專利名稱：一種釀酒酵母菌株及其在制備耐熱超氧化物歧化酶中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種釀酒酵母菌株及其在制備耐熱超氧化物歧化酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)廣泛存在于各類生物體中，是機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基的天然消除劑，對(duì)機(jī)體細(xì)胞起保護(hù)作用。因此，SOD在抗衰老以及預(yù)防腫瘤和抗炎等方面起著重要的生理作用，收到國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥日用化工，食品及生化界的極大關(guān)注。
根據(jù)SOD所含金屬輔基的不同，一般可將其分為Cu、Zn-SOD, Mn-SOD和Fe-SOD三種類型。
SOD在臨床上有較廣泛的應(yīng)用，如用于骨關(guān)節(jié)炎、急性肝與慢性肝的炎癥反應(yīng)，SOD可去除由炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的大量的超氧化自由基，對(duì)消除炎癥，恢復(fù)肝功能起到一定的作用:用于治療因超氧陰離子傷害引起的疾病，如心肌缺血及缺血再灌注綜合癥，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，放射性膀胱炎，紅斑狼瘡等。
SOD在食品工業(yè)主要應(yīng)用四方面:1)作為保健食品的功效因子或食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化齊U，添加到各種食品中。2)制成多種劑型的SOD或復(fù)合型食品。3)用作食品的天然抗氧化齊U。4)以富含SOD的原料加工制成保健食品。此外，SOD添加于化妝品中可起到防曬，防止脂褐素的形成，防治皮膚病以及防治瘢痕形成等作用。
我國(guó)自上世紀(jì)八十年代以來(lái)，對(duì)SOD的應(yīng)用研究主要側(cè)重于動(dòng)植物SOD的提取和純化，國(guó)內(nèi)產(chǎn)品大部 分是從動(dòng)物血液中制備的，但由于原材料有限及衛(wèi)生安全性等原因，導(dǎo)致制品產(chǎn)量有限，且血液制品的安全性風(fēng)險(xiǎn)加大，這種方法慢慢的被淘汰。利用基因工程是廣開(kāi)SOD酶源，降低成本和獲得具有天然活性的SOD有效途徑。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),又叫面包酵母,在釀酒業(yè)和面包業(yè)中的使用也有數(shù)千年歷史，被認(rèn)識(shí)是GARS生物(generally recognized as safe),已被美國(guó)FDA認(rèn)定為安全性的生物，其表達(dá)產(chǎn)物不需經(jīng)過(guò)大量宿主安全性實(shí)驗(yàn)。釀酒酵母作為一種模式生物，是亦今了解最完全的真核生物，上千個(gè)基因已被分析，自從釀酒酵母表達(dá)人干擾素成功以后，人們還用釀酒酵母表達(dá)了多種原核和真核蛋白。作為一種單細(xì)胞真核生物，它表達(dá)外源基因時(shí)具有一定的翻譯后加工能力，具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，有利于保護(hù)生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性。但是釀酒酵母本身含有耐熱SOD的野生菌株還未被篩選。
耐高溫酵母菌能減少發(fā)酵生產(chǎn)中由于降溫所帶來(lái)的麻煩和費(fèi)用，保證工業(yè)發(fā)酵能在高溫下正常進(jìn)行，因此，圍繞耐高溫酵母菌的篩選成為研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，已有多株人工選育的耐高溫酵母菌投入到生產(chǎn)中，并取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。目前，耐高溫酵母菌的選育主要集中在自然篩選和高溫馴化，使耐高溫酵母菌的研究取得了顯著進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株。本發(fā)明提供的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 菌株 TY-SC-2-2013.1.1，其保藏號(hào)為 CGMCC N0.7249。上述的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 菌株 TY-SC-2-2013.1.1 在制備 SOD中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述SOD為耐高溫酶，具體可耐100°C，即在100°C水浴保溫lh，仍保留77.89%的酶活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備SOD的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:發(fā)酵上述的釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到S0D。上述方法中，所述發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基為酵母培養(yǎng)基，其中酵母培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖、麥芽糖、棉籽糖、蔗糖或淀粉；所述碳源在所述酵母培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分含量為2% ；上述方法中，所述碳源為棉籽糖。

上述碳源為棉籽糖的酵母培養(yǎng)基按照如下方法制備:向濃度為8g/L的不含碳源的酵母培養(yǎng)基中加入U(xiǎn)ra和棉籽糖，用水補(bǔ)足體積，得到碳源為棉籽糖的酵母培養(yǎng)基，其中Ura在碳源為棉籽糖的酵母培養(yǎng)基中的終濃度為0.01% (質(zhì)量百分含量)，棉籽糖在碳源為棉籽糖的酵母培養(yǎng)基的終濃度為2% (質(zhì)量百分含量)。上述方法中，所述發(fā)酵方式如下:30°C培養(yǎng)8-48h、且每隔12h，補(bǔ)加一次所述碳源，使所述碳源在發(fā)酵體系中的質(zhì)量百分含量為1%_2%。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述發(fā)酵方式如下:30°C培養(yǎng)48h、且每隔12h，補(bǔ)加一次碳源，使碳源在發(fā)酵體系中的質(zhì)量百分含量為2%。在本發(fā)明的實(shí)施例中，碳源為棉籽糖。上述方法中，在收集發(fā)酵產(chǎn)物后，還包括如下步驟:將所述發(fā)酵產(chǎn)物依次經(jīng)離心收集菌體沉淀、懸浮所述菌體沉淀得到懸浮液、破碎所述懸浮液、再次離心懸浮液收集上清液，得到S0D。具體為810g的速度離心收集菌體、以pH7.0濃度為50mmol/L的磷酸緩沖液重懸菌體、用超聲波破碎儀破碎(功率162.5W、超聲時(shí)間30min ;間接超聲，間接超聲是超2s，停3s，總共超聲的時(shí)間為30min。)，2260g離心25min，收集上清液得到S0D。由上述方法制備的SOD也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述SOD為耐高溫酶。TY-SC-2-2013.1.1 菌株，分類命名為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),于2013年2月I日，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJi址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，菌種保藏號(hào)為=CGMCC N0.7249。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):1)本發(fā)明篩選出一種釀酒酵母，其可直接表達(dá)出食品級(jí)的耐熱超氧化物歧化酶產(chǎn)物，彌補(bǔ)了耐高溫酵母菌能減少發(fā)酵生產(chǎn)中由于降溫所帶來(lái)的麻煩和費(fèi)用，保證工業(yè)發(fā)酵能在高溫下正常進(jìn)行和釀酒酵母本身含有耐熱SOD的野生菌株還未被篩選的不足；2)若將本發(fā)明應(yīng)用于工業(yè)化SOD生產(chǎn)，產(chǎn)物可不經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的純化工藝而直接應(yīng)用于食品，保健品以及化妝品等領(lǐng)域，也可直接應(yīng)用于食品發(fā)酵，用于生產(chǎn)功能食品；3)本發(fā)明通過(guò)該釀酒酵母獲得的SOD酶是一種高耐溫酶，具有化學(xué)催化劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，尤其是在高溫條件下保持極好的穩(wěn)定性，克服了中溫酶(20°C 5°C)及低溫酶(2°C 20°C)在應(yīng)用過(guò)程中出現(xiàn)的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定現(xiàn)象，從而使很多高溫化學(xué)反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)，從而將極大地促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展；4)本發(fā)明的方法還具有原料生物體生長(zhǎng)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，成本低廉，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景和實(shí)際意義。


圖1為菌株TY-SC-2-2013.1.1的生物量的結(jié)果
圖2為菌株TY-SC-2-2013.1.1的SOD酶活結(jié)果
圖3為TY-SC-2-2013.1.1提取的SOD酶純化后的溫度穩(wěn)定性
圖4為TY-SC-2-2013.1.1提取的SOD酶純化后常溫保存酶活變化趨勢(shì)
圖5為TY-SC-2-2013.1.1提取的SOD酶純化后pH值對(duì)其酶活性的影響具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1、耐熱超氧化物歧化酶釀酒酵母菌株的分離、篩選及鑒定
一、耐熱超氧化物歧化酶釀酒酵母菌株TY-SC-2-2013.1.1的分離、篩選
1、耐熱超氧化物歧化酶釀酒酵母菌株的分離
I) 土壤的采集處理
從河北保定酒廠采集酒曲、窖泥和酒醅樣品共18個(gè)，置于無(wú)菌紙袋，并標(biāo)明采取地點(diǎn)、日期。將其運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后至于冰箱中保存 ，備用。
將采回的樣品用四分法獲取樣品20_30g，將其置于研缽中研磨均勻。
2)菌種的分離:
分別稱取Ig采集的樣品，加入到已滅菌的裝有50mL富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于30°C恒溫、搖床160r/min條件下培養(yǎng)24h,再取培養(yǎng)液2mL進(jìn)行同條件的傳代培養(yǎng)，每24h接種傳代一次，3次后，可供平板分離。
富集后的酵母菌液連續(xù)用無(wú)菌水稀釋為10_\10_2、……、10_7，分別取稀釋度為10_4、10_5、10_6、IO-7的菌液各0.5mL (每個(gè)稀釋度取樣兩個(gè))，用無(wú)菌涂布棒分別涂于8個(gè)分離培養(yǎng)基平板上，置于30°C恒溫箱中培養(yǎng)24h，分離得到酵母菌。
為了在篩選過(guò)程中排除細(xì)菌的干擾，在培養(yǎng)基中加30ug/ml的鏈霉素或者IOOmg/L的氯霉素。
觀察并記錄菌落顏色與形態(tài)，然后在顯微觀察記錄細(xì)胞大小、形態(tài)，進(jìn)行分析和初步的歸類。
選取菌落形態(tài)如下的酵母菌:酵母菌的菌落較濕潤(rùn)透明，表面光滑，容易挑取，菌落質(zhì)地均勻，正反面以及邊緣與中間的顏色較一致；菌落顏色比較單調(diào)，多以乳白色或礦燭色為主。上述富集培養(yǎng)基可以為如下PDA培養(yǎng)基或YEH)培養(yǎng)基:(I) PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯300g，加水煮沸10 20min，過(guò)濾加入葡萄糖200g，加水至1L。滅菌。(2)YEro培養(yǎng)基:葡萄糖20g、蛋白胨20g、牛肉膏 10g、瓊脂20g、水1000ml。YEPD液體培養(yǎng)基:酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L，固體培養(yǎng)基可加入2%瓊脂。2、釀酒酵母篩選I)釀酒酵母的無(wú)性繁殖方式篩選將上述I分離得到的酵母菌觀察形態(tài)特征:酵母菌為卵圓形，以單端出芽方式進(jìn)行繁殖；然后在25°C產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，選取有子囊孢子產(chǎn)生，孢子呈卵圓形的酵母菌。2)釀酒酵母初篩初篩培養(yǎng)基由下層培養(yǎng)基和上層培養(yǎng)基構(gòu)成；下層培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.1、KH2PO4L O、牛肉膏蛋白胨2.0、酵母粉1.5、無(wú)水MgSO40.4、檸檬酸0.27、瓊脂20.0 ;上層培養(yǎng)基(g/L): 2, 3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.3、葡萄糖30.0、瓊脂20.0。在初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)上述I)篩選的酵母菌，在菌落上覆蓋一層TTC顯色劑，TTC顯現(xiàn)不同的顏色，產(chǎn)乙 醇能力強(qiáng)的酵母會(huì)顯現(xiàn)深紅色，次之顯粉紅色，微紅色的或者不顯色的為野生酵母。選取顯現(xiàn)深紅色的酵母菌。3 ) WL瓊脂培養(yǎng)基復(fù)篩釀酒酵母WL瓊脂培養(yǎng)基(％質(zhì)量分?jǐn)?shù)):酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，瓊脂2，磷酸二氫鉀0.055,氯化鉀0.0425,氯化鈣0.0125,氯化鐵0.00025,硫酸鎂0.0125,硫酸錳
0.00025，溴甲酚綠 0.0022，ρΗ6.5，121°C滅菌 20min ；將上述2)篩選得到的酵母菌接種液體培養(yǎng)基活化24h后接種到WL瓊脂培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)5d后觀察，篩選出具有如下形態(tài)的酵母菌:菌落顏色為奶油色(淺黃色)至綠色，表面為球形突起，光滑，不透明，奶油狀的菌株。3、賴氨酸培養(yǎng)基篩選鑒定 賴氨酸培養(yǎng)基成分(L—1 ):D-葡萄糖10g，L-組氨酸lmg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg,對(duì)一氨基苯甲酸200 μ g,生物素20 μ g,葉酸2 μ g,肌醇IOmg,煙酸400 μ g,泛酸2mg,鹽酸吡哆醇400 μ g，核黃素200 μ g，鹽酸硫胺素400 μ g，硼酸500 μ g，結(jié)晶氯化銅40 μ g，碘化鉀100 μ g，結(jié)晶氯化鐵200 μ g，結(jié)晶硫酸錳400 μ g，結(jié)晶鑰酸鈉200 μ g，結(jié)晶硫酸鋅400 μ g,磷酸二氫鉀850mg,磷酸氫二鉀150mg,結(jié)晶硫酸鎂500mg,氯化鈉IOOmg,結(jié)晶氯化鈣lOOmg，賴氨酸鹽酸鹽2.5g，瓊脂20g, pH自然，121°C滅菌20min ；釀酒酵母不能采用賴氨酸作為酵母氮源，因而在賴氨酸培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。將上述2的3)得到的酵母菌(經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩的菌株)接種于YPD液體培養(yǎng)基活化24h后，按照1%接種量接種到5mL無(wú)菌水中進(jìn)行饑餓處理，7d后接種到賴氨酸培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)5d后觀察是否有酵母生長(zhǎng)，培養(yǎng)48h后沒(méi)有菌落出現(xiàn)的繼續(xù)培養(yǎng)，直到15d后仍無(wú)菌落生長(zhǎng)說(shuō)明是釀酒酵母。
經(jīng)賴氨酸培養(yǎng)基篩選鑒定，得到了 25株具有典型釀酒酵母特征的菌株編號(hào)TY-SC-1 25。
4、耐高溫酒精酵母菌的篩選
將分離得到的25株釀酒酵母菌涂布于固體培養(yǎng)基(配方見(jiàn)初篩培養(yǎng)基)上，于38°C下培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，倒入一層TTC上層培養(yǎng)基(配方見(jiàn)初篩培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)3h。
培養(yǎng)結(jié)束后挑選16株長(zhǎng)勢(shì)好、紅色較深的菌落備用。TTC可以和細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的甲月贊，由此可判斷酵母細(xì)胞中呼吸酶活力的大小，即酵母廣酒精能力的聞低。
利用產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌能還原三苯基四氮唑鹽酸鹽(TTC)變?yōu)樯罴t色這一特性，篩選深紅色釀酒酵母菌落。
將深紅色釀酒酵母菌落接種至YEro液體培養(yǎng)基，分別于34°C、36°C、38°C、40°C、42°C、46°C下培養(yǎng)，根據(jù)其生長(zhǎng)情況選出9株耐高溫特性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn):TY-SC-1、TY-SC-2-2013.1.1、TY-SC-5、TY-SC-8、TY-SC-12、TY-SC-13、TY-SC-15、TY-SC-18、TY-SC-22。
表I為酵母菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況
權(quán)利要求
1.釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 菌株 TY-SC-2-2013.1.1，其保藏號(hào)為 CGMCCN0.7249。
2.權(quán)利要求1所述的釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1在制備SOD中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述SOD為耐高溫酶。
4.一種制備SOD的方法，包括如下步驟:發(fā)酵權(quán)利要求1所述的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 菌株 TY-SC-2-2013.1.1,收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到 SOD。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基為酵母培養(yǎng)基，其中酵母培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖、麥芽糖、棉籽糖、蔗糖或淀粉；所述碳源在所述酵母培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分含量為2%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述碳源為棉籽糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述發(fā)酵方式如下:30°C培養(yǎng)8-48h、且每隔12h，補(bǔ)加一次所述碳源，使所述碳源在發(fā)酵體系中的質(zhì)量百分含量為1%_2%。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于:在收集發(fā)酵產(chǎn)物后，還包括如下步驟:將所述發(fā)酵產(chǎn)物依次經(jīng)離心收集菌體沉淀、懸浮所述菌體沉淀得到懸浮液、破碎所述懸浮液、再次離心懸浮液收集上清液，得到SOD。
9.由權(quán)利要求4-8中任一所述方法制備的SOD。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的S0D，其特征在于:所述SOD為耐高溫酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種釀酒酵母菌株及其在制備耐熱超氧化物歧化酶中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，其保藏號(hào)為CGMCC No.7249。本發(fā)明還提供了一種制備SOD的方法，包括如下步驟發(fā)酵上述的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株TY-SC-2-2013.1.1，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到SOD。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明篩選出一種釀酒酵母，其可直接表達(dá)出食品級(jí)的耐熱超氧化物歧化酶產(chǎn)物，彌補(bǔ)了耐高溫酵母菌能減少發(fā)酵生產(chǎn)中由于降溫所帶來(lái)的麻煩和費(fèi)用。
文檔編號(hào)C12N1/18GK103160444SQ201310103919
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者左德全, 姜廣, 董亮, 蔣峰臣 申請(qǐng)人:北京奇化美生物科技有限公司