專利名稱：一種人膀胱癌細(xì)胞化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析以及臨床診斷醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供一種人膀胱癌細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤。血尿是膀胱癌患者臨床早期癥狀之一，有肉眼血尿和鏡檢血尿。然而血尿在尿路炎癥以及結(jié)石癥狀下也有發(fā)生，并不是膀胱癌的特異性癥狀。正是由于膀胱癌早期癥狀不明顯，以至于發(fā)現(xiàn)有血尿，患者膀胱腫瘤一般發(fā)展為較大的腫瘤結(jié)節(jié)。尋找特異的膀胱癌診斷方法對早期膀胱癌診斷有重要的臨床應(yīng)用價值。膀胱癌的早期診斷方法有以下幾種I)尿液分析血尿出現(xiàn)后的首先便是進行尿液分析，以便排除是否是由于尿路炎癥引起，并不能確定患者是否患膀胱癌；2)尿脫落細(xì)胞分析對尿沉渣中的尿脫落細(xì)胞進行顯微鏡下觀察，可以鑒別并區(qū)分惡化的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。但靈敏度不高，早期膀胱癌容易被漏檢；3)超聲、CT或者MRI成像觀察對腫瘤的大小和惡化程度可以直接進行圖像觀察，準(zhǔn)確度較前面方法大大提高。盡管近年來成像技術(shù)的不斷進步，靈敏度不斷提高，但對較小的腫瘤觀察仍然不夠，易漏檢；4)膀胱鏡觀察膀胱鏡通過尿路進入膀胱，進行膀胱內(nèi)可視觀察，從而發(fā)現(xiàn)早期的腫瘤。能夠檢出2)、3)中漏檢的大部分患者。目前早期診斷膀胱癌細(xì)胞特異性最高的是通過膀胱鏡的觀察，熒光膀胱鏡的應(yīng)用提高了檢測靈敏度。但患者一般需要臨床跟蹤觀察，從而能及早發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生或復(fù)發(fā)狀況。然而，膀胱鏡觀察會對患者造成身體不適。另外，目前熒光膀胱鏡檢測所需熒光染料特異性不高，且對人體有一定的負(fù)面影響。因此，在膀胱癌的早期診斷方面，人們一直在探索更特異、靈敏的檢測方法，盡可能的利用特異的腫瘤標(biāo)志物實現(xiàn)方便、快速的檢測。實現(xiàn)尿樣中的膀胱癌標(biāo)志物或者細(xì)胞的檢測，進行實時檢測在臨床診斷方面具有重要的應(yīng)用價值。目前商業(yè)化的可用的膀胱癌的標(biāo)志物有人補體因子H相關(guān)蛋白(膀胱腫瘤抗原，BTA試劑盒)、高分子量的癌胚抗原和兩個膀胱癌細(xì)胞相關(guān)的粘附分子(美國Scimedx Corp公司的Immunocyt試劑盒)、核基質(zhì)蛋白22 (NMP22)、3、7和17號染色體的異倍體以及P16腫瘤抑制因子9p21位點的缺失(UroVysion試劑盒)。BTA是指人補充因子H相關(guān)蛋白，BTA檢測需要專業(yè)操作人員在標(biāo)準(zhǔn)實驗室進行，靈敏度達到57-83 %，特異性60-92%，血尿患者的特異性只能達到46%。另外良性前列腺增生、腎結(jié)石以及尿路感染等情況均影響B(tài)TA檢測的特異性；Immunocyt試劑盒通過免疫熒光檢測尿脫落細(xì)胞，盡管靈敏度以及特異性很高，但為了達到較高的準(zhǔn)確性需要進行大量的尿脫落細(xì)胞檢測，因此在膀胱癌病人的治療以及預(yù)后觀測方面具有很高的應(yīng)用價值，但應(yīng)用在早期診斷方面差強人意；其中NMP22是目前應(yīng)用最廣的膀胱癌標(biāo)志物，ELISA試劑盒的市場化實現(xiàn)了膀胱癌早期診斷的方便、快捷檢測，檢測靈敏度和特異性也很高，但是在有病毒感染、腎/膀胱結(jié)石等情況下，仍會出現(xiàn)假陽性；UroVysion試劑盒采用的是多祀標(biāo)的突光原位雜交(FISH)技術(shù)，盡管靈敏度與特異性得到極大提高，美國FDA批準(zhǔn)，但與Immunocyt試劑盒類似，需要檢測大量的尿脫落細(xì)胞。結(jié)合目前的膀胱癌標(biāo)志物的應(yīng)用以及膀胱癌的診斷現(xiàn)狀得出一方面，新的特異的膀胱癌標(biāo)志物仍是研究的重點，制備早期診斷試劑盒，實現(xiàn)快速檢測，在膀胱癌的診斷方面具有重要的臨床價值；另一方面，進行尿樣中的細(xì)胞檢測，避免炎癥、血尿等非特異癥狀的影響，準(zhǔn)確性最高。

發(fā)明內(nèi)容
(一)解決的技術(shù)問題本發(fā)明著眼于膀胱癌的早期診斷與膀胱癌病人的跟蹤觀察，擬解決現(xiàn)行的膀胱癌診斷方面的難題，即采用特異的識別膀胱癌細(xì)胞兩株單克隆抗體，實現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞的雙抗體識別與捕獲，結(jié)合高靈敏的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，定量檢測尿脫落膀胱癌細(xì)胞，不需要昂貴的檢測儀器，便于臨床推廣，具有良好的市場應(yīng)用價值，將會彌補市場現(xiàn)有試劑盒的不足。本發(fā)明的目的是提供一種特異的膀胱癌細(xì)胞捕獲、識別方法，以及高靈敏檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于膀胱癌早期診斷、術(shù)后監(jiān)測的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。(二)技術(shù)方案 本發(fā)明具體提供以下試劑盒[I] 一種用于檢測人膀胱癌細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括兩種特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體。[2]根據(jù)[I]所述的試劑盒，所述試劑盒包括I)膀胱癌EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品；2)由特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體包被的磁顆粒；3)酶標(biāo)記的特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體；4)3)中的酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；5)反應(yīng)管或微孔板，所述反應(yīng)管或微孔板優(yōu)選經(jīng)過無蛋白封閉液的封閉處理，所述無蛋白封閉液為含有1. O %的魚水解明膠，PH7. 2的O. 02M磷酸鹽緩沖液；6)與5)中的反應(yīng)管或微孔板配套的磁分離器。[3]根據(jù)[2]所述的試劑盒，其中所述膀胱癌EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品為膀胱癌EJ細(xì)胞的逐級稀釋液。[4]根據(jù)[2]所述的試劑盒，其中，2)中所述的特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No. 6906的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體BCMab2，其與磁顆粒通過共價鍵結(jié)合。[5]根據(jù)[2]所述的試劑盒，其中，2)中所述的磁顆粒是粒徑為IOOnm至Ιμπι的
氧化硅羥基磁顆粒。[6]根據(jù)[2]所述的試劑盒，其中，3)中所述的酶標(biāo)記的特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體是酶標(biāo)記的BCMabl單克隆抗體,所述BCMabl單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 3845的雜交瘤細(xì)胞株制備(關(guān)于BCMabl單克隆抗體的制備具體可以參見中國專利申請?zhí)?01010251384. 6)。[7]根據(jù)[2]所述的試劑盒，其中，3)中所述的酶是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶。[8]根據(jù)[2]所述的試劑盒，其中，5)中所述的反應(yīng)管是具有光學(xué)透明度的聚苯乙烯管、聚乙烯管、聚丙烯管或者玻璃管；所述微孔板是適用于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的檢測的白色微孔板。本發(fā)明還提供制備所述試劑盒的方法方法，所述方法包括以下步驟I)配制膀胱癌EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品對膀胱癌EJ細(xì)胞溶液進行逐級稀釋以制成膀胱癌EJ細(xì)胞的逐級稀釋液；2)制備鏈酶親合素修飾的磁顆粒；3)分別使用保藏號為CGMCC No. 3845和CGMCC No. 6906的兩株單克隆雜交瘤細(xì)胞株制備可特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體BCMabl和BCMab2 ；4)制備生物素化的單克隆抗體BCMab2 :在微堿性條件下將生物素_N_羥基琥珀酰亞胺與所述抗體的游離賴氨酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；5)使用2)中制備的鏈酶親合素修飾的磁顆粒和4)中制備的生物素化的單克隆抗體BCMab2，通過鏈酶親合素與生物素的特異性結(jié)合反應(yīng)，制備由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒；

6)制備酶標(biāo)記的單克隆抗體BCMabl :采用碳化二亞胺(EDC)偶聯(lián)法，實現(xiàn)所述抗體上的氨基與所述酶分子上的羧基的結(jié)合；7)配制6)中的酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；8)組裝為成品。優(yōu)選地，所述方法還包括以下步驟a)在所述由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒的制備后，用封閉液封閉所制備的由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒以降低非特異性吸附，所述封閉液包含O. 2% 1.0%牛血清白蛋白、O. 5% 1.0%酪蛋白、O. 5% 1.0%的魚水解明膠，ρΗ7· 2的O. 02Μ磷酸鹽緩沖液；和b)用無蛋白封閉液封閉反應(yīng)管和微孔板,所述無蛋白封閉液為含有1.0%的魚水解明膠，PH7. 2的O. 02M磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的試劑盒能夠靈敏、快速測定尿中脫落的膀胱癌細(xì)胞，可以及早檢測早期脫落的惡化腫瘤細(xì)胞，靈敏度高于檢測尿成分測定以及目前市場上的尿細(xì)胞學(xué)檢測。本發(fā)明專利檢測靈敏度達到每個分析實現(xiàn)I個惡性膀胱癌細(xì)胞的檢測。本發(fā)明的試劑盒也適用于膀胱癌組織消化細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞檢測，也適用于血液中循環(huán)的膀胱癌細(xì)胞的檢測。本發(fā)明的試劑盒采用免疫磁顆粒特異捕獲、酶標(biāo)記單克隆抗體特異識別的雙抗體夾心方法，實現(xiàn)了膀胱癌細(xì)胞的特異性檢測。本試劑盒可以排除正常、炎癥上皮細(xì)胞，以及其它血細(xì)胞的干擾，只特異識別膀胱癌細(xì)胞。本發(fā)明專利采用免疫磁顆粒方法捕獲尿液中脫落的膀胱癌細(xì)胞，操作簡便、檢測時間短，利于臨床大規(guī)模的應(yīng)用。本發(fā)明中使用到兩種特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體DBCMabl :由保藏號為CGMCC No. 3845的雜交瘤細(xì)胞株制備，該雜交瘤細(xì)胞株于2010年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，該抗體及其制備具體描述于中國專利申請?zhí)?201010251384. 6 ;以及2)BCMab2 由保藏號為CGMCC No. 6906的雜交瘤細(xì)胞株制備，該雜交瘤細(xì)胞株于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)。


圖1.所制備的試劑盒以EJ細(xì)胞為模型所得線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2. EJ、LOVO、HCV29細(xì)胞系和PBS通過本方法檢測所得的發(fā)光值對比。EJ :膀胱癌細(xì)胞系；L0V0 :直腸癌細(xì)胞系；HCV29 :正常上皮細(xì)胞系。圖3.試劑盒檢測靈敏度。膀胱癌細(xì)胞系EJ、T24、5637、BIU_87 ;BCU_Ta :Ta期膀胱癌患者尿液樣本T1期膀胱癌患者尿液樣本。圖4.本發(fā)明試劑盒應(yīng)用于膀胱癌與正常樣本檢測。圖5.本發(fā)明試劑盒臨床測定結(jié)果的ROC曲線。
具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的一種新的膀胱癌細(xì)胞化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒一、標(biāo)準(zhǔn)化的膀胱癌細(xì)胞的制備膀胱癌EJ細(xì)胞系(CRL-2888 )購自美國模式培養(yǎng)物保存所(ATCC)，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，12100-046)培養(yǎng)。將培養(yǎng)的貼壁狀態(tài)良好的細(xì)胞加入l-2mL胰酶(Invitrogen，R-001-100)，37°C消化2分鐘，加入適量培養(yǎng)基，將消化下來的細(xì)胞離心棄上清后，重懸于胎牛血清加10%二甲基亞砜(DMSO)配制而成的凍存液中，以IO6個/mL細(xì)胞濃度_80°C凍存，每支凍存500 μ L0試劑盒運輸過程，此成分需要單獨采用干冰凍存運輸。
二、單克隆抗體BCMab2雜交瘤細(xì)胞的制備取凍存EJ細(xì)胞，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，狀態(tài)良好培養(yǎng)3周后，取處于生長對數(shù)期的EJ細(xì)胞I X 1O7個，免疫6周大小的BALB/c小鼠(商購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，每周免疫4次，免疫1個月后，取小鼠脾臟細(xì)胞。并準(zhǔn)備小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 (CRL-1772, ATCC)與小鼠脾臟細(xì)胞融合，按照參考文獻(Kirk, A. D.，et al. Nat Med1999，5，686-693)所述進行雜交瘤篩選EJ細(xì)胞的單克隆株細(xì)胞。然后，將選出的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)(有限稀釋法，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞)。經(jīng)過2-3輪克隆化培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的能夠產(chǎn)生高效價單抗的雜交瘤細(xì)胞克隆株。將雜交瘤細(xì)胞克隆株擴大培養(yǎng)，并凍存保種。篩選所得雜交瘤細(xì)胞株可分泌單克隆抗體BCMab2，特異識別EJ細(xì)胞以及其它膀胱癌細(xì)胞。三、單克隆抗體BCMabl和BCMab2的制備已具備兩株單克隆雜交瘤細(xì)胞株保藏號為CGMCC No. 3845的雜交瘤細(xì)胞株可獲得BCMabl抗體(具體參見，中國專利申請?zhí)?01010251384. 6);保藏號為CGMCC No. 6906的雜交瘤細(xì)胞株可獲得BCMab2抗體。取5X IO6個正處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，以IXlO7的細(xì)胞濃度注射于BALB/c小鼠腹腔，10天后收集腹水。通過以下步驟純化腹水中的單克隆抗體1.收集所得的腹水以2500r/min離心，取上清，以O(shè). OlM pH7. 4 PBS對倍稀釋腹水上清。2.向上述腹水中加入等體積的飽和硫酸銨，室溫攪拌I小時；3.以11000r/min，4°C離心20分鐘，棄上清。重懸于適量O. OlM pH7.4PBS中，并加入一半腹水體積的飽和硫酸銨,4 V攪拌過夜。4.上述腹水以11000r/min，4°C離心20分鐘，棄上清。將沉淀溶于O. OlM pH7. 4PBS中，再用O. OlM ρΗ7· 4 PBS透析，即得抗體粗球。5. Protein-G凝膠柱安裝到AKTA蛋白純化儀；6.將抗體粗球11000r/min,4°C離心20分鐘,取上清。上清以O(shè). 5mL/min流速通過預(yù)先以O(shè). 02M pH7. O含O. 15M的NaCl的PBS平衡過的Protein-G凝膠柱，上樣完畢后孵育I小時；7. O. 02M ρΗ7· O 含 O. 15Μ 的 NaCl 的 PBS 洗脫雜蛋白；8. O. 2Μ ρΗ2. 8甘氨酸緩沖液洗脫抗體峰；9.洗脫的抗體溶液經(jīng)超濾濃縮，測抗體濃度，即完成抗體的純化。

四、免疫磁顆粒的制備1.單克隆抗體BCMab2的生物素化取IOmg已純化好的單克隆抗體BCMab2 (2mg/mL),用O. 1Μ, pH9. 5的碳酸鹽緩沖液進行透析，即得處于碳酸鹽緩沖體系的抗體溶液。生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS-Biotin,貨號 H1759)購自 Sigma-Aldrich,以 lmg/mL 濃度溶解于二甲基亞諷(DMSO)。然后在抗體溶液中加入200uL生物素溶液，4°C攪拌反應(yīng)6小時，加入20uL IM的NH4Cl溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)物在O. 05M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液進行透析，即得處于磷酸鹽緩沖體系的生物素化抗體BCMab2.2.磁顆粒的鏈酶親合素修飾取20mg氧化硅羥基磁顆粒(上海奧潤微納有限公司，SM1-015A，SM1-035，SM1-050，SM1-100)，在外磁場作用下除去儲存緩沖液，加入2mL1. 25%戊二醛活化，室溫攪拌2小時后，在外加磁場下，靜置5min，棄上清，用O. OlM pH7. 4磷酸鹽緩沖液清洗三次，并重懸于O. 05M, pH9. 5碳酸緩沖溶液。之后，加入Img鏈酶親合素(購自Sigma-AIdrich,S4762)，室溫攪拌2小時，用pH7. 4的O. OlM磷酸鹽緩沖液清洗三次，并重懸于磷酸緩沖溶液，定濃度為4mg/mL，即得鏈酶親合素修飾的磁顆粒。3.免疫磁顆粒的制備20mg鏈酶親合素修飾的磁顆粒(4mg/mL)置于磁場中，待磁顆粒完全沉降后，去除上清液，加入IOmg生物素化的抗體BCMab2 (2mg/mL)，4°C攪拌4小時。之后用O. OlM pH7. 4磷酸鹽緩沖液清洗四次，最后重懸于抗體緩沖溶液中(O. OlM pH7. 4磷酸鹽緩沖液，2%牛血清白蛋白，O. 05% Tween-20,0. 05% proclin-300)，即得免疫磁顆粒。優(yōu)選地，用封閉液封閉所制備的由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒以降低非特異性吸附，所述封閉液包含O. 2% 1.0%牛血清白蛋白、O. 5% 1.0%酪蛋白、O. 5% 1.0%的魚水解明膠，pH7. 2的O. 02M磷酸鹽緩沖液。所制備的免疫磁顆粒以4mg/mL濃度于4°C保存。五、磁顆粒粒徑的選擇磁顆粒粒徑越小，在溶液中分散越均勻，但小于IOOnm時，在外磁場作用下沉降速度減慢，會增加試劑盒應(yīng)用過程中的洗滌時間，因此本試劑盒選定大于IOOnm以上的磁顆粒。磁顆粒在免疫反應(yīng)過程中分散于反應(yīng)體系，可以在一定程度上加快反應(yīng)速度。魯米諾-H2O2發(fā)光體系中，具有一定的催化作用，當(dāng)粒徑在IOOnm至I μ m時,魯米諾-H2O2體系的發(fā)光動力學(xué)曲線發(fā)光平臺可持續(xù)時間在30min到2h之間。增大到I μ m以上，這種催化能力下降，魯米諾-H2O2體系的發(fā)光動力學(xué)曲線發(fā)光平臺持續(xù)時間減少(低于15min)。六、酶標(biāo)記單克隆抗體BCMabl的制備以辣根過氧化物酶(HR，購自Sigma，P6782)標(biāo)記抗體為例，采用碳化二亞胺(EDC)偶聯(lián)法，具體流程如下10mg HRP溶解于pH6. O的O.1M檸檬酸鹽緩沖溶液中(1L去離子水中加入78. 84mg檸檬酸，476. 44mg檸檬酸鈉)，加入碳化二亞胺(EDC，溶解于瑪琳基乙磺酸)與酶分子上的羧基反應(yīng)；IOmin后加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，將取代EDC分子，酶分子與NHS分子間形成活化的羧基基團；lmg單克隆抗體BCMabl與活化的酶分子反應(yīng)，實現(xiàn)抗體上的氨基與酶分子活化羧基反應(yīng)，室溫2小時，即得HRP標(biāo)記單克隆抗體BCMabl ；完成標(biāo)記的抗體溶液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，直至飽和硫酸銨濃度降低至1/3 ;4°C靜置lh，8000rpm離心lOmin，將上清液移至新管，沉淀用等體積PBS重新懸??；重復(fù)上述操作3次，收集上清即得提純的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體BCMabl，加入等體積甘油，-20°C保存?zhèn)溆谩A性磷酸酶或熒光素酶與BCMabl的偶聯(lián)，與上述步驟類似，試劑的具體用量可以適當(dāng)進行調(diào)節(jié)優(yōu)化。 七、樣本稀釋液的配制配制樣品稀釋液，具體配制為在IL去離子水中，加入3. 628gNa2HP04 · 12H20，
O.272g KH2PO4,0. 2g KCl，8g NaCl，18g 尿素，0. 05g 尿酸，ImL 胎牛血，ImL proclin-300 振蕩混合均勻，調(diào)節(jié)pH至7. 4，溶液于4°C保存，用于尿沉渣樣本和凍存細(xì)胞的稀釋緩沖溶液。八、化學(xué)發(fā)光底物液本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(HR)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法基于IOOOmL所述化學(xué)發(fā)光底物A液，包括1. 7716g魯米諾、O. 05g 4_羥基聯(lián)苯、
O.012g 4-碘苯硼酸、11. 4g硼酸、4. 9g硼砂，其pH值為8. O 10. O ;基于IOOOmL所述化學(xué)發(fā)光底物B液，包括O. 329g過氧化脲、lmlTween-20、51. 58gNa2HP04 · 12Η20、8· 74g NaH2PO4 · 2Η20，其 pH 值為 7.0 7· 6。使用方法:Α、B液雙組分試劑，在使用前根據(jù)使用量等體積混合。九、反應(yīng)管和微孔板的封閉處理優(yōu)選地，用無蛋白封閉液封閉反應(yīng)管和微孔板，所述無蛋白封閉液為含有1. 0%的魚水解明膠，ΡΗ7. 2的O. 02Μ磷酸鹽緩沖液。實施例2本發(fā)明的膀胱癌尿脫落細(xì)胞化學(xué)法光免疫分析測定試劑盒使用方法一、樣品前處理取人晨尿或晨二次尿樣，如即時檢測，樣本無需處理，直接檢測。如無法當(dāng)天檢測，樣本需凍存取尿液10mL，3000rpm離心5min，將尿沉渣懸于500uL細(xì)胞凍存液(含10 %DMSO的胎牛血清)中，先置于4°C 2小時，再置于_80°C保存，備用。二、檢測方法使用本試劑盒進行實驗前，先將恒溫箱或者水浴鍋調(diào)至37°C ;之后需先取出本實施例I中所制備的磁顆粒溶液、HRP標(biāo)記抗體以及各緩沖溶液，在室溫放置以平衡到室溫；再將凍存樣本和膀胱癌EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品取出置于37°C水浴箱迅速復(fù)融，離心去上清，復(fù)懸于ImL細(xì)胞稀釋液。EJ細(xì)胞初濃度5 X IO5個/mL，然后繼續(xù)以細(xì)胞稀釋液進行系列稀釋，得一系列細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品，即 5 X IO5 個 /mL、I X IO5 個 /mL、5 X IO4 個 /mL、I X IO4 個 /mL、5 X IO3 個 /mL、5X IO2 個 /mL、20 個 /mL。再后，準(zhǔn)備 200-1000 μ L,20-200 μ L、1-10 μ L 量程微量加樣器及對應(yīng)吸頭并且檢查化學(xué)發(fā)光儀是否正常工作。使用本發(fā)明的試劑盒進行檢測的具體操作步驟如下(一)微孔板式化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒取白色96微孔板，每孔加入50 μ L尿液樣本或系列校準(zhǔn)細(xì)胞溶液(5Χ105個/mL、I X IO5 個 /mL、5X IO4 個 /mL、l X IO4 個 /mL、5X IO3 個 /mL、5X IO2 個 /mL、20 個 /mL)。再先后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體溶液和免疫磁微粒溶液各5 μ L，37°C振蕩反應(yīng)60min。每孔加入洗漆液150 μ L,在微孔板振蕩器上(MH-1, Kylin-Bell Instruments)震蕩IOs混勻，然后置于96微孔板配套的磁分離器(購自NEB公司，S1511S)上，去除上清。重復(fù)上面洗滌步驟，洗滌4次。每孔加入化學(xué)發(fā)光底物液100 μ L，充分混勻，而后在板式化學(xué)發(fā)光儀(北京濱松光子有限公司，ΒΗΡ9504)上依序測量發(fā)光強度(RLU)。理論上每孔內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞數(shù)目分別為25000個/分析、5000個/分析、2500個/分析、500個/分析、250個/分析、25個/分析、I個/分析。以細(xì)胞數(shù)量與發(fā)光值的線性關(guān)系見附圖1，其中，縱坐標(biāo)RLU為相對發(fā)光強度，橫坐標(biāo)為細(xì)胞檢測數(shù)目(單位為細(xì)胞/分析)。在I 25000細(xì)胞/分析范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2 = O. 9984，Y = 12511+33. 651Χ ;在I 500細(xì)胞/分析范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2 = O. 9968，Y = 1037+92. 21Χ。根據(jù)RLU大小，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，將各待測樣本的RLU代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即得待測尿樣中腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。(二)管式化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒將反應(yīng)管編號后，向其中加入200 μ L尿液樣本或系列校準(zhǔn)細(xì)胞溶液,與磁顆粒溶液和HRP標(biāo)記BCMabl抗體溶液各20 μ L混合，37°C振蕩反應(yīng)60min。之后置于多功能磁分離器(上海奧潤微納新材料科技有限公司，MS-12)上，3min后棄去上清，每管加入洗滌液300 μ L，充分混勻，置于磁分離器上靜置3min，棄去上清液，重復(fù)4次，最后棄去洗滌液，各管加入化學(xué)發(fā)光底物液200 μ L，充分混勻，而后在管式化學(xué)發(fā)光測量儀(德國BertholdTechnologies GmbH & Co. KG)上依序測量各管的發(fā)光強度(RLU)。以與上述(一)中相似的方式確定待測尿樣中腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。實施例3本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)指標(biāo)按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定，結(jié)果如下1、試劑盒精密度測定(I)EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品精密度實驗
將實施例1中制備的試劑盒抽取10個試劑盒，按照實施例2所述操作測定I X IO3個/mL的EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品5次。計算測定結(jié)果變異系數(shù)，測定結(jié)果如表I所示，結(jié)果顯示變異系數(shù)在3. 5% 10%之間。表IEJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性實驗
權(quán)利要求
1.一種用于檢測人膀胱癌細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括兩種特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述試劑盒包括1)膀胱癌EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品；2)由特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體包被的磁顆粒；3)酶標(biāo)記的特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體；4)3)中的酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；5)反應(yīng)管或微孔板，所述反應(yīng)管或微孔板優(yōu)選經(jīng)過無蛋白封閉液的封閉處理，所述無蛋白封閉液為含有1. O %的魚水解明膠，pH7. 2的O. 02M磷酸鹽緩沖液；6)與5)中的反應(yīng)管或微孔板配套的磁分離器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述膀胱癌EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品為膀胱癌EJ細(xì)胞的逐級稀釋液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，2)中所述的特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No. 6906的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體BCMab2，其與磁顆粒通過共價鍵結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，2)中所述的磁顆粒是粒徑為IOOnm至Ιμπι的氧化硅羥基磁顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，3)中所述的酶標(biāo)記的特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體是酶標(biāo)記的BCMabl單克隆抗體,所述BCMabl單克隆抗體由保藏號為 CGMCC No. 3845的雜交瘤細(xì)胞株制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，3)中所述的酶是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，5)中所述的反應(yīng)管是具有光學(xué)透明度的聚苯乙烯管、聚乙烯管、聚丙烯管或者玻璃管；所述微孔板是適用于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的檢測的白色微孔板。
9.制備根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒的方法，所述方法包括以下步驟1)配制膀胱癌EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品對膀胱癌EJ細(xì)胞溶液進行逐級稀釋以制成膀胱癌EJ細(xì)胞的逐級稀釋液；2)制備鏈酶親合素修飾的磁顆粒；3)分別使用保藏號為CGMCCNo. 3845和CGMCC No. 6906的兩株單克隆雜交瘤細(xì)胞株制備可特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體BCMabl和BCMab2 ；4)制備生物素化的單克隆抗體BCMab2:在微堿性條件下將生物素-N-羥基琥珀酰亞胺與所述抗體的游離賴氨酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；5)使用2)中制備的鏈酶親合素修飾的磁顆粒和4)中制備的生物素化的單克隆抗體BCMab2，通過鏈酶親合素與生物素的特異性結(jié)合反應(yīng)，制備由生物素化的單克隆抗體 BCMab2包被的磁顆粒；6)制備酶標(biāo)記的單克隆抗體BCMabl:采用碳化二亞胺(EDC)偶聯(lián)法，實現(xiàn)所述抗體上的氨基與所述酶分子上的羧基的結(jié)合；7)配制6)中的酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；8)組裝為成品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述方法還包括以下步驟a)在所述由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒的制備后，用封閉液封閉所制備的由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒以降低非特異性吸附，所述封閉液包含O. 2% 1.0%牛血清白蛋白、O. 5% 1.0%酪蛋白、O. 5% 1.0%的魚水解明膠， ρΗ7· 2的O. 02Μ磷酸鹽緩沖液；和b)用無蛋白封閉液封閉反應(yīng)管和微孔板，所述無蛋白封閉液為含有1.0%的魚水解明膠，ρΗ7· 2的O. 02Μ磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地提供了一種基于免疫磁顆粒的化學(xué)發(fā)光分析方法檢測人膀胱癌細(xì)胞的試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的試劑盒主要包括1)膀胱癌EJ細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品；2)由特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體包被的磁顆粒；3)酶標(biāo)記的特異識別膀胱癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體；4)3)中的酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；5)反應(yīng)管或微孔板；6)與5)中的反應(yīng)管或微孔板配套的磁分離器。
文檔編號G01N33/577GK103033625SQ201210555378
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者范祖森, 張倩云, 李翀, 杜穎, 王彥英, 楊昭 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所