本發(fā)明屬于腫瘤細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，具體涉及一種重組CAR基因及其載體、CAR-T細(xì)胞和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：B淋巴細(xì)胞腫瘤包含多種惡性腫瘤，如大多數(shù)的非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病。目前對(duì)B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤的治療包括化學(xué)治療，放射治療，骨髓移植和外周血干細(xì)胞移植。盡管治療方法多種多樣，但還是有很多病人無法被治愈。例如，B淋巴系急性白血病對(duì)化學(xué)治療較敏感，但是無法根除，大約65％的成人和20％的兒童會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)。到目前為止，人們只能通過加強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒性來提高其敏感性，但同時(shí)也增加了死亡率。雖然利用來自異體供體的白細(xì)胞進(jìn)行的過繼性免疫療法能較強(qiáng)地殺傷白血病細(xì)胞，但由于B淋巴系急性白血病的持久緩解率不足10％，以及移植物抗宿主反應(yīng)引起的高死亡率，使得這種免疫療法主要局限于髓系白血病的治療。此外，隨著腫瘤病情的惡化，患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，機(jī)體的抗腫瘤免疫功能容易失去平衡。專職抗原提呈細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞的功能往往受到不同程度的損害，造成抗原提呈激活T細(xì)胞的效率降低，導(dǎo)致攻擊腫瘤細(xì)胞能力不夠，靶向性也不夠精準(zhǔn)；并且，腫瘤細(xì)胞通過低表達(dá)或不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)基因的分子逃逸機(jī)制，能夠逃脫免疫細(xì)胞的攻擊。這就需要一種在抗腫瘤作用中，不僅能夠克服MHC介導(dǎo)的細(xì)胞免疫機(jī)制缺損，同時(shí)具備較強(qiáng)特異性殺傷能力并能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞具有精準(zhǔn)的靶向性的免疫療法。于是，通過嵌合抗原受體設(shè)計(jì)的細(xì)胞免疫療法CAR-T應(yīng)運(yùn)而生。CAR-T，全稱是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，和其它免疫療法類似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫細(xì)胞來清除癌細(xì)胞。嵌合抗原受體(CAR)由胞外抗原結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成。CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)是指通過將上述CAR結(jié)構(gòu)在體外進(jìn)行基因重組得到重組質(zhì)粒再在體外將其導(dǎo)入到患者的T細(xì)胞內(nèi)，從而獲得能夠表達(dá)上述嵌合抗原受體的CAR-T細(xì)胞，然后經(jīng)過純化和體外大規(guī)模擴(kuò)增后，再將上述CAR-T細(xì)胞輸回患者體內(nèi)行使殺滅腫瘤細(xì)胞的功能。CAR-T能將T細(xì)胞的生理功能和在非MHC限制性方式下識(shí)別表面抗原的能力結(jié)合起來。這些受體不依賴抗原加工就能識(shí)別完整的膜蛋白。典型的CAR編碼的胞外域能結(jié)合含有激活T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)域的腫瘤或者病毒。原則上，一般的打靶載體的單鏈可變區(qū)片段(scFv)能結(jié)合細(xì)胞表面抗原決定簇并且不發(fā)生MHC限制性。CAR-T細(xì)胞療法通過外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，把識(shí)別腫瘤相關(guān)特異性抗原的單鏈抗體片段(single-chainantibodyfragment，scFv)和T細(xì)胞活化序列的融合蛋白表達(dá)到T細(xì)胞表面，這樣scFv通過跨膜區(qū)與T細(xì)胞胞內(nèi)的活化增殖信號(hào)域偶聯(lián)，經(jīng)回輸患者體內(nèi)后大量擴(kuò)增，能夠以非MHC限制性的模式表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤作用。在信號(hào)傳導(dǎo)的過程中，TCRζ發(fā)揮著重要的作用，TCRζ鏈?zhǔn)荰細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵分子,TCRζ鏈表達(dá)下調(diào)不僅影響TCR在細(xì)胞表面的表達(dá)和循環(huán)T細(xì)胞陽性信號(hào)的數(shù)量，而且還會(huì)影響T細(xì)胞的活化和增殖，最終可以導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的異常。然而，關(guān)于CAR，要解決的問題是信號(hào)通過胞質(zhì)內(nèi)scFv-TCRζ單一鏈結(jié)構(gòu)域時(shí)不能完全復(fù)制多鏈的TCR信號(hào)復(fù)合體。承接TCRζ信號(hào)分子的嵌合受體足夠能在雜交和克隆的T細(xì)胞里持續(xù)擴(kuò)散，但不足以引起外周T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)能夠增加T細(xì)胞功能和增殖的CAR基因。中國專利201510233748.0公開了一種嵌和抗原受體hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途。所述的嵌合抗原受體由抗人CD19單克隆抗體HI19a輕鏈和重鏈可變區(qū)hCD19scFv、人CD8α鉸鏈區(qū)、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、以及人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。該發(fā)明利用基因工程技術(shù)獲得編碼嵌合抗原受體hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ的融合基因，將該基因片段插入慢病毒表達(dá)載體，包裝成慢病毒，感染人T細(xì)胞，使T細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。這種嵌合抗原受體T細(xì)胞能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的CD19，特異性殺傷CD19陽性的腫瘤細(xì)胞，用于腫瘤的治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有CAR-T細(xì)胞治療中T細(xì)胞活化、增殖能力不足的問題，提供一種重組CAR基因及其載體、CAR-T細(xì)胞。使用所述的重組CAR基因及含有該重組CAR基因的載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的效率較高，且經(jīng)轉(zhuǎn)染后的陽性T細(xì)胞具有較好的增殖能力。此外，本發(fā)明所述的重組CAR基因?qū)細(xì)胞腫瘤抗原的特異性高，促使CAR-T特異性地殺傷B細(xì)胞腫瘤。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案以實(shí)現(xiàn)上述目的：本發(fā)明提供一種重組CAR基因，所述的重組CAR基因包含編碼如下部分的核酸序列：CD19抗體的抗原結(jié)合部分，跨膜部分以及以任意順序連接的CD28胞漿功能區(qū)、41BB胞漿功能區(qū)和CD3zeta胞漿功能區(qū)。進(jìn)一步地，所述的CD19抗體的抗原結(jié)合部分選自scFv、Fab、Fab’或F(ab’)2；所述的跨膜部分選自CD8分子的跨膜部分、CD28分子的跨膜部分、41BB分子的跨膜部分或CD3zeta分子的跨膜部分。優(yōu)選地，所述的CD19抗體的抗原結(jié)合部分選自scFV，scFV的核酸序列包含或由SEQIDNO:1組成；所述的跨膜部分選自CD8分子的跨膜部分，CD8分子的跨膜部分的核酸序列包含或由SEQIDNO:3組成。所述SEQIDNO:3具體為：進(jìn)一步地，所述的CD28胞漿功能區(qū)的核酸序列包含或由SEQIDNO:4組成，所述SEQIDNO:4具體為：所述的41BB胞漿功能區(qū)的核酸序列包含或由SEQIDNO:5組成，所述SEQIDNO:5具體為：所述的CD3zeta胞漿功能區(qū)的核酸序列包含或由SEQIDNO:6組成，所述SEQIDNO:6具體為：進(jìn)一步地，所述的重組CAR基因由如下順序連接的部分組成：CD19抗體的抗原結(jié)合部分-跨膜部分-CD28胞漿功能區(qū)-41BB胞漿功能區(qū)-CD3zeta胞漿功能區(qū)，任意地在CD19抗體的抗原結(jié)合部分和跨膜部分之間存在接頭或用于純化的部分。進(jìn)一步地，所述的接頭或用于純化的部分為IgGFc，所述的IgGFc的核酸序列包含或由SEQIDNO:2組成，所述SEQIDNO:2具體為：進(jìn)一步地，所述的重組CAR基因的核酸序列包含或由SEQIDNO:7組成，所述SEQIDNO:7具體為：CD19是位于B淋巴細(xì)胞上的一種95kDa的糖蛋白，在B細(xì)胞早期生成到分化為漿細(xì)胞的過程中都一直存在。CD19是免疫球蛋白超家族的一員，同時(shí)又是細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體的一個(gè)組分，這種細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體可以通過B細(xì)胞表面受體調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD19幾乎表達(dá)于所有的B細(xì)胞腫瘤表面，而其他實(shí)質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞幾乎不表達(dá)，因此，將CD19作為靶基因可以減少自身免疫和骨髓毒性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明利用CD19抗體抗原結(jié)合部分構(gòu)建的重組CAR表達(dá)于T細(xì)胞表面，可特異性地殺傷CD19陽性的腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明中，抗原結(jié)合部分具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含義，是指能夠特異性結(jié)合靶抗原的部分。例如，抗體的“抗原結(jié)合部分”可以通過重組DNA技術(shù)或者通過酶或化學(xué)切割完整的抗體而產(chǎn)生，包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和單鏈抗體(scFv)。抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體及可以是標(biāo)記的抗體以及所述抗體的片段、變體或衍生物?？贵w標(biāo)記可以是放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或者生物素基團(tuán)標(biāo)記?？贵w或其片段其制備及使用是熟知的并且公開在例如Harlow，E.andLane，D.，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1999。本發(fā)明所述的CD19抗體抗原結(jié)合部分選自抗原結(jié)合片段Fab、Fab’和F(ab’)2、Fv或單鏈抗體(scFv)，優(yōu)選地，所述的CD19抗體抗原結(jié)合部分是CD19單鏈抗體(scFv)，所述的scFv包含或由SEQIDNO:1所示的核酸序列編碼的氨基酸序列組成，所述編碼scFv的核酸序列包含或由SEQIDNO:1組成，所述SEQIDNO:1具體為：在本發(fā)明中，術(shù)語“跨膜部分”和“跨膜區(qū)”可互換使用，具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含義，指跨膜蛋白中連接蛋白的胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的部分，其跨越細(xì)胞膜，通常為α-螺旋結(jié)構(gòu)，約20～25個(gè)氨基酸殘基。構(gòu)成蛋白質(zhì)跨膜部分的氨基酸大部分是疏水性氨基酸?？捎糜诒景l(fā)明CAR重組基因的跨膜部分選自CD分子的跨膜部分，例如：CD19分子的跨膜部分、CD8分子的跨膜部分、CD28分子的跨膜部分、41BB分子的跨膜部分和CD3zeta分子的跨膜部分。優(yōu)選地，本發(fā)明CAR重組基因的跨膜部分是CD8分子的跨膜部分，所述的CD8分子的跨膜部分包含或由SEQIDNO:3所示的核酸序列編碼的氨基酸序列組成，所述編碼CD8分子的跨膜部分的核酸序列包含或由SEQIDNO:3組成。CD28分子能夠與B7結(jié)合后產(chǎn)生的共刺激信號(hào)(第二信號(hào))在免疫應(yīng)答T細(xì)胞激活中起重要作用。CD28分子的胞漿功能區(qū)帶有免疫受體酪氨酸活化基序(Immunereceptortyrosinebasedactivationmotifs，ITAM)，ITAM的保守序列的酪氨酸殘基磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scrhomology2)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶，進(jìn)而傳導(dǎo)胞外刺激信號(hào)，參與傳遞T細(xì)胞活化的第二信號(hào)。本發(fā)明所述CD28胞漿功能區(qū)是指包含所述ITAM基序并能夠結(jié)合B7產(chǎn)生共刺激信號(hào)的CD28分子胞漿區(qū)的全部或其一部分。優(yōu)選地，所述CD28分子的胞漿功能區(qū)包含或由SEQIDNO:4所示核酸序列編碼的氨基酸序列組成，所述編碼CD28分子的胞漿功能區(qū)的核酸序列包含或由SEQIDNO:4組成。41BB分子是腫瘤壞死因子受體(Tumornecrosisfactorreceptor，TNFR)超家族的成員，是除CD28/B7之外的另一重要的介導(dǎo)T細(xì)胞活化的共刺激分子。主要分布在活化的CD4陽性T細(xì)胞、CD8陽性T細(xì)胞和NK細(xì)胞表面。41BB分子的胞漿功能區(qū)含有5個(gè)氨基酸的保守序列，可介導(dǎo)T細(xì)胞活化的第二信號(hào)。本發(fā)明所述41BB分子的胞漿功能區(qū)是指能夠介導(dǎo)T細(xì)胞活化的41BB分子胞漿區(qū)的全部或一部分。優(yōu)選地，所述41BB分子的胞漿功能區(qū)包含或由SEQIDNO:5所示核酸序列編碼的氨基酸組成，所述編碼41BB分子的胞漿功能區(qū)的核酸序列包含或由SEQIDNO:5組成。CD3zeta分子是一種T細(xì)胞刺激因子，也是T細(xì)胞共受體復(fù)合物的成員之一。CD3胞質(zhì)段含三個(gè)ITAM，可引發(fā)T細(xì)胞的分裂和細(xì)胞因子的釋放。本發(fā)明所述CD3zeta分子的胞漿功能區(qū)是指包含所述3個(gè)ITAM并可引發(fā)T細(xì)胞分裂和細(xì)胞因子釋放的CD3zeta分子胞漿區(qū)的全部或一部分。優(yōu)選地，所述CD3zeta分子的胞漿功能區(qū)包含或由SEQIDNO:6所示核酸序列編碼的氨基酸組成，所述編碼CD3zeta分子的胞漿功能區(qū)的核酸序列包含或由SEQIDNO:6組成。在本發(fā)明CAR重組基因中，CD28胞漿功能區(qū)、41BB胞漿功能區(qū)和CD3zeta胞漿功能區(qū)可以任意順序連接，例如(i)CD28胞漿功能區(qū)-41BB胞漿功能區(qū)-CD3zeta胞漿功能區(qū)；(ii)CD28胞漿功能區(qū)-CD3zeta胞漿功能區(qū)-41BB胞漿功能區(qū)；(iii)CD3zeta胞漿功能區(qū)-CD28胞漿功能區(qū)-41BB胞漿功能區(qū)；(iv)CD3zeta胞漿功能區(qū)-41BB胞漿功能區(qū)-CD28胞漿功能區(qū)；(v)41BB胞漿功能區(qū)-CD28胞漿功能區(qū)-CD3zeta胞漿功能區(qū)；或(vi)41BB胞漿功能區(qū)-CD3zeta胞漿功能區(qū)-CD28胞漿功能區(qū)。優(yōu)選地，所述胞漿功能區(qū)以CD28胞漿功能區(qū)-41BB胞漿功能區(qū)-CD3zeta胞漿功能區(qū)的順序連接。進(jìn)一步地，本發(fā)明CAR重組基因包含編碼接頭或用于純化的部分的核酸序列，所述接頭或用于純化的部分可以為本領(lǐng)域已知的任何可用的接頭或純化部分。優(yōu)選地，所述用于純化的部分是IgGFc，所述的IgGFc包含或由SEQIDNO:2所示核酸序列編碼的氨基酸序列組成，所述編碼IgGFc的核酸序列包含或由SEQIDNO:2組成。進(jìn)一步地，本發(fā)明CAR重組基因包含或由以下順序連接部分的核苷酸序列組成：CD19scFv-IgGFc-CD8跨膜部分-CD28胞漿功能區(qū)-41BB胞漿功能區(qū)-CD3zeta胞漿功能區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明CAR重組基因的核酸序列包含或由SEQIDNO:7組成。在另一方面，本發(fā)明還提供用本發(fā)明所述的CAR重組基因轉(zhuǎn)化得到的載體。所述的載體包括表達(dá)載體、質(zhì)粒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。如本文所用，“表達(dá)載體”是重組或者合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列指定核酸元件，所述核酸元件允許特定核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，例如，表達(dá)載體除了編碼要表達(dá)的核酸序列以外還可包括衍生自與用于表達(dá)的宿主相容的復(fù)制和控制序列以及賦予轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可選擇表型的選擇標(biāo)記。本發(fā)明CAR重組基因可以被摻入質(zhì)粒、病毒例如慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。本發(fā)明的載體可以是慢病毒質(zhì)粒載體，如pLent-EF1a，見圖6，也可以是慢病毒載體，如山東維真生物科技有限公司的LT88001載體，見圖7。在另一方面，本發(fā)明提供了一種T細(xì)胞，所述的T細(xì)胞用本發(fā)明CAR重組基因或包含所述CAR重組基因的載體轉(zhuǎn)化。所述的用載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如可參見Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001))所述。在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療B淋巴細(xì)胞來源腫瘤的方法，包括給需要其的患者施用本發(fā)明的CAR重組基因或包含所述CAR重組基因的載體轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞的步驟。具體地，所述方法可以包括如下步驟：(1)獲得患者的T細(xì)胞；(2)用本發(fā)明的CAR重組基因或包含所述CAR重組基因的載體轉(zhuǎn)化T細(xì)胞，任選擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞，例如至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天；以及(3)將轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞回輸給患者體內(nèi)。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明CAR重組基因、包含所述CAR重組基因的載體、或用所述CAR重組基因或包含所述CAR重組基因的載體轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞在制備用于治療B淋巴細(xì)胞來源腫瘤的藥物或試劑盒中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供了用于治療B淋巴細(xì)胞來源腫瘤的藥物組合物或試劑盒，其包含本發(fā)明的CAR重組基因、包含所述CAR重組基因的載體、或用所述CAR重組基因或包含所述CAR重組基因的載體轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞，任選包含藥物可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述B淋巴細(xì)胞來源腫瘤包含多種惡性腫瘤，如大多數(shù)的非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病和急性髓性白血病。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的重組CAR基因，以及包含所述重組CAR基因的載體和用所述重組CAR基因或包含所述重組CAR基因的載體轉(zhuǎn)化得到的T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞腫瘤抗原的特異性高，可以減少自身免疫和骨髓毒性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。將所述的重組CAR基因通過AsisI/NsiI雙酶切連入慢病毒質(zhì)粒載體pLent-EF1a中，構(gòu)建CART-19scFv質(zhì)粒，利用該質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝和純化，通過慢病毒載體技術(shù)將重組CAR基因表達(dá)于患者T細(xì)胞，所述的CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率較高，可達(dá)到30％，且經(jīng)轉(zhuǎn)染后的陽性T細(xì)胞具有較好的增殖能力，經(jīng)體外2周擴(kuò)增后，CD3陽性T細(xì)胞增加14.2％，CD8陽性T細(xì)胞增加29.1％。附圖說明圖1為淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增結(jié)果圖。圖2為流式細(xì)胞儀顯示CD3陽性T細(xì)胞擴(kuò)增前、后的結(jié)果圖，通過流式細(xì)胞儀分析可見，擴(kuò)增之前的CD3陽性T細(xì)胞比例為55.8％+16.8％，共約72.7％；擴(kuò)增之后的CD3陽性T細(xì)胞比例為30.4％+56.2％，共約86.9％。圖3為流式細(xì)胞儀顯示CD8陽性T細(xì)胞擴(kuò)增前、后的結(jié)果圖，通過流式細(xì)胞儀分析可見，擴(kuò)增之前的CD8陽性T細(xì)胞比例為13.8％；擴(kuò)增之后的CD8陽性T細(xì)胞比例為42.9％。圖4為慢病毒感染原代培養(yǎng)的T細(xì)胞的結(jié)果圖，左圖為藍(lán)色激發(fā)光下的熒光圖，右圖為同一視野下的明視場(chǎng)圖，左圖中綠色熒光的細(xì)胞為被慢病毒感染的細(xì)胞，感染效率約為30％。圖5為CART-19scFv質(zhì)粒載體圖譜。圖6為pLent-EF1a質(zhì)粒載體圖譜。圖7為慢病毒載體LT88001。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1CART-19scFv質(zhì)粒的構(gòu)建CART-19scFv質(zhì)粒的獲得方法為：將重組CAR基因(SEQIDNO:7)全序列合成，通過AsisI/NsiI雙酶切連入慢病毒質(zhì)粒載體pLent-EF1a中。構(gòu)建所得的CART-19scFv質(zhì)粒及pLent-EF1a的質(zhì)粒圖譜見圖5和圖6。實(shí)施例2T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染將構(gòu)建的CART-19scFv質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝和純化，進(jìn)而使用慢病毒載體技術(shù)(參考文獻(xiàn)：TumainiB,LeeDW,LinT,CastielloL,etal.Simplifiedprocessfortheproductionofanti-CD19-CARengineeredTcells.Cytotherapy.2013；15(11):1406-1415.)將重組CAR(SEQIDNO:7)基因表達(dá)于患者T細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)陽性率，結(jié)果見圖4，由圖4可知，慢病毒感染T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率約為30％。實(shí)施例3轉(zhuǎn)染后T淋巴細(xì)胞的體外增殖能力檢測(cè)將轉(zhuǎn)染后的T淋巴細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)在體外擴(kuò)增2周，結(jié)果見圖1。并使用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3陽性T細(xì)胞和CD8陽性T細(xì)胞擴(kuò)增前、后的比例，結(jié)果分別見圖2和圖3。由圖2可知，擴(kuò)增之前的CD3陽性T細(xì)胞比例為55.8％+16.8％，共約72.7％；擴(kuò)增之后的CD3陽性T細(xì)胞比例為30.4％+56.2％，共約86.9％，與擴(kuò)增前比較，體外擴(kuò)增2周后，CD3陽性T細(xì)胞增加14.2％。由圖3可知，擴(kuò)增之前的CD8陽性T細(xì)胞比例為13.8％；擴(kuò)增之后的CD8陽性T細(xì)胞比例為42.9％，與擴(kuò)增前比較，體外擴(kuò)增2周后，CD8陽性T細(xì)胞增加29.1％。實(shí)施例4本發(fā)明CAR-T細(xì)胞對(duì)CD19陽性的惡性淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用CD19陽性惡性淋巴瘤細(xì)胞Raji、Rec-1、Ramos和Maver-1細(xì)胞均購自美國ATCC公司。用CFSE標(biāo)記上述4種腫瘤細(xì)胞，向每孔中分別加入CAR-T細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的數(shù)量比為5:1，將CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)12h后，收集細(xì)胞，加入7-ADD抗體進(jìn)行流式檢測(cè)Raji、Rec-1、Ramos和Maver-1細(xì)胞的比例變化，結(jié)果見下表1。表1CAR-T細(xì)胞對(duì)CD19陽性的惡性淋巴瘤細(xì)胞的殺傷效果惡性淋巴瘤細(xì)胞種類殺傷率(％)Raji62Rec-176Ramos65Maver-178結(jié)果顯示，含有本發(fā)明重組CAR基因的CAR-T細(xì)胞可特異性識(shí)別CD19腫瘤抗原，對(duì)CD19陽性的惡性淋巴瘤細(xì)胞，如Raji、Rec-1、Ramos和Maver-1細(xì)胞，均具有較強(qiáng)的殺傷效率，達(dá)到60％以上，顯示出在細(xì)胞免疫治療腫瘤中巨大的潛力。實(shí)施例5本發(fā)明CAR-T細(xì)胞治療CD19陽性的白血病或淋巴瘤的效果評(píng)價(jià)篩選經(jīng)臨床確診為CD19陽性的白血病或淋巴瘤志愿患者共50例，其中，白血病志愿患者20例，淋巴瘤志愿患者30例。所有志愿患者的年齡≥18歲，預(yù)期壽命＞12周，經(jīng)檢測(cè)，肌酸酐＜2.5mg/dl，ALT/AST＜3×正常值，膽紅素＜2.0mg/dl，并具有足夠的靜脈通路進(jìn)行血漿分離置換法，且對(duì)白細(xì)胞去除術(shù)無其他禁忌癥。志愿患者在注射CAR-T細(xì)胞之前，進(jìn)行5-10天的化療治療?；煹哪康氖菧p少淋巴球以促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的移植成活率及穩(wěn)態(tài)擴(kuò)展，同時(shí)也減少了腫瘤負(fù)荷?；煼桨傅倪x擇將依據(jù)患者的基礎(chǔ)疾病及之前的治療方法。在化療完成后的1-2天給予CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療。使用CAR-T細(xì)胞治療的方案具體為：采集50-100ml志愿患者的外周血于肝素抗凝管中，然后進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞的分離，將患者T細(xì)胞感染包含實(shí)施例1的CAR重組基因的慢病毒并且在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增2周后，得到大約2.5-5×109個(gè)自體T細(xì)胞，然后將得到的CAR-T細(xì)胞回輸給患者體內(nèi)。首次劑量將使用分割劑量執(zhí)行，第0天(10％)，第1天(30％)，第2天(60％)。如可耐受，約10-15min完成輸注。受試者的生命體征和血氧飽和度會(huì)在給藥前，輸注完成后及其后的1h內(nèi)每15min監(jiān)測(cè)一次，直到這些指標(biāo)穩(wěn)定且正常。輸注前及完成輸注后20min將會(huì)各采集一份血樣以確定CAR-T的基線水平。首次輸注前及每次輸注后2小時(shí)需檢測(cè)血鉀和血尿酸值。若患者對(duì)首次劑量耐受且已制備足夠的CAR-T細(xì)胞，將于第11天進(jìn)行CAR-T細(xì)胞的第2次輸注。劑量是2-5×109個(gè)總細(xì)胞數(shù)。輸注后2小時(shí)抽血檢測(cè)血鉀及血尿酸值。輸注CAR-T細(xì)胞后的2-6月受試者將每月返回醫(yī)院一次。在這些研究隨訪中受試者將接受：合并用藥，體格檢查，記錄不良事件，抽血檢驗(yàn)血液學(xué)、生化、CAR-T細(xì)胞的存活率。受試者輸注后2年內(nèi)均會(huì)進(jìn)行季度評(píng)估。在這些研究隨訪過程中受試者將接受:合并用藥，體格檢查，記錄不良事件，抽血檢驗(yàn)血液學(xué)、生化、CAR-T細(xì)胞的存活率。評(píng)價(jià)2年內(nèi)白血病或淋巴瘤志愿患者癥狀緩解的情況，結(jié)果見表2。表2CAR-T細(xì)胞對(duì)CD19陽性白血病或淋巴瘤的治療效果組別例數(shù)癥狀完全緩解的例數(shù)完全緩解(％)白血病201470.0淋巴瘤302273.3結(jié)果顯示，CD19陽性白血病或淋巴瘤志愿患者經(jīng)含有本發(fā)明重組CAR基因的CAR-T細(xì)治療，療效顯著，癥狀完全緩解率高達(dá)70％。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>山東維真生物科技有限公司和麥克利科技有限公司<120>一種重組CAR基因及其載體、CAR-T細(xì)胞和應(yīng)用<130>111<160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>801<212>DNA<213>人工序列<400>1atggacatgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctgctctggctctcaggtgcc60agatgtgagctcgtgctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagg120gtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacag180aaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtc240cctgaccgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtg300cagtctaaagacttggcagactatttctatttctgtcaatataacaggtatccgtacacg360tccggaggggggaccaagctggaaataaaacgtagatctggtggaggcggttcaggcgga420ggtggctctggcggtggcggatcgcaagtgcagctgctcgagtctggggctgagctggtg480aggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctac540tggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttat600cctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccactctgactgca660gacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcg720gtctattcttgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactgg780ggccaagggaccacggtcacc801<210>2<211>681<212>DNA<213>人工序列<400>2gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtc60ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca120tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac180ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac240cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaag300tgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa360gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaag420aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag480tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc540gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg600aacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc660ctctccctgtctccgggtaaa681<210>3<211>63<212>DNA<213>人工序列<400>3atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatc60acc63<210>4<211>123<212>DNA<213>人工序列<400>4aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgcccc60gggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgc120tcc123<210>5<211>126<212>DNA<213>人工序列<400>5aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaa60actactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgt120gaactg126<210>6<211>339<212>DNA<213>人工序列<400>6agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc60tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc120cgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat180gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc240cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc300tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa339<210>7<211>1333<212>DNA<213>人工序列<400>7atggacatgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctgctctggctctcaggtgcc60agatgtgagctcgtgctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagg120gtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacag180aaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtc240cctgaccgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtg300cagtctaaagacttggcagactatttctatttctgtcaatataacaggtatccgtacacg360tccggaggggggaccaagctggaaataaaacgtagatctggtggaggcggttcaggcgga420ggtggctctggcggtggcggatcgcaagtgcagctgctcgagtctggggctgagctggtg480aggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctac540tggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttat600cctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccactctgactgca660gacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcg720gtctattcttgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactgg780ggccaagggaccacggtcaccacgcgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagca840cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc900atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccct960gaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccg1020cgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccag1080gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccccc1140atcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctg1200cccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc1260ttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactac1320aagaccacgcctc1333當(dāng)前第1頁1 2 3