaia-1L-6probe:5，(FAM) - ACTGGCAAAAAACAATCTGAACCTTC - (TAMRA) 3 '引物和探針均由北京三博志遠(yuǎn)有限公司合成。6.2PCR擴(kuò)增及退火溫度·的確定根據(jù)本弓I物和探針特點(diǎn)分別設(shè)計(jì)退火溫度550C、56 °C、57 °C、58 °C確定其最佳退火溫度。采用下列反應(yīng)體系和條件，以PMD-19T IL-6質(zhì)粒為模板應(yīng)用PCR儀進(jìn)行梯度擴(kuò)增:dream Mix Taq 酶 25uL、dH2022uL、Tupaia_IL_6FP/RP 各自 luL、模板 IuL,混合均勻。950C 3min ；95°C 30s, 55 58°C 30s, 72°C 45s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 擴(kuò)增產(chǎn)物于 2.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。通過(guò)電泳結(jié)果可知:不同退火溫度下都能得到137bp的擴(kuò)增片段，以58°C條件下電泳條件最清晰，條帶位置正確無(wú)非特異擴(kuò)增，因此本檢測(cè)體系確定Tm=58°C(圖 4)。6.3引物和探針濃度的確定:引物濃度:以相同條件下能夠檢測(cè)到的模板濃度最低，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、清晰為引物選擇標(biāo)準(zhǔn)。以100nm、200nm、500nm3個(gè)不同濃度的IL-6Taqman PCR上下游引物濃度，分別用同一濃度IL-6重組質(zhì)粒為模板，共分為4個(gè)反應(yīng)體系列組，同時(shí)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為 25uL: Realtime PCR Master Mixl2.5ul、Tupaia-1L_6FP/RP各自 lul、DEPC處理水
8.5ul、模板 2ul 混合均勻。循環(huán)次數(shù)為 35 個(gè)，95°C 3min ；95°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin, 35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin擴(kuò)增；4°C備用。擴(kuò)增產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。不同引物濃度下電泳顯示:引物200nm為最低濃度，該濃度能很好地?cái)U(kuò)增目的片段(圖5)。探針濃度:以相同模板濃度下循環(huán)閾值(Ct)最小、熒光信號(hào)比(Rn)活度最大為探針選擇標(biāo)準(zhǔn)。采用50nm、100nm、200nm3個(gè)探針濃度,分別用同一濃度IL-6重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行 Taqman PCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系為 25uL:2X One Step RT-PCR Buffer II 12.5uL,TakaraEx Taq HS0.5uL、Primer Script RT Enzyme Mix II 0.5uL、Tupaia-1L_6FP/RP 各自 0.5uL、Probe 溶液 0.5uL、模板 luL、Easy dilusion9uL,混合均勻。95°C 3min ；95°C 10s, 58°C 30s,40個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘；4°C保存?zhèn)溆?。觀察擴(kuò)增曲線和檢測(cè)報(bào)告。通過(guò)不同探針濃度擴(kuò)增曲線和Ct值顯示，該檢測(cè)體系在200nm條件下Ct值最小，Rn最大擴(kuò)增曲線良好(圖6)。6.4質(zhì)?？截悢?shù)測(cè)定:測(cè)其質(zhì)粒A260/A280 (1.8 2.0)根據(jù)以下公式計(jì)算拷貝數(shù):
拷貝數(shù)(copies/m) =質(zhì)量濃度(ug/uL) X阿氏常數(shù)/質(zhì)粒分子量。阿氏常數(shù)為
6.02X1023 ;質(zhì)粒分子量=一個(gè)堿基對(duì)的分子量(649) X重組質(zhì)粒總長(zhǎng)度(bp)。6.5Taqman PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒按照IX IO5 IX IO8拷貝數(shù)濃度進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?個(gè)不同分子量的PMD-19T IL-6陽(yáng)性質(zhì)粒濃度樣品，分別進(jìn)行TaqMan PCR分析，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果中樣品的分子數(shù)的對(duì)數(shù)值及其Ct值的對(duì)應(yīng)關(guān)系得到擴(kuò)增曲線(圖7)，并繪制出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。從上圖可知本檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)，線性關(guān)系良好，其斜率=-3.337，截距=34.243,R2=0.992?？傻帽緳z測(cè)體系線性方程為 Ct=_3.337Log (copynumber) +34.243(圖 8)；7檢測(cè)體系靈敏性的評(píng)價(jià)將計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒做10倍梯度稀釋?zhuān)截悢?shù)分別為108、107、106、105、ΙΟ4、ΙΟ3、ΙΟ2、101、10°COpieS，得到動(dòng)力學(xué)曲線，以Ct值>25個(gè)循環(huán)為下限檢測(cè)該體系的靈敏性。通過(guò)擴(kuò)增曲線可知本檢測(cè)體系可檢`測(cè)到IO2拷貝數(shù)級(jí)別(圖9)。
權(quán)利要求
1.一種樹(shù)駒IL-6構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)對(duì)樹(shù)駒IL-6基因片段的克隆并測(cè)序， (2)以克隆的樹(shù)駒IL-6基因片段為目標(biāo)，設(shè)計(jì)TAQMANPCR引物和探針， (3)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到引物的退火溫度、引物濃度和探針濃度，并提純樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒計(jì)算IL-6基因片段拷貝數(shù)， (4)以計(jì)算好的樹(shù)駒IL-6質(zhì)粒用10倍梯度稀釋?zhuān)渲瓶截悢?shù)為IO5 IO8Copies陽(yáng)性質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線， (5 )驗(yàn)證本方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性和靈敏性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹(shù)駒IL-6構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,其特征在于,步驟(I)所述克隆為以經(jīng)ConA (Concanavalin)誘導(dǎo)培養(yǎng)的樹(shù)鼠句淋巴細(xì)胞總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR方法克隆出樹(shù)駒IL-6 cDNA片段，將該片段純化后，通過(guò)T-A克隆連接到PMT-19T質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a中進(jìn)行擴(kuò)增，篩選并提取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行純化，獲得樹(shù)駒IL-6分子測(cè) 定的外參照陽(yáng)性質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹(shù)駒IL-6構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其特征在于，步驟(2)所述引物和探針為:IL-6 FP:5’ - GACAGTATTTACAAGTGCAGGGT - 3’IL-6RP:5’ - TCCAAAAGACCAGTGATGATTC - 3’IL-6Probe:5’ (FAM) - ACTGGCAAAAAACAATCTGAACCTTC-(TAMRA)3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹(shù)駒IL-6構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其特征在于，步驟(3)所述實(shí)驗(yàn)為: A.退火溫度的確定: 根據(jù)本引物和探針特點(diǎn)分別設(shè)計(jì)退火溫度55°C、56°C、57°C、58°C以確定其最佳退火溫度，以PMD-19T IL-6質(zhì)粒為模板應(yīng)用PCR儀進(jìn)行梯度擴(kuò)增:dream Mix Taq酶25uL、dH2022uL、Tupaia-1L-6 FP/RP 各自 luL、模板 luL，混合均勻；95°C 3min ；95°C 30s, 55 58°C30s, 72°C 45s，35個(gè)循環(huán)；72°C 10 min ;擴(kuò)增產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以58°C條件下電泳條件最清晰，條帶位置正確，無(wú)非特異擴(kuò)增，因此確定退火溫度Tm=58°C ； B.引物濃度的確定: 引物濃度:以相同條件下能夠檢測(cè)到的模板濃度最低，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、清晰為引物選擇標(biāo)準(zhǔn)；以100nm、200nm、500nm 3個(gè)不同濃度的IL-6 Taqman PCR上下游引物濃度,分別用同一濃度IL-6重組質(zhì)粒為模板，共分為3個(gè)反應(yīng)體系列組，同時(shí)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系為 25uL:Realtime PCR Master Mix 12.5ul,Tupaia-1L-6 FP/RP 各自 lul、DEPC 處理水 8.5ul、模板 2ul 混合均勻；95°C 3min ；95°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin擴(kuò)增，4°C備用；擴(kuò)增產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，不同引物濃度下電泳顯示:引物200nm為最低濃度； C.探針濃度的確定: 以相同模板濃度下循環(huán)閾值(Ct)最小、熒光信號(hào)比(Rn)活度最大為探針選擇標(biāo)準(zhǔn)；采用50nm、100nm、200nm 3個(gè)探針濃度，分別用同一濃度IL-6重組質(zhì)粒為模板,進(jìn)行TaqmanPCR 檢測(cè)；反應(yīng)體系為 25uL:2X One Step RT-PCR Buffer II 12.5uL、Takara Ex Taq HS.0.5uL、Primer Script RT Enzyme Mix II 0.5uL、Tupaia-1L-6 FP/RP 各自 0.5uL、Probe溶液 0.5uL、模板 luL、Easy dilusion 9uL,混合均勻；95°C 3min ；95°C 10s, X°C 30s, 40 個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘，4°C保存?zhèn)溆?；觀察擴(kuò)增曲線和檢測(cè)報(bào)告，通過(guò)不同探針濃度擴(kuò)增曲線和Ct值顯示，該檢測(cè)體系在200nm條件下Ct值最小，Rn最大擴(kuò)增曲線良好。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹(shù)駒IL-6構(gòu)建的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其特征在于，步驟(3)根據(jù)以下公式計(jì)算拷貝數(shù): 拷貝數(shù)(copies/m) =質(zhì)量濃度(ug/uL) X阿氏常數(shù)/質(zhì)粒分子量，其中，阿氏常數(shù)為.6.02X1023 ;質(zhì)粒分子量=一個(gè)堿基對(duì)的分子量(649) X重組質(zhì)?？傞L(zhǎng)度(bp)。
全文摘要
一種以樹(shù)鼩IL-6質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品的TAQMAN探針熒光定量PCR方法，包括對(duì)樹(shù)鼩IL-6基因片段的克隆并測(cè)序，以克隆的樹(shù)鼩IL-6基因?yàn)槟繕?biāo)，設(shè)計(jì)TAQMANPCR引物和探針，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)找到最優(yōu)條件下引物的退火溫度、引物濃度、探針濃度，提純樹(shù)鼩IL-6質(zhì)粒計(jì)算IL-6基因片段拷貝數(shù)，以計(jì)算好的樹(shù)鼩IL-6質(zhì)粒用10倍梯度稀釋?zhuān)渲瓶截悢?shù)為105～108copies陽(yáng)性質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)其靈敏性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103146838SQ20131010484
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者代解杰, 黃曉燕, 孫曉梅, 罕園園, 陸彩霞, 匡德宣, 王文廣, 仝品芬, 徐娟, 殷安國(guó), 李曉飛 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所