本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種利用高效表達分泌型蛋白表達系統(tǒng)制備人源纖維連接蛋白(Fn3)展示抗原腦鈉肽前體N端(NT-BNP)線性表位的方法。

背景技術：

在ELISA檢測試劑盒制備過程中，需要將相應的抗原作為標準品。其中，蛋白質(zhì)類抗原占有很大的比例。如何高效生產(chǎn)蛋白質(zhì)類抗原，是該類產(chǎn)品的一個技術關鍵。本發(fā)明采用人源纖維連接蛋白(Fn3)展示蛋白質(zhì)類抗原線性表位，嘗試建立一個利用短芽胞桿菌高效生產(chǎn)分泌型蛋白質(zhì)類線性表位的通用平臺。

NT-BNP是當心肌受到刺激或損失時被釋放到人的血漿中，在血漿中半衰期長，濃度高，體外更加穩(wěn)定。因此，NT-BNP作為標準檢測抗原目前被廣泛地應用于心血管疾病的診斷治療及預后應用中。NT-BNP作為標準檢測抗原的來源包括化學合成、大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)重組、人細胞重組和心衰患者血漿分離等。由于其它幾種來源成本較高，或者穩(wěn)定性較差，目前主要來源為大腸桿菌重組獲得。但大腸桿菌重組表達的融合蛋白，上游的蛋白表達需要IPTG誘導，下游的蛋白純化需要破碎細胞等一系列的步驟，比較復雜。

短芽孢桿菌(Bacillus brevis，B.brevis)表達系統(tǒng)是能夠高效表達分泌型和優(yōu)良蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)，尤其適用于生產(chǎn)分泌型蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)具有如下的優(yōu)點：(1)沒有明顯的密碼子偏愛性，同時表達產(chǎn)物也不容易形成包涵體，蛋白跨越細胞膜后，被加工和直接釋放到培養(yǎng)基中而不發(fā)生聚集，回收和純化蛋白較為簡單；(2)幾乎不向胞外分泌蛋白酶，利于目的蛋白的穩(wěn)定性；(3)對于真核起源的分泌型蛋白質(zhì)，一般具有S-S鍵結(jié)構(gòu)，據(jù)研究其發(fā)酵液中存在著可以促進蛋白中二硫鍵形成的因子，可以促進外源蛋白的折疊。

本發(fā)明采用短芽孢桿菌表達人源纖維連接蛋白(Fn3)展示抗原腦鈉肽前體線性表位，通過該途徑可以將表達的外源蛋白直接分泌到培養(yǎng)液中，從而大大簡化下游外源蛋白的分離純化過程?？蓪崿F(xiàn)采用短芽胞桿菌分泌表達纖維連接蛋白所展示抗原的一個或多個表位，來生產(chǎn)具有和抗原蛋白等效的高穩(wěn)定的抗原蛋白替代物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種利用分泌型蛋白表達系統(tǒng)短芽胞桿菌制備重組人源Fn3-N-端腦鈉肽前體抗原表位(NT-BNP_12-21)的方法，降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)快速、大規(guī)模分離制備人重組N-端腦鈉肽前體抗原表位。

本發(fā)明的技術方案為：將能與腦鈉肽前體抗體結(jié)合的抗原表位核苷酸序列置換人纖維連接蛋白Fn3的編碼FG區(qū)核苷酸序列，再將以上融合基因構(gòu)建到穿梭載體pNCMO₂上，利用短芽胞桿菌表達系統(tǒng)高效表達重組人源Fn3-N-端腦鈉肽前體抗原表位Fn3-BNP_12-21。具體步驟如下：

1.人纖維連接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位融合蛋白表達載體構(gòu)建：

(1)將NT-BNP_12-21線性表位設計在Fn3的FG區(qū)，在FG loop區(qū)引入編碼BNP線性表位的短肽序列，構(gòu)成人纖維連接蛋白Fn3與NT-BNP_12-21線性表位融合基因Fn3-BNP_12-21，合成Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位的基因片段，在融合基因5′末端引入編碼6個組氨酸的分離純化標簽，便于分離純化；

(2)將上述融合基因Fn3-BNP_12-21通過NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點構(gòu)建到穿梭載體pNCMO₂的P2強啟動子下游，形成融合表達載體pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21；

2.人纖維連接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位融合蛋白的表達：

(1)將融合表達載體pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，在氨芐青霉素抗性的LB平板上篩選陽性克隆，氨芐青霉素在LB培養(yǎng)基的終濃度為100μg/ml，LB培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化鈉10g和15g瓊脂粉；

(2)將鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化至短芽孢桿菌中，在新霉素抗性的MT平板上篩選陽性克隆，新霉素在MT培養(yǎng)基終濃度為10μg/ml，MT培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中含葡萄糖20g、多價胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O1mg，pH＝7.2-7.4；

(3)將鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子接種在含有新霉素抗性的MT或2SY液體培養(yǎng)基中，新霉素在液體培養(yǎng)基終濃度為50μg/ml，過夜培養(yǎng)，收集上清培養(yǎng)液，利用SDS-PAGE電泳及Western Blot法檢測目的蛋白條帶，2SY培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl₂·2H₂O 0.15g，pH＝7.2-7.4；

3.融合蛋白的分離純化：

收集上清培養(yǎng)液，用鎳柱純化帶有His-Tag標簽的融合蛋白，該蛋白即為重組人源Fn3融合N-端腦鈉肽前體抗原表位BNP_12-21蛋白。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用的表達載體為pNCMO₂，該載體是在B.brevis和E.coli間的穿梭質(zhì)粒。在E.coli中構(gòu)建表達質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)入B.brevis進行蛋白質(zhì)表達。宿主菌細胞壁蛋白質(zhì)的P2啟動子作為pNCMO₂的表達啟動子，由于P2啟動子在E.coli中不起作用，有利于目的基因的克??；但在B.brevis中則是呈指數(shù)級別的強啟動子，可高效的表達目的蛋白。

本發(fā)明采用短芽孢桿菌表達人源纖維連接蛋白(Fn3)展示抗原腦鈉肽前體線性表位，通過該途徑可以將表達的外源蛋白直接分泌到培養(yǎng)液中，從而大大簡化下游外源蛋白的分離純化過程，從而快速、簡單、高效的制備人重組N-端腦鈉肽前體抗原表位。

本發(fā)明不僅適用于分泌型人纖維連接蛋白-腦鈉肽前體抗原表位的制備，也適用于其它重組蛋白質(zhì)的制備。因此，本發(fā)明在大規(guī)模制備人源Fn3-BNP_12-21重組蛋白和其它重組多肽的生產(chǎn)中具有較高實用價值。

附圖說明

附圖1為本發(fā)明的Fn3-BNP_12-21基因結(jié)構(gòu)圖。

附圖2為本發(fā)明的pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21融合表達載體圖譜。

附圖3為本發(fā)明的Fn3-BNP_12-21重組蛋白在不同培養(yǎng)基中表達的SDS-PAGE電泳圖，其中：條帶1、2、3為陽性轉(zhuǎn)化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21菌株在MT培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，離心所得上清樣品，4、5、6為陽性轉(zhuǎn)化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21菌株在2SY培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，離心所得上清樣品，M為標準蛋白質(zhì)。

附圖4為本發(fā)明的Fn3-BNP_12-21重組蛋白Western Blot檢測圖結(jié)果圖。其中，條帶1為實施例一中的Western Blot檢測圖結(jié)果，條帶2為實施例二中Western Blot檢測圖結(jié)果。

附圖5為本發(fā)明的Fn3-BNP_12-21重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后SDS-PAGE電泳圖，其中，條帶1、2、3分別為實施例一至三所得的鎳柱純化后的Fn3-BNP_12-21融合蛋白，M為標準蛋白質(zhì)。

附圖6為本發(fā)明的重組Fn3-BNP_12-21蛋白與鼠源抗BNP_12-21氨基酸殘基的單克隆抗體13G12結(jié)合能力分析。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明作進一步的說明，但并不影響本發(fā)明的保護范圍。

實施例一

1.人纖維連接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位融合蛋白表達載體構(gòu)建：

(1)采用人纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域蛋白(Fn3)為模式基因(EMBL登入號碼AJ320527)，將NT-BNP_12-21線性表位設計在Fn3的FG區(qū)，在FG loop區(qū)引入編碼BNP抗原表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，編碼BNP的12-21氨基酸殘基LETSGLQEQR)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司按照序列表[1]合成Fn3-BNP_12-21基因，在融合基因5′末端引入編碼6個組氨酸的分離純化標簽，便于分離純化；形成的融合基因結(jié)構(gòu)見附圖1；

(2)將上述融合基因Fn3-BNP_12-21通過NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點構(gòu)建到穿梭載體pNCMO₂的P2強啟動子下游，形成融合表達載體pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21，其核苷酸序列如序列表[2]所示，載體圖譜見附圖2；

2.人纖維連接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位融合蛋白的表達：

(1)將融合表達載體pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21根據(jù)寶生物工程(大連)有限公司JM109感受態(tài)細胞說明書轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌菌株中，在含有氨芐青霉素(100μg/ml)抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24h。LB培養(yǎng)基配方：每升培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化鈉10g和瓊脂粉15g；

(2)挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素(100μg/ml)抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)過NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性后，將重組質(zhì)粒pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21按照寶生物工程(大連)有限公司短芽胞桿菌表達系統(tǒng)HB200中的NTP法說明，轉(zhuǎn)化至短芽胞桿菌表達系統(tǒng)HB116中，在新生霉素抗性(10μg/ml)MT培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，取經(jīng)過NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP₁₂-21進行融合蛋白的表達。MT培養(yǎng)基配方：每升培養(yǎng)基中含葡萄糖20g、多價胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O 1mg，pH＝7.2-7.4；

(3)將鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP₁₂-21菌株接種到5ml新生霉素抗性(50μg/ml)的MT培養(yǎng)基中，在200rpm、30℃條件下，震蕩培養(yǎng)24h。將菌液離心力為12000g，離心10min，收集上清液，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，熱裂解后，進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見附圖3；

(4)將步驟2(3)中獲得的上清液濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)過封閉液封閉后，加入一抗(1∶2500稀釋，抗BNP單克隆抗體，購自HyTest公司)進行室溫孵育，二抗為辣根酶標記羊抗小鼠IgG(1∶4000稀釋)孵育清洗后，進行Western-Blot發(fā)光檢測，結(jié)果見附圖4；

3.融合蛋白的分離純化：

將步驟2(3)獲得的上清液經(jīng)過鎳柱純化后得到目的融合蛋白Fn3-BNP_12-21，通過SDS-PAGE電泳進行蛋白純度檢測，SDS-PAGE電泳圖見附圖5，采用ELISA方法測定免疫血清的效價。融合蛋白經(jīng)逐級稀釋后包被96孔酶標板，經(jīng)過封閉液封閉后，加入HyTest公司生產(chǎn)的鼠源抗NT-proBNP_12-21氨基酸殘基的單克隆抗體13G12(1:2500稀釋),用血清白蛋白作空白對照。二抗為辣根過氧化酶標記羊抗小鼠IgG抗體(1∶4000稀釋)，底物為TMB，顯色10min后用2M的硫酸終止反應。測定波長450nm處的OD值。結(jié)果如附圖6所示,融合蛋白Fn3-BNP_12-21具有良好的與鼠源抗BNP_12-21氨基酸殘基的單克隆抗體13G12結(jié)合能力。

實施例二

1.人纖維連接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位融合蛋白表達載體構(gòu)建：

(1)采用人纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域蛋白(Fn3)為模式基因(EMBL登入號碼AJ320527)，將NT-BNP_12-21線性表位設計在Fn3的FG區(qū)，在FG loop區(qū)引入編碼BNP抗原表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，編碼BNP的12-21氨基酸殘基LETSGLQEQR)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司按照序列表[1]合成Fn3-BNP_12-21基因，在融合基因5′末端引入編碼6個組氨酸的分離純化標簽，便于分離純化；形成的融合基因結(jié)構(gòu)見附圖1；

(2)將上述融合基因Fn3-BNP_12-21通過NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點構(gòu)建到穿梭載體pNCMO₂的P2強啟動子下游，形成融合表達載體pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21，其核苷酸序列如序列表[2]所示，載體圖譜見附圖2；

2.人纖維連接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位融合蛋白的表達：

(1)將融合表達載體pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21根據(jù)寶生物工程(大連)有限公司JM109感受態(tài)細胞說明書轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌菌株中，在含有氨芐青霉素(100μg/ml)抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24h。LB培養(yǎng)基配方：每升培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化鈉10g和瓊脂粉15g；

(2)挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素(100μg/ml)抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)過NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性后，將重組質(zhì)粒pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21按照寶生物工程(大連)有限公司短芽胞桿菌表達系統(tǒng)HB200中的NTP法說明，轉(zhuǎn)化至短芽胞桿菌表達系統(tǒng)HB116中，在新生霉素抗性(10μg/ml)MT培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，取經(jīng)過NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21進行融合蛋白的表達。MT培養(yǎng)基配方：每升培養(yǎng)基中含葡萄糖20g、多價胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O 1mg，pH＝7.2-7.4；

(3)將鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21菌株接種到5ml新生霉素抗性(50μg/ml)的2SY培養(yǎng)基中，在200rpm、30℃條件下，震蕩培養(yǎng)24h。將菌液離心力為12000g，離心10min，收集上清液，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，熱裂解后，進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見附圖3。2SY培養(yǎng)基配方如下：每升培養(yǎng)基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl₂·2H₂O 0.15g，pH＝7.2-7.4；

(4)將步驟2(3)中獲得的上清液濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)過封閉液封閉后，加入一抗(1∶3000稀釋，抗BNP單克隆抗體，購自HyTest公司)進行室溫孵育，二抗為辣根酶標記羊抗小鼠IgG(1∶4000稀釋)孵育清洗后，進行Western-Blot發(fā)光檢測，結(jié)果見附圖4；

3.融合蛋白的分離純化：

將步驟2(3)獲得的上清液經(jīng)過鎳柱純化后得到目的融合蛋白Fn3-BNP_12-21，通過SDS-PAGE電泳進行蛋白純度檢測，SDS-PAGE電泳圖見附圖5，采用ELISA方法測定免疫血清的效價。融合蛋白經(jīng)逐級稀釋后包被96孔酶標板，經(jīng)過封閉液封閉后，加入HyTest公司生產(chǎn)的鼠源抗NT-proBNP_12-21氨基酸殘基的單克隆抗體13G12(1:3000稀釋),用血清白蛋白作空白對照。二抗為辣根過氧化酶標記羊抗小鼠IgG抗體(1∶4000稀釋)，底物為TMB，顯色10min后用2M的硫酸終止反應。測定波長450nm處的OD值。結(jié)果如附圖6所示,融合蛋白Fn3-BNP_12-21具有良好的與鼠源抗BNP_12-21氨基酸殘基的單克隆抗體13G12結(jié)合能力。

實施例三

1.人纖維連接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位融合蛋白表達載體構(gòu)建：

(1)采用人纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域蛋白(Fn3)為模式基因(EMBL登入號碼AJ320527)，將NT-BNP_12-21線性表位設計在Fn3的FG區(qū)，在FG loop區(qū)引入編碼BNP抗原表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，編碼BNP的12-21氨基酸殘基LETSGLQEQR)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司按照序列表[1]合成Fn3-BNP_12-21基因，在融合基因5′末端引入編碼6個組氨酸的分離純化標簽，便于分離純化；形成的融合基因結(jié)構(gòu)見附圖1；

(2)將上述融合基因Fn3-BNP_12-21通過NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點構(gòu)建到穿梭載體pNCMO₂的P2強啟動子下游，形成融合表達載體pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21，其核苷酸序列如序列表[2]所示，載體圖譜見附圖2；

2.人纖維連接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21線性表位融合蛋白的表達：

(1)將融合表達載體pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21根據(jù)寶生物工程(大連)有限公司JM109感受態(tài)細胞說明書轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌菌株中，在含有氨芐青霉素(100μg/ml)抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24h。LB培養(yǎng)基配方：每升培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化鈉10g和瓊脂粉15g；

(2)挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素(100μg/ml)抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)過NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性后，將重組質(zhì)粒pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21按照寶生物工程(大連)有限公司短芽胞桿菌表達系統(tǒng)HB200中的NTP法說明，轉(zhuǎn)化至短芽胞桿菌表達系統(tǒng)HB116中，在新生霉素抗性(10μg/ml)MT培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，取經(jīng)過NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21進行融合蛋白的表達。MT培養(yǎng)基配方：每升培養(yǎng)基中含葡萄糖20g、多價胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O 1mg，pH＝7.2-7.4；

(3)將鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21菌株接種到5ml新生霉素抗性(50μg/ml)的2SY培養(yǎng)基中，在200rpm、30℃條件下，震蕩培養(yǎng)48h。將菌液離心力為10000g，離心10min，收集上清液，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，熱裂解后，進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見附圖3。2SY培養(yǎng)基配方如下：每升培養(yǎng)基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl₂·2H₂O 0.15g，pH＝7.2-7.4；

(4)將步驟2(3)中獲得的上清液濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)過封閉液封閉后，加入一抗(1∶2500稀釋，抗BNP單克隆抗體，購自HyTest公司)進行室溫孵育，二抗為辣根酶標記羊抗小鼠IgG(1∶5000稀釋)孵育清洗后，進行Western-Blot發(fā)光檢測，結(jié)果見附圖4；

3.融合蛋白的分離純化：

將步驟2(3)獲得的上清液經(jīng)過鎳柱純化后得到目的融合蛋白Fn3-BNP_12-21，通過SDS-PAGE電泳進行蛋白純度檢測，SDS-PAGE電泳圖見附圖5，采用ELISA方法測定免疫血清的效價。融合蛋白經(jīng)逐級稀釋后包被96孔酶標板，經(jīng)過封閉液封閉后，加入HyTest公司生產(chǎn)的鼠源抗NT-proBNP_12-21氨基酸殘基的單克隆抗體13G12(1:2500稀釋)，用血清白蛋白作空白對照。二抗為辣根過氧化酶標記羊抗小鼠IgG抗體(1∶5000稀釋)，底物為TMB，顯色10min后用2M的硫酸終止反應。測定波長450nm處的OD值。結(jié)果如附圖6所示,融合蛋白Fn3-BNP_12-21具有良好的與鼠源抗BNP_12-21氨基酸殘基的單克隆抗體13G12結(jié)合能力。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，按照本領域的普通技術知識和通用方法，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110> 大連大學

<120> 一種利用短芽胞桿菌制備腦鈉肽前體抗原表位的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gctcaggttt ctgatgttcc gcgtgacctg gaagttgttg ctgcgacccc gactagcctg 60

ctgatcagct gggatgctcc tgcagttacc gtgcgttatt accgtatcac gtacggtgaa 120

accggtggta actccccggt tcaggaattc actgtacctg gttccaagtc tactgctacc 180

atcagcggcc tgaaaccggg tgtcgactat accatcactg tatacgctgt tactggcgaa 240

acctcgggcc tgcaggaaca atccccaatc tcgattaact accgtaccgg tggcagcggt 300

ggtcatcatc atcatcatca cggtaaaaaa ggtaaa 336

<210> 2

<211> 5530

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgatccgaca taatggacag gtgaataacg aaccacgaaa aaaactttaa atttttttcg 60

aaggcgccgc aacttttgat tcgctcaggc gtttaatagg atgtaattgt gagcggataa 120

caattattct gcatggcttt cctgcgaaag gaggtgacac gcgcttgcag gattcgggct 180

ttaaaaagaa agatagatta acaacaaata ttccccaaga acaatttgtt tatactagag 240

gaggagaaca caaggtcatg aaaaaaagaa gggtcgttaa cagtgtattg cttctgctac 300

tgctagctag tgcactcgca cttactgttg ctcccatggc tttcgctgct caggtttctg 360

atgttccgcg tgacctggaa gttgttgctg cgaccccgac tagcctgctg atcagctggg 420

atgctcctgc agttaccgtg cgttattacc gtatcacgta cggtgaaacc ggtggtaact 480

ccccggttca ggaattcact gtacctggtt ccaagtctac tgctaccatc agcggcctga 540

aaccgggtgt cgactatacc atcactgtat acgctgttac tggcgaaacc tcgggcctgc 600

aggaacaatc cccaatctcg attaactacc gtaccggtgg cagcggtggt catcatcatc 660

atcatcacgg taaaaaaggt aaatagtaag cttggtggtg gtggttcact cgagcggcat 720

tatagtgcgg aggctttttc gcatgcaggt agggaacaat tacattgtct ttgattgtaa 780

aaatgctgtt gacaggacac taaatggtgt cgtattctca aagtaacacc atttggtgtc 840

caattgcaag tcatttggta accttaattg gatcagacaa ggtaaaggat aaaacagcac 900

aattccaaga aaaacacgat ttagaaccta aaaagaacga atttgaacta actcataacc 960

gagaggtaaa aaaagaacga agtcgagatc agggaatgag tttataaaat aaaaaaagca 1020

cctgaaaagg tgtctttttt tgatggtttt gaacttgttc tttcttatct tgatacatat 1080

agaaataacg tcatttttat tttagttgct gaaaggtgcg ttgaagtgtt ggtatgtatg 1140

tgttttaaag tattgaaaac ccttaaaatt ggttgcacag aaaaacccca tctgttaaag 1200

ttataagtga ctaaacaaat aactaaatag atgggggttt cttttaatat tatgtgtcct 1260

aatagtagca tttattcaga tgaaaaatca agggttttag tggacaagac aaaaagtgga 1320

aaagtgagac cttggagaga aaagaaaatc gctaatgttg attactttga acttctgcat 1380

attcttgaat ttaaaaaggc tgaaagagta aaagattgtg ctgaaatatt agagtataaa 1440

caaaatcgtg aaacaggcga aagaaagttg tatcgagtgt ggttttgtaa atccaggctt 1500

tgtccaatgt gcaactggag gagagcaatg aaacatggca ttcagtcaca aaaggttgtt 1560

gctgaagtta ttaaacaaaa gccaacagtt cgttggttgt ttctcacatt aacagttaaa 1620

aatgtttatg atggcgaaga attaaataag agtttgtcag atatggctca aggatttcgc 1680

cgaatgatgc aatataaaaa aattaataaa aatcttgttg gttttatgcg tgcaacggaa 1740

gtgacaataa ataataaaga taattcttat aatcagcaca tgcatgtatt ggtatgtgtg 1800

gaaccaactt attttaagaa tacagaaaac tacgtgaatc aaaaacaatg gattcaattt 1860

tggaaaaagg caatgaaatt agactatgat ccaaatgtaa aagttcaaat gattcgaccg 1920

aaaaataaat ataaatcgga tatacaatcg gcaattgacg aaactgcaaa atatcctgta 1980

aaggatacgg attttatgac cgatgatgaa gaaaagaatt tgaaacgttt gtctgatttg 2040

gaggaaggtt tacaccgtaa aaggttaatc tcctatggtg gtttgttaaa agaaatacat 2100

aaaaaattaa accttgatga cacagaagaa ggcgatttga ttcatacaga tgatgacgaa 2160

aaagccgatg aagatggatt ttctattatt gcaatgtgga attgggaacg gaaaaattat 2220

tttattaaag agtagttcaa caaacgggcc agtttgttga agattagatg ctataattgt 2280

tattaaaagg attgaaggat gcttaggaag acgagttatt aatagctgaa taagaacggt 2340

gctctccaaa tattcttatt tagaaaagca aatctaaaat tatctgaaaa gggaatgaga 2400

atagtgaatg gaccaataat aatgactaga gaagaaagaa tgaagattgt ccatgaaatt 2460

aaggaacgaa tattggataa atatggggat gatgttaagg ctattggtgt ttatggctct 2520

cttggtcgtc agactgatgg gccctattcg gatattgaga tgatgtgtgt catgtcaaca 2580

gaggaagcag agttcagcca tgaatggaca accggtgagt ggaaggtgga agtgaatttt 2640

gatagcgaag agattctact agattatgca tctcaggtgg aatcagattg gccgcttaca 2700

catggtcaat ttttctctat tttgccgatt tatgattcag gtggatactt agagaaagtg 2760

tatcaaactg ctaaatcggt agaagcccaa acgttccacg atgcgatttg tgcccttatc 2820

gtagaagagc tgtttgaata tgcaggcaaa tggcgtaata ttcgtgtgca aggaccgaca 2880

acatttctac catccttgac tgtacaggta gcaatggcag gtgccatgtt gattggtctg 2940

catcatcgca tctgttatac gacgagcgct tcggtcttaa ctgaagcagt taagcaatca 3000

gatcttcctt caggttatga ccatctgtgc cagttcgtaa tgtctggtca actttccgac 3060

tctgagaaac ttctggaatc gctagagaat ttctggaatg ggattcagga gtggacagaa 3120

cgacacggat atatagtgga tgtgtcaaaa cgcataccat tttgaacgat gacctctaat 3180

aattgttaat catgttggtt acgtatttat taacttctcc tagtattagt aattatcatg 3240

gctgtcatgg cgcattaacg gaataaaggg tgtgcttaaa tcgggcctgc atgacgaaag 3300

ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg 3360

tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 3420

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 3480

aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtccccc ttattccctt ttttgcggca 3540

ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 3600

cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 3660

agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 3720

gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 3780

cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 3840

gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 3900

ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 3960

gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 4020

gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 4080

cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 4140

ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 4200

gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 4260

gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 4320

gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 4380

ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 4440

gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 4500

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 4560

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 4620

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 4680

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 4740

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 4800

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 4860

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 4920

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 4980

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 5040

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 5100

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcca 5160

tgcaggctga ataaaagata cgagagacct ctcttgtatc ttttttattt tgagtggttt 5220

tgtccgttac actagaaaac cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt 5280

tcggtaagct agacaaaacg gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt 5340

tttgagtgat cttctcaaaa aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag 5400

agcaaaaccc ccctttgctg aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt 5460

aaaaaaaaga aaggtcttaa aggttttatg gttttggtcg gcactgccga cagcctcgca 5520

gagcacacac 5530