本發(fā)明涉及一種多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途，特別涉及一種將Csy4蛋白應(yīng)用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)中以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)切割的系統(tǒng)及其用途。

背景技術(shù)：

高等生物通常都有復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)來確保細(xì)胞內(nèi)的生物活動有條不紊的進(jìn)行，因此利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行多靶點(diǎn)編輯對于遺傳工程的研究和應(yīng)用具有重大意義。多靶點(diǎn)編輯不僅可以提高對基因組某一個(gè)序列的突變效率，實(shí)現(xiàn)片段缺失或重復(fù)，同時(shí)對某個(gè)代謝途徑進(jìn)行多基因敲除還有助于闡明相關(guān)基因的功能。

實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)編輯需要有Cas9和多個(gè)靶向不同位點(diǎn)的獨(dú)立sgRNA存在。傳統(tǒng)的方法通過顯微注射或者表達(dá)包含多個(gè)單一gRNA(sgRNA)的表達(dá)盒來實(shí)現(xiàn)。將體外表達(dá)的gRNA和Cas9蛋白(或者Cas9的mRNA)注射到細(xì)胞或者胚胎只適用于很少的一些系統(tǒng)，將多個(gè)sgRNA的表達(dá)盒壓縮到一個(gè)載體上以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)切割主要有兩種方式：1)使用多個(gè)RNA聚合酶啟動子同時(shí)驅(qū)動多個(gè)sgRNA表達(dá)盒，分別轉(zhuǎn)錄出對應(yīng)的sgRNA序列，以實(shí)現(xiàn)對靶序列進(jìn)行切割。典型的sgRNA的表達(dá)盒大約是400-500bp，包含RNA聚合酶III型(Pol III)的啟動子，sgRNA和Pol III終止子；由于目前已知有功能的RNA聚合酶III型啟動子較少，若一個(gè)載體中需要同時(shí)轉(zhuǎn)錄3個(gè)以上的靶點(diǎn)，必然會重復(fù)使用RNA聚合酶III型啟動子(U3或U6)，因重復(fù)序列的存在將可能導(dǎo)致基因組發(fā)生同源重組。另外，受質(zhì)粒載體承載能力的限制，同時(shí)表達(dá)多個(gè)sgRNA表達(dá)盒也將增加載體構(gòu)建的難度，而且，真核生物III型聚合酶轉(zhuǎn)錄的RNA需要有一個(gè)特定的核苷酸開始，這使得Cas9/gRNA的靶位點(diǎn)受限。2)將多個(gè)sgRNA通過一些識別序列或自切割連接，借用蛋白切割對應(yīng)序列，釋放出帶有不同靶點(diǎn)的獨(dú)立sgRNA序列，實(shí)現(xiàn)對應(yīng)靶序列的切割。一個(gè)成功的案例是利用tRNA剪切系統(tǒng)——多個(gè)sgRNA可以由一個(gè)tRNA-gRNA結(jié)構(gòu)的合成基因通過真核生物體內(nèi)的Rnase的精確剪切產(chǎn)生，借用真核生物體內(nèi)的Rnase系統(tǒng)進(jìn)行切割，另一個(gè)案例是來源于病毒的HH和HDV自切割序列。前者(tRNA剪切系統(tǒng))是一種相對高效的多靶點(diǎn)切割方式，而后者(HH和HDV自切割序列)的多靶點(diǎn)載體構(gòu)建過程比較復(fù)雜，一般不采用(Kabin Xie，2015；Yangbin Gao，2014)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基因組修飾系統(tǒng)及其用途，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中需通過多基因敲除來闡明相關(guān)基因功能等技術(shù)難題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)，包括a)和b)：

a)Csy4蛋白和Cas9蛋白；

b)由Csy4切割識別序列間隔串聯(lián)兩個(gè)或兩個(gè)以上包含目標(biāo)靶位點(diǎn)序列的sgRNA。

進(jìn)一步地，所述Csy4蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

所述Cas9蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

所述Csy4切割識別序列具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

更進(jìn)一步地，編碼所述Csy4蛋白的核苷酸序列與編碼所述Cas9蛋白的核苷酸序列有效連接。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，編碼所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)中a)的核苷酸序列有效連接于第一調(diào)控序列。

優(yōu)選地，所述第一調(diào)控序列包括Ⅱ型啟動子和/或定位結(jié)構(gòu)域。

具體地，所述Ⅱ型啟動子包括花椰菜花葉病毒35S啟動子或泛素啟動子。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，編碼所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)中b)的核苷酸序列有效連接于第二調(diào)控序列。

優(yōu)選地，所述第二調(diào)控序列包括Ⅲ型啟動子。

具體地，所述Ⅲ型啟動子包括U6啟動子或U3啟動子。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，包含編碼所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)的核苷酸序列。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)編輯的方法，包括在生物體中表達(dá)所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種編輯靶位點(diǎn)序列或的方法，包括將所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)導(dǎo)入包含靶位點(diǎn)序列的生物體中。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種提高多靶點(diǎn)編輯效率的方法，包括將所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)導(dǎo)入生物體基因組。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生多靶點(diǎn)編輯的植物的方法，包括向植物基因組中引入編碼所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)的核苷酸序列。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生多靶點(diǎn)編輯植物種子的方法，包括將所述方法產(chǎn)生的多靶點(diǎn)編輯的植物自交，從而獲得具有多靶點(diǎn)編輯植物種子。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培育多靶點(diǎn)編輯植物的方法，包括：

種植至少一粒所述多靶點(diǎn)編輯植物種子；

使所述種子長成植株。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)在獲得多靶點(diǎn)突變生物中的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)，用于實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)編輯。

本發(fā)明中所述的CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，是指成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，含有多個(gè)短同向重復(fù)的基因座，其被發(fā)現(xiàn)存在于約40％測序細(xì)菌的基因組中和90％測序古細(xì)菌的基因組中。CRISPR作為原核的免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能，其賦予對外來遺傳元件例如質(zhì)粒和噬菌體的抵抗性。CRISPR系統(tǒng)提供了一種獲得性免疫形式。外源DNA的短片段(稱為間隔區(qū))整合在CRISPR重復(fù)序列之間的基因組中，然后CRISPR間隔區(qū)以類似于真核生物中RNAi的方式用于識別和沉默外來遺傳元件。

本發(fā)明中所述的Cas9，Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中一種重要的蛋白質(zhì)成分，可以從生物體如鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)，優(yōu)選釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)中分離得到。當(dāng)Cas9與稱為CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(TracrRNA)的兩個(gè)RNA復(fù)合時(shí)，形成活性核酸內(nèi)切酶，從而切斷入侵噬菌體或質(zhì)粒中的外源遺傳元件，以保護(hù)宿主細(xì)胞。crRNA從宿主基因組中的CRISPR元件轉(zhuǎn)錄，其中該CRISPR元件之前自外源入侵物捕獲。研究表明通過融合crRNA和tracrRNA的必要部分產(chǎn)生的單鏈嵌合RNA可以取代Cas9/RNA復(fù)合體中的兩個(gè)RNA以形成功能性核酸內(nèi)切酶。Cas9蛋白質(zhì)的變體可以是Cas9的突變體形式，其中催化性天冬氨酸殘基改變?yōu)槿魏纹渌被?。?yōu)選地，所述其它氨基酸可以是丙氨酸。

本發(fā)明中所述的向?qū)NA或引導(dǎo)RNA(guide RNA，gRNA)，也稱為小向?qū)NA(small guide RNA，sgRNA)，作用于動質(zhì)體(kinetoplastid)體內(nèi)一種稱為RNA編輯(RNA editing)的后轉(zhuǎn)錄修飾過程中，也是一種小型非編碼RNA?？膳cpre-mRNA配對，并在其中插入一些尿嘧啶(U)，產(chǎn)生具有作用的mRNA。向?qū)NA編輯的RNA分子，長度大約是60-80個(gè)核苷酸，是由單獨(dú)的基因轉(zhuǎn)錄的，在gRNA的5’末端有一段錨定區(qū)，以特殊的G-U配對方式與非編輯的pre-mRNA序列互補(bǔ)，錨定序列促進(jìn)gRNA與pre-mRNA中的編輯區(qū)互補(bǔ)，特意結(jié)合；在gRNA分子的中間部位有一個(gè)編輯區(qū)負(fù)責(zé)在被編輯的pre-mRNA分子中插入U(xiǎn)的位置，其與被編輯mRNA精確互補(bǔ)；在gRNA分子的3’末端，有一段轉(zhuǎn)錄后加入的由大約15個(gè)非編碼的PolyU序列，功能為把gRNA鏈接到pre-mRNA的編輯區(qū)的5’上游富含嘌呤堿基的核苷酸序列上。在編輯時(shí)，形成一個(gè)編輯體(editosome)，以gRNA內(nèi)部的序列作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物的校正，同時(shí)產(chǎn)生編輯的mRNA。

有三種類型CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中涉及Cas9蛋白質(zhì)和crRNA、tracrRNA的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)是代表性的。Cas9蛋白質(zhì)通過人工修飾的向?qū)NA的導(dǎo)向作用可以打靶DNA序列的5’-N20-NGG-3’(N代表任何脫氧核苷酸堿基)，N20是與gRNA的5’序列相同的20個(gè)堿基，NGG是PAM區(qū)(原型間隔子鄰近基序，Protospacer-adjacent motif)。Cas9剪切的位點(diǎn)就是PAM附近的區(qū)域。相對于鋅指和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物DNA結(jié)合蛋白提供了優(yōu)勢-因?yàn)樵诤塑账峤Y(jié)合CRISPR-Cas蛋白中的位點(diǎn)特異性由RNA分子調(diào)控而不是DNA結(jié)合蛋白調(diào)控。

本發(fā)明中所述重組，當(dāng)用于例如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過引入異源核酸或蛋白質(zhì)、或改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或該細(xì)胞源自此修飾的細(xì)胞。

本發(fā)明中向?qū)NA可以以編碼該向?qū)NA的RNA或DNA的形式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或生物體中。向?qū)NA可以是分離的RNA、并入病毒載體的RNA的形式、或者在載體中編碼。優(yōu)選地，載體可以是病毒載體、質(zhì)粒載體、或農(nóng)桿菌載體。

編碼向?qū)NA的DNA可以是包含編碼向?qū)NA序列的載體。例如，可以通過用分離的向?qū)NA或包含編碼向?qū)NA的序列和啟動子的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞或生物體，將向?qū)NA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或生物體。

本發(fā)明中所述切割或剪切是指核苷酸分子共價(jià)骨架的斷裂。向?qū)NA可以制備為特異于任何待切割的靶，通過向?qū)NA的靶特異性部分切割任何靶DNA。

本發(fā)明中，所述串聯(lián)是指將二個(gè)或二個(gè)以上向?qū)NA(sgRNA)排成一串，每個(gè)sgRNA的首端和前一個(gè)sgRNA的尾端由Csy4切割識別序列連接。

本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。

本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。

如本申請，包括權(quán)利要求中使用的，除非上下文中清楚地另有說明，否則單數(shù)和單數(shù)形式的術(shù)語，例如“一”、“一個(gè)”和“該”，包括復(fù)數(shù)指代物。因此，例如“植物”、“該植物”或“一個(gè)植物”也指示多個(gè)植物。并且根據(jù)上下文，使用術(shù)語“植物”還可指示該植物在遺傳上相似或相同的后代。類似地，術(shù)語“核酸”可以指核酸分子的許多拷貝。類似地，術(shù)語“探針”可以指代相同或相似的探針分子。

數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字，并明確地包括所限定的范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)和非整數(shù)分?jǐn)?shù)。除非另外指出，否則本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。

本發(fā)明中，術(shù)語“核酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用，它們是指具有任何長度的核苷酸的聚合形式，根據(jù)上下文含義，可指代DNA或RNA、或其類似物。其中DNA包括但不限于cDNA、基因組DNA、合成DNA(例如人工合成)和含核酸類似物的DNA(或RNA)。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以執(zhí)行已知或未知的任何功能。核酸可為雙鏈或單鏈(既有義鏈或反義單鏈)。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物、以及核酸類似物。

本發(fā)明中“野生型”表示生物、菌株、基因的典型形式或者當(dāng)它在自然界存在時(shí)區(qū)別于突變體或變體形式的特征。

本發(fā)明中“突變體”或“變體”是指發(fā)生突變的個(gè)體，其具有與野生型不同的序列，可能會導(dǎo)致其中序列的至少部分功能已丟失的序列，例如，在啟動子或增強(qiáng)子區(qū)域中序列的變化將至少部分地影響生物體中編碼序列的表達(dá)。術(shù)語“突變”是指可由諸如缺失、添加、取代或重排引起的核酸序列中序列的任何變化。突變還可影響該序列參與的一個(gè)或多個(gè)步驟。例如，DNA序列中的變化可導(dǎo)致有活性的、有部分活性的或無活性的改變的mRNA和/或蛋白的合成。

本發(fā)明中“非天然存在的”表明人工的參與。當(dāng)指核酸分子或多肽時(shí)，表示該核酸分子或多肽至少基本上從它們在自然界中或如發(fā)現(xiàn)于自然界中的與其結(jié)合的至少另一種組分游離出來。

本發(fā)明中“表達(dá)”指感興趣的序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生對應(yīng)mRNA并且該mRNA翻譯產(chǎn)生對應(yīng)產(chǎn)物，即肽、多肽或蛋白。調(diào)節(jié)元件控制或調(diào)整感興趣的序列表達(dá)，所述調(diào)節(jié)元件包括5’調(diào)節(jié)元件如啟動子。

本發(fā)明中“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地使用，是指具有任何長度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，它可以包含修飾的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中斷。這些術(shù)語還涵蓋已經(jīng)被修飾的氨基酸聚合物；這些修飾例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作，如與標(biāo)記組分的結(jié)合。術(shù)語“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光異構(gòu)體、以及氨基酸類似物和肽模擬物。

本發(fā)明中術(shù)語“載體”是指能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的DNA分子。質(zhì)粒和粘粒是示例性載體。此外，術(shù)語“載體”和“媒介”可互換使用以指將DNA片段從一種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一種細(xì)胞的核酸分子，因此細(xì)胞不必要屬于相同的生物(例如將DNA片段從農(nóng)桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞)。

本發(fā)明中術(shù)語“表達(dá)載體”是指含有所需要的編碼序列和在特定宿主生物中表達(dá)有效連接的編碼序列所需要的適宜核酸序列的重組DNA分子。

本發(fā)明中術(shù)語“重組表達(dá)載體”指來自任何來源、能夠整合入基因組或自主復(fù)制的任何因子如質(zhì)粒、粘粒、病毒、BAC(細(xì)菌人工染色體)、自主復(fù)制型序列、噬菌體、或者線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列，包括其中一種或多種DNA序列使用眾所周知的重組DNA技術(shù)以功能性可操作方式連接的DNA分子。

在本發(fā)明中，“定位結(jié)構(gòu)域”可任選地添加為蛋白部分的部分，定位結(jié)構(gòu)域可將蛋白部分或編程的蛋白部分或組裝的復(fù)合物定位至活細(xì)胞中特定細(xì)胞或亞細(xì)胞定位。定位結(jié)構(gòu)域可通過將蛋白部分的氨基酸序列融合到摻入包括以下結(jié)構(gòu)域的氨基酸來構(gòu)建：核定位信號(NLS)；線粒體前導(dǎo)序列(MLS)；葉綠體前導(dǎo)序列；和/或被設(shè)計(jì)以將蛋白運(yùn)輸或引導(dǎo)或定位至含有核酸的細(xì)胞器、細(xì)胞區(qū)室或細(xì)胞的任何細(xì)分部分的任何序列。在一些實(shí)施方案中，生物體是真核生物，且定位結(jié)構(gòu)域包括允許蛋白進(jìn)入細(xì)胞核和基因組DNA內(nèi)的核定位結(jié)構(gòu)域(NLS)。所述NLS的序列可包括帶正電荷序列的任何功能NLS。在另一些實(shí)施方案中，定位結(jié)構(gòu)域可包括使蛋白部分或編程的核蛋白進(jìn)入細(xì)胞器的前導(dǎo)序列，使細(xì)胞器DNA被修飾成為可能。

本發(fā)明中，真核生物有3類RNA聚合酶，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄3類不同的啟動子。由RNA聚合酶I負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的rRNA基因，啟動子(I型)比較單一，由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的兩部分序列構(gòu)成：第一部分是核心啟動子(core promoter)，由-45—+20位核苷酸組成，單獨(dú)存在時(shí)就足以起始轉(zhuǎn)錄；另一部分由-170—-107位序列組成，稱為上游調(diào)控元件，能有效地增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率。

由RNA聚合酶Ⅲ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的是5S rRNA、tRNA和某些核內(nèi)小分子RNA(snRNA)，其啟動子(Ⅲ型)組成較復(fù)雜，又可被分為兩個(gè)亞類：一類屬于結(jié)構(gòu)基因內(nèi)啟動子，一類屬于結(jié)構(gòu)基因外啟動子。內(nèi)啟動子的有效啟動依賴于基因內(nèi)部包含的兩個(gè)不連續(xù)的DNA片段，這兩個(gè)DNA片段包括一些不同的連續(xù)DNA序列A、B或C區(qū)，兩個(gè)區(qū)之間被隔開。根據(jù)兩個(gè)區(qū)的不同組合，可以分為I類和II類兩種：I類包括A和C區(qū)，目前發(fā)現(xiàn)其僅存在于5S rRNA的基因中；II類包括A和B區(qū)，存在于tRNA的基因、7SLRNA的基因、腺病毒VAI與VAII的RNA中。A、B或A、C內(nèi)部DNA序列是轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA和TFⅢC轉(zhuǎn)錄啟動結(jié)合部位。在多數(shù)情況下，5’端還會有其它調(diào)節(jié)或關(guān)鍵元件，這些元件對RNA的高效轉(zhuǎn)錄是必需的。這些序列的存在與否之間影響著轉(zhuǎn)錄效率。這些序列呈現(xiàn)復(fù)雜的多樣性，不過大多數(shù)啟動子5’端-30到-20處存在著TATA盒樣序列，與外啟動子相似。外啟動子缺乏相應(yīng)的內(nèi)部序列，僅在5’端有順式作用元件，在基因的末端有一組由4個(gè)或更多胸腺嘧啶組成的終止信號，如脊椎動物U6核小RNA和7SK RNA啟動子，這些啟動子都高度相似或完全相同，其位置和堿基序列高度保守，其結(jié)構(gòu)與pol II啟動子也有一定的相似性。它們的5’端順式作用元件包括幾個(gè)控制元件，在其上游約-30處存在一個(gè)TATA樣序列，近-60處有一個(gè)snRNA PSE(snRNA近似序列)和一個(gè)或多個(gè)被稱為OCT的修飾序列5’-ATGCAAAT-3’。TATA樣序列是pol III對snRNA基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄特異的。TATA樣元件和PSE元件共同決定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的選擇和轉(zhuǎn)錄效率。TATA樣元件和PSE元件之間的距離決定了RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的特異性，但似乎TATA樣元件更重要，因?yàn)樵赑SE缺失的U6RNA和7SK RNA基因轉(zhuǎn)錄中，只有轉(zhuǎn)錄效率的下降。而且，PSE元件可能和B盒(boxB)相關(guān)，B盒在一定程度上可以替代PSE元件。這些序列對下游基因的轉(zhuǎn)錄具有決定性的作用，而且它們與起始位點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，往往超過150bp，而對pol III內(nèi)啟動子來說，一般在80bp以內(nèi)；與pol III外啟動子相比，pol II啟動子5’端各順式作用元件的作用剛好相反，如果TATA樣元件缺失，PSE則可以履行TATA樣元件功能，決定轉(zhuǎn)錄的起始部位。在PSE上游，外啟動子還有一個(gè)遠(yuǎn)端控制序列，其結(jié)構(gòu)與pol II增強(qiáng)子OCT骨架相似，但較其復(fù)雜。而在-223處還有一個(gè)CACC序列與OCT骨架相連。這些遠(yuǎn)端控制序列的存在可大大提高U6RNA和7SK RNA的表達(dá)效率。

由RNA聚合酶II負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的II型基因包括所有蛋白質(zhì)編碼基因和部分snRNA基因，后者的啟動子結(jié)構(gòu)與III型基因啟動子中的第三亞類相似，編碼蛋白質(zhì)的II型基因啟動子在結(jié)構(gòu)上有共同的保守序列。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)沒有廣泛的序列同源性，但第一個(gè)堿基為腺嘌呤，而兩側(cè)是嘧啶堿基。這個(gè)區(qū)域被稱為起始子(initiator，Inr)，序列可表示為Py2CAPy5。Inr元件位于-3—+5。僅由Inr元件組成的啟動子是具有可被RNA聚合酶II識別的最簡單啟動子形式。多數(shù)II型啟動子有一個(gè)被稱為TATA盒的共有序列，通常處于-30區(qū)，相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置比較固定。TATA盒存在于所有真核生物中，TATA盒是一個(gè)保守的七堿基對，也有一些II型啟動子不含有TATA盒，這樣的啟動子稱為無TATA盒啟動子。

本發(fā)明中所述“有效連接”或“可操作地連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)“有效連接”表示：啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)、整合酶識別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。

本發(fā)明中，調(diào)節(jié)元件可操作地連接至CRISPR系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)元件，從而驅(qū)動該CRISPR系統(tǒng)的所述一個(gè)或多個(gè)元件的表達(dá)。一般而言，CRISPR(規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù))，也稱為SPIDR(Spacer間隔開的同向重復(fù))，構(gòu)成通常對于特定細(xì)菌物種而言特異性的DNA基因座的家族。該CRISPR座位包含在大腸桿菌中被識別的間隔開的短序列重復(fù)(SSR)的一個(gè)不同類、以及相關(guān)基因。類似的間隔開的SSR已經(jīng)鑒定于地中海富鹽菌、化膿鏈球菌、魚腥草屬和結(jié)核分枝桿菌中。這些CRISPR座位典型地不同于其它SSR的重復(fù)結(jié)構(gòu)，這些重復(fù)已被稱為規(guī)律間隔的短重復(fù)(SRSR)。一般而言，這些重復(fù)是以簇存在的短元件，其被具有基本上恒定長度的獨(dú)特間插序列規(guī)律地間隔開。雖然重復(fù)序列在菌株之間是高度保守的，許多間隔開的重復(fù)和這些間隔區(qū)的序列一般在菌株與菌株之間不同，已經(jīng)在40種以上的原核生物中鑒定出CRISPR座位。

本發(fā)明中，“靶序列”或“靶點(diǎn)序列”或“靶位點(diǎn)序列”或“靶多核苷酸”是待被作用的任何期望的預(yù)定的核酸序列，包括但不限于編碼或非編碼序列、基因、外顯子或內(nèi)含子、調(diào)節(jié)序列、基因間序列、合成序列和細(xì)胞內(nèi)寄生物序列。在一些實(shí)施方案中，靶序列存在于靶細(xì)胞、組織、器官或生物體內(nèi)。

術(shù)語“引物”是一段分離的核酸分子，其通過核酸雜交，退火結(jié)合到互補(bǔ)的目標(biāo)DNA鏈上，在引物和目標(biāo)DNA鏈之間形成雜合體，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目標(biāo)DNA鏈延伸。本發(fā)明的引物對涉及其在目標(biāo)核酸序列擴(kuò)增中的應(yīng)用，例如，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其他常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法。

引物的長度一般是11個(gè)多核苷酸或更多，優(yōu)選的是18個(gè)多核苷酸或更多，更優(yōu)選的是24個(gè)多核苷酸或更多，最優(yōu)選的是30個(gè)多核苷酸或更多。這種引物在高度嚴(yán)格雜交條件下與目標(biāo)序列特異性地雜交。盡管不同于目標(biāo)DNA序列且對目標(biāo)DNA序列保持雜交能力的引物是可以通過常規(guī)方法設(shè)計(jì)出來的，但是，優(yōu)選的，本發(fā)明中的引物與目標(biāo)序列的連續(xù)核酸具有完全的DNA序列同一性。

本發(fā)明的引物在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)DNA序列雜交。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。如本發(fā)明使用的，如果兩個(gè)核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個(gè)核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。如本發(fā)明使用的，當(dāng)一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱這兩個(gè)核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

如本發(fā)明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45℃條件下用6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50℃條件下用2.0×SSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0×SSC、50℃到高度嚴(yán)格條件的約0.2×SSC、50℃。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22℃，升高到高度嚴(yán)格條件的約65℃。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個(gè)保持不變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明的一個(gè)核酸分子可以在中度嚴(yán)格條件下，例如在約2.0×SSC和約65℃下與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中一個(gè)或多個(gè)核酸分子或其互補(bǔ)序列，或者上述序列的任一片段發(fā)生特異性雜交。更優(yōu)選地，本發(fā)明的一個(gè)核酸分子在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中一個(gè)或多個(gè)核酸分子或其互補(bǔ)序列，或者上述序列的任一片段發(fā)生特異性雜交。本發(fā)明中，優(yōu)選的標(biāo)記物核酸分子具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互補(bǔ)序列，或者上述序列的任一片段。本發(fā)明另一優(yōu)選的標(biāo)記物核酸分子與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互補(bǔ)序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2可以用作植物育種方法中的標(biāo)記物以鑒定遺傳雜交的后代。探針與目標(biāo)DNA分子的雜交可以通過任何一種為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進(jìn)行檢測，這些方法包括但不限于，熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、抗體類標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。

關(guān)于使用特定的擴(kuò)增引物對目標(biāo)核酸序列進(jìn)行的擴(kuò)增(例如，通過PCR)，“嚴(yán)格條件”指的是在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中僅允許引物對目標(biāo)核酸序列發(fā)生雜交的條件，具有與目標(biāo)核酸序列相應(yīng)的野生型序列(或其互補(bǔ)序列)的引物，能夠與所述目標(biāo)核酸序列結(jié)合，并且優(yōu)選產(chǎn)生唯一的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物即擴(kuò)增子。

術(shù)語“特異性結(jié)合(目標(biāo)序列)”是指在嚴(yán)格雜交條件下引物僅與包含目標(biāo)序列的樣品中的目標(biāo)序列發(fā)生雜交。

本發(fā)明中，“試劑盒”可包括本發(fā)明描述的基因組修飾系統(tǒng)與以下的任一種或全部：測定試劑、緩沖液、探針和/或引物、和無菌鹽水或另一種藥學(xué)上可接受的乳劑和懸液基底。此外，試劑盒可包括含有用于實(shí)踐本發(fā)明描述的方法的用法說明(例如，操作方案)的說明性材料。

本發(fā)明中，將外源DNA導(dǎo)入植物，如將編碼所述多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)的核苷酸序列或表達(dá)盒或重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。

本發(fā)明提供了一種多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明首次將Csy4蛋白及其對應(yīng)識別序列應(yīng)用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，利用Csy4蛋白能夠切割并識別對應(yīng)的RNA序列，使得多個(gè)sgRNA在同一個(gè)表達(dá)盒中同時(shí)轉(zhuǎn)錄后，可以被切割成獨(dú)立的片段，實(shí)現(xiàn)對基因組的多靶點(diǎn)編輯。

2、本發(fā)明為CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)編輯提供了一種新的選擇，單靶點(diǎn)的切割效率相比現(xiàn)有技術(shù)tRNA剪切系統(tǒng)明顯提高，同時(shí)對由多靶點(diǎn)切割引起的片段缺失效率也較tRNA剪切系統(tǒng)高。

下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的重組克隆剪刀載體構(gòu)建流程圖；

圖2為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的重組表達(dá)載體DBN-剪刀構(gòu)建流程圖；

圖3為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET344構(gòu)建流程圖；

圖4為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET372結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET371結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草植株葉片的GUS染色圖；

圖7為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草植株葉片的GUS活性值對比圖；

圖8為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET373結(jié)構(gòu)示意圖；

圖9為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的水稻品種日本晴基因Os03G17700上四個(gè)靶點(diǎn)的相對位置示意圖；

圖10為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET374結(jié)構(gòu)示意圖；

圖11為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET375結(jié)構(gòu)示意圖；

圖12為本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的檢測片段缺失效率中擴(kuò)增區(qū)域和引物相對位置示意圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)及其用途的技術(shù)方案。

第一實(shí)施例、玉米靶位點(diǎn)的選擇

根據(jù)Cas9蛋白識別PAM序列(NGG/NGGNG)的原則，在CRISPRDirect網(wǎng)站(http://crispr.dbcls.jp/)篩選到來源于玉米的一個(gè)靶位點(diǎn)序列(20bp)，即45CS1靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:1所示。

第二實(shí)施例、剪刀載體的構(gòu)建

1、構(gòu)建基礎(chǔ)載體和重組克隆剪刀載體

將pCAMBIA2300(CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供)載體進(jìn)行改造，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通過點(diǎn)突變?nèi)サ魀CAMBIA2300載體上的BsaI位點(diǎn)，同時(shí)將卡那霉素表達(dá)盒去掉，得到pDBN骨架載體。向所述pDBN骨架載體引入PAT表達(dá)盒，得到表達(dá)載體DBN-PAT；向所述pDBN骨架載體引入PMI表達(dá)盒和Csy4表達(dá)盒，得到表達(dá)載體DBN-Csy4-PMI，兩者用于下述載體構(gòu)建。

將合成的Csy4-Cas9核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆剪刀載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；Csy4-Cas9為Csy4-Cas9核苷酸序列(Csy4-Cas9核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；Csy4氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，Cas9氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)；MCS為多克隆位點(diǎn))。

然后將重組克隆剪刀載體DBN01-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞、10μl質(zhì)粒DNA(重組克隆剪刀載體DBN01-T)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸浮；加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(3M醋酸鉀，5M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化RNA；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質(zhì)粒經(jīng)SnabI和SpeI酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆剪刀載體DBN01-T中插入的所述Csy4-Cas9核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，即Csy4-Cas9核苷酸序列正確插入。

2、構(gòu)建重組表達(dá)剪刀載體

用限制性內(nèi)切酶SnabI和SpeI分別酶切重組克隆剪刀載體DBN01-T和表達(dá)載體DBN-PAT，將切下的Csy4-Cas9核苷酸序列插入表達(dá)載體DBN-PAT，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN-剪刀，其構(gòu)建流程如圖2所示(RB：右邊界；pr35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID NO:5)；Csy4-Cas9：Csy4-Cas9核苷酸序列(Csy4-Cas9核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；Csy4氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，Cas9氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:6)；PAT：草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO:7)；LB：左邊界)。

將重組表達(dá)載體DBN-剪刀用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞、10μl質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體DBN-剪刀)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37℃條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SnabI和SpeI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN-剪刀在SnabI和SpeI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，即Csy4-Cas9核苷酸序列。

第三實(shí)施例、煙草靶點(diǎn)載體的構(gòu)建

本實(shí)施例中，靶點(diǎn)載體設(shè)計(jì)為prOsU6+靶位點(diǎn)+sgRNA+polyT結(jié)構(gòu)，各靶位點(diǎn)+sgRNA之間連接有Csy4切割識別序列。通過限制性內(nèi)切酶BsaI將各個(gè)片段無縫連接在一起。Csy4切割識別序列如SEQ ID NO:8所示。本實(shí)施例中使用的5個(gè)靶位點(diǎn)為：

45CS1靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:1所示；

RFP-L1靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:9所示；

RFP-L2靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:10所示；

RFP-R1靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:11所示；

RFP-R2靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:12所示。

1、單個(gè)靶位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建

45CS1正向引物：aactgtggtctccaaacCCCAAGAGCGGGCGAGGTAG，如SEQ ID NO:13所示；

45CS1反向引物：ctagatggtctcgaaaacCTACCTCGCCCGCTCTTGGG，如SEQ ID NO:14所示；

其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護(hù)堿基，斜體小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI，帶下劃線的小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI的粘性末端，正常字體大寫字母為45CS1靶位點(diǎn)序列或其反向互補(bǔ)序列。

所述45CS1正向引物和所述45CS1反向引物分別包括20bp的45CS1靶位點(diǎn)序列，二者反向互補(bǔ)，互為模板，用Pfu酶(NEB)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系如下：

PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)入下列循環(huán)：98℃變性10s，56-60℃退火30s，72℃延伸30s/kb，共30-32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5-10min；于4℃保存。

使用過柱純化試劑盒(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)對上述PCR產(chǎn)物過柱純化，具體方法參考其產(chǎn)品說明書；BsaI酶切PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體DBN-Csy4-PMI，切膠回收對應(yīng)酶切產(chǎn)物后，將酶切后的表達(dá)載體DBN-Csy4-PMI產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物按照1:10的比例用T4連接酶于溫度16℃下連接30min，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET344，其構(gòu)建流程圖如圖3所示(RB：右邊界；prOsU6：水稻U6啟動子(SEQ ID NO:16)；Csy4-R：Csy4切割識別序列(如SEQ ID NO:8所示)；45CS1：45CS1靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:1)；sgRNA：sgRNA序列(如SEQ ID NO:15所示)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:6)；pr35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID NO:5)；GUUS：含有45CS1靶位點(diǎn)序列的GUS基因(如SEQ ID NO:17所示)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:18)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQ ID NO:19)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO:20)；LB：左邊界)。

將煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET344用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞、10μl質(zhì)粒DNA(煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET344)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37℃條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)懸??；加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(3M醋酸鉀、5M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化RNA；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質(zhì)粒經(jīng)KpnI和AscI酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET344中45CS1靶位點(diǎn)序列正確插入。

2、多個(gè)靶位點(diǎn)串聯(lián)載體的構(gòu)建

按照本實(shí)施例1中的步驟和方法，以合成的sgRNA+Csy4切割識別序列為擴(kuò)增模板(擴(kuò)增體系中<250ng)，將45CS1靶位點(diǎn)序列、RFP-L1靶位點(diǎn)序列、RFP-L2靶位點(diǎn)序列、RFP-R1靶位點(diǎn)序列和RFP-R2靶位點(diǎn)序列通過下述引物帶入模板，PCR擴(kuò)增后得到含有靶位點(diǎn)序列+sgRNA+Csy4切割識別序列的產(chǎn)物，對上述PCR產(chǎn)物過柱純化，BsaI酶切PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體DBN-Csy4-PMI切膠回收對應(yīng)酶切產(chǎn)物后，將酶切后的表達(dá)載體DBN-Csy4-PMI產(chǎn)物和5個(gè)PCR產(chǎn)物片段按照1:10的比例用T4連接酶于溫度16℃下連接30min，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET372，其載體示意圖如圖4所示(RB：右邊界；prOsU6：水稻U6啟動子(SEQ ID NO:16)；Csy4-R：Csy4切割識別序列(如SEQ ID NO:8所示)；RFP-L1：RFP-L1靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:9)；RFP-L2：RFP-L2靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:10)；RFP-R1：RFP-R1靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:11)；RFP-R2：RFP-R2靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:12)；45CS1：45CS1靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:1)；sgRNA：sgRNA序列(如SEQ ID NO:15所示)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:6)；pr35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID NO:5)；GUUS：含有45CS1靶位點(diǎn)序列的GUS基因(如SEQ ID NO:17所示)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:18)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQ ID NO:19)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO:20)；LB：左邊界)。

引入RFP-L1、RFP-L2、RFP-R1、RFP-R2和45CS1靶位點(diǎn)的4對引物如下：

引物F1：aactgtggtctccaaacgacgttctcggaggaggccagttttagagctagaaata，如SEQ ID NO:21所示；

引物R1：ctagatggtctcgcaccttgaagcgctgcctatacggcagtgaacgcaccgactcggtgc，如SEQ ID NO:22所示；

引物F2：aactgtggtctccggtgcgcatggagttttagagctagaaata，如SEQ ID NO:23所示；

引物R2：ctagatggtctcgcccggctactacctgcctatacggcagtgaacgcaccgactcggtgcc，如SEQ ID NO:24所示；

引物F3：aactgtggtctcccgggcagctgcagttttagagctagaaatag，如SEQ ID NO:25所示；

引物R3：ctagatggtctcgggaggtgatgtccctgcctatacggcagtgaacgcaccgactcggtgcca，如SEQ ID NO:26所示；

引物F4：aactgtggtctccctcccacaacggttttagagctagaaatagcaag，如SEQ ID NO:27所示；

引物R4：ctagatggtctcgaaaacctacctcgcccgctcttgggctgcctatacggcagtgaacgcac，如SEQ ID NO:28所示；

其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護(hù)堿基，斜體小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI，帶下劃線的小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI的粘性末端。

按照本實(shí)施例1中的方法，將煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET372用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌；提取的質(zhì)粒經(jīng)KpnI和AscI酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET372中5個(gè)靶點(diǎn)(RFP-L1靶位點(diǎn)+RFP-L2靶位點(diǎn)+RFP-R1靶位點(diǎn)+RFP-R2靶位點(diǎn)+45CS1靶位點(diǎn))正確插入。

按照上述構(gòu)建煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET372的方法，將RFP-L1靶位點(diǎn)、RFP-L2靶位點(diǎn)和45CS1靶位點(diǎn)插入表達(dá)載體DBN-Csy4-PMI，得到煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET371。酶切和測序驗(yàn)證煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET371中3個(gè)靶點(diǎn)(RFP-L1靶位點(diǎn)+RFP-L2靶位點(diǎn)+45CS1靶位點(diǎn))正確插入，煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET371的載體示意圖如圖5所示(RB：右邊界；prOsU6：水稻U6啟動子(SEQ ID NO:16)；Csy4-R：Csy4切割識別序列(如SEQ ID NO:8所示)；RFP-L1：RFP-L1靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:9)；RFP-L2：RFP-L2靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:10)；45CS1：45CS1靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:1)；sgRNA：sgRNA序列(如SEQ ID NO:15所示)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:6)；pr35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID NO:5)；GUUS：含有45CS1靶位點(diǎn)序列的GUS基因(如SEQ ID NO:17所示)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:18)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQ ID NO:19)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO:20)；LB：左邊界)。

第四實(shí)施例、剪刀載體和煙草靶點(diǎn)載體共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN-剪刀分別與DBN-GET344、DBN-GET371和DBN-GET372用液氮法共轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μL農(nóng)桿菌GV3101、3μL質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體)；置于液氮中5分鐘，37℃溫水浴5分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌GV3101接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN-剪刀、DBN-GET344、DBN-GET371和DBN-GET372結(jié)構(gòu)完全正確。

第五實(shí)施例、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草植株的獲得

活化菌液：用含有DBN-剪刀和DBN-靶點(diǎn)(DBN-GET344、DBN-GET371或DBN-GET372)的GV3101菌種劃線，按照1:50的比例將溫度-80℃凍存菌液(GV3101)接種至1ml含50mg/L利福平(Rifampicin)和50mg/L卡那霉素的YEP培養(yǎng)基(牛肉浸膏10g/L、酵母提取液10g/L、NaCl 5g/L，pH7.0)中；約20h后，按照1:100的比例，將上述培養(yǎng)菌液增加至4ml，并于溫度28℃下過夜培養(yǎng)16-18h(OD₆₀₀值約為2)，而后在轉(zhuǎn)速為8000rpm條件下離心4min，棄上清，用10mM MgCl₂將棄上清后的菌液濃度調(diào)至OD₆₀₀＝1；加入終濃度為10mM的2-嗎啉乙磺酸(MES，pH5.6)，然后加入終濃度為200μM的乙酰丁香酮(AS)，室溫靜止放置3小時(shí)后獲得侵染液。用不帶針頭的注射器將侵染液注射進(jìn)煙草葉片(6-8周)，并黑暗處理48-72h。對瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草植株取樣進(jìn)行定量檢測。

第六實(shí)施例、多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)在報(bào)告基因中的功能驗(yàn)證

分別取瞬時(shí)轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)入DBN-GET344(1靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、轉(zhuǎn)入DBN-GET371(3靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、轉(zhuǎn)入DBN-GET372(5靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株和空載體對照煙草植株作為樣品，參照J(rèn)efferson等(Jefferson,R.A.,Kavanagh,T.A.and Bevan,M.W.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.,1987,3901-3907)的方法，用4-甲基傘形酮(4-MU)通過熒光法測定GUS活性，即45CS1靶位點(diǎn)序列被切割后使GUUS恢復(fù)GUS染色，同時(shí)以野生型煙草植株作為負(fù)對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

測定GUS活性的具體方法如下：

步驟1、分別稱取轉(zhuǎn)入DBN-GET344(1靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、轉(zhuǎn)入DBN-GET371(3靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、轉(zhuǎn)入DBN-GET372(5靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、空載體對照煙草植株和野生型煙草植株(6葉期)的新鮮葉片各20mg，用植物總蛋白提取試劑盒(采購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取上述樣品的葉片總蛋白，具體方法參考其產(chǎn)品說明書；

步驟2、在溫度4℃、轉(zhuǎn)速13000rpm下離心10min后，收集上清液，并置4℃下保存；

步驟3、在250μl預(yù)熱(37℃、至少30min)的反應(yīng)緩沖液(50mM Na₃PO₄(pH7.0)、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、10mM EDTA、0.1％十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)、0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、1mM 4-甲基傘形酮酰-β-葡萄糖苷酸(MUG))中加入50μl所述上清液，混勻，于溫度37℃下反應(yīng)15min后，取出30μl加入到270μl反應(yīng)終止液(2％(m/v)碳酸鈉)中終止反應(yīng)；

步驟4、制作4-MU的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0、50、100、250、500、1000、1500和2000pmol 4-MU稀釋于2％碳酸鈉)，用SpectraMax M2測定各樣品的Ex365/Em455值。

轉(zhuǎn)基因煙草植株GUS活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和圖7所示。分別測得轉(zhuǎn)入DBN-GET344(1靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、轉(zhuǎn)入DBN-GET371(3靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、轉(zhuǎn)入DBN-GET372(5靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、空載體對照煙草植株(NG)和野生型煙草植株(WT)的GUS活性值(pmol 4-MU/mg蛋白/min)為527.72、454.56、567.00、0和0。同時(shí)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，轉(zhuǎn)入DBN-GET344(1靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、轉(zhuǎn)入DBN-GET371(3靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、轉(zhuǎn)入DBN-GET372(5靶點(diǎn))+剪刀的煙草植株、空載體對照煙草植株(NG)和野生型煙草植株(WT)的GUS活性值的排序與其GUS染色面積的排序相對應(yīng)。

綜上所述，當(dāng)45CS1靶位點(diǎn)分別位于不同多靶點(diǎn)載體的第一、三和五位時(shí)，Csy4蛋白均能識別并切割其對應(yīng)序列，45CS1靶位點(diǎn)序列可被有效切割，使含有45CS1靶位點(diǎn)序列的GUUS恢復(fù)GUS染色；且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GUS活性與染色結(jié)果無明顯差異，說明Csy4蛋白可以應(yīng)用于多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)，識別并切割其對應(yīng)序列，從而指導(dǎo)Cas9蛋白打靶多個(gè)靶位點(diǎn)，且同一靶位點(diǎn)在不同位置的打靶效率無顯著差異。

第七實(shí)施例、水稻靶位點(diǎn)的選擇

根據(jù)Cas9蛋白識別PAM序列(NGG/NGGNG)的原則，在CRISPRDirect網(wǎng)站(http://crispr.dbcls.jp/)篩選到來源于水稻的三個(gè)靶位點(diǎn)序列(20bp)，即BADH2靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:29所示；CAS002靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:30所示；CAS003靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:31所示。

第八實(shí)施例、水稻靶點(diǎn)載體的構(gòu)建

本實(shí)施例中，靶點(diǎn)載體設(shè)計(jì)為prOsU6+靶位點(diǎn)+sgRNA+polyT結(jié)構(gòu)，各靶位點(diǎn)+sgRNA之間連接有Csy4切割識別序列。通過限制性內(nèi)切酶BsaI將各個(gè)片段無縫連接在一起。Csy4切割識別序列如SEQ ID NO:8所示。本實(shí)施例中使用的3個(gè)靶位點(diǎn)為：

BADH2靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:29所示；

CAS002靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:30所示；

CAS003靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:31所示。

按照第三實(shí)施例構(gòu)建的煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET372的方法，以合成的sgRNA+Csy4切割識別序列為擴(kuò)增模板(擴(kuò)增體系中<250ng)，將BADH2靶位點(diǎn)、CAS002靶位點(diǎn)和CAS003靶位點(diǎn)通過下述引物帶入模板，而后經(jīng)過PCR擴(kuò)增、酶切插入表達(dá)載體DBN-Csy4-PMI中，得到水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET373。酶切和測序驗(yàn)證水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET373中3個(gè)靶點(diǎn)(BADH2靶位點(diǎn)+CAS002靶位點(diǎn)+CAS003靶位點(diǎn))正確插入，水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET373的載體示意圖如圖8所示(RB：右邊界；prOsU6：水稻U6啟動子(SEQ ID NO:16)；Csy4-R：Csy4切割識別序列(如SEQ ID NO:8所示)；BADH2：BADH2靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:29)；CAS002：CAS002靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:30)；CAS003：CAS003靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:31)；sgRNA：sgRNA序列(如SEQ ID NO:15所示)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:6)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQ ID NO:19)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO:20)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:18)；LB：左邊界)。

引入BADH2、CAS002和CAS003靶位點(diǎn)的2對引物如下：

引物F5：aactgtggtctccaaactttactgggagttatgaaacgttttagagctagaaata，如SEQ ID NO:32所示；

引物R5：ctagatggtctcgaccaatgcctccctgcctatacggcagtgaacgcaccgactcggtgcc，如SEQ ID NO:33所示；

引物F6：aactgtggtctcctggtgcttcttggttttagagctagaaatag，如SEQ ID NO:34所示；

引物R6：ctagatggtctcgaaaaccggtgcatctggactcgtccctgcctatacggcagtgaacgcac，如SEQ ID NO:35所示；

其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護(hù)堿基，斜體小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI，帶下劃線的小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI的粘性末端。

第九實(shí)施例、剪刀載體和水稻靶點(diǎn)載體共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN-剪刀與DBN-GET373用液氮法共轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；CAT：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μL農(nóng)桿菌LBA4404、3μL質(zhì)粒DNA(重組表達(dá)載體)；置于液氮中10分鐘，37℃溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN-剪刀和DBN-GET373結(jié)構(gòu)完全正確。

第十實(shí)施例、獲得轉(zhuǎn)化的水稻植株

對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化，簡要地，把水稻種子(日本晴，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、麥芽糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，從水稻成熟胚誘導(dǎo)出愈傷組織(步驟1：愈傷誘導(dǎo)步驟)，之后，優(yōu)選愈傷組織，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸愈傷組織，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⑺鼋閷?dǎo)植物生育力的構(gòu)建體傳遞至愈傷組織上的至少一個(gè)細(xì)胞(步驟2：侵染步驟)。在此步驟中，愈傷組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD₆₆₀＝0.3，侵染培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、pH5.4))中以啟動接種。愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)期(3天)(步驟3：共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，有一個(gè)“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素150-250mg/L)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟4：恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的愈傷組織在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟5：選擇步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟6：再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(N6分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。

篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述N6分化培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、甘露糖5g/L、6-芐氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸1mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于28℃下培養(yǎng)。

第十一實(shí)施例、多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)在水稻基因組上的功能驗(yàn)證

一共產(chǎn)生了71個(gè)水稻T₀植株。測序結(jié)果如表1所示，獲得靶點(diǎn)BADH2突變體水稻T₀植株數(shù)為25株，其突變效率(突變效率＝對應(yīng)突變體數(shù)量/突變體T₀植株總數(shù)×100％)為35.2％；獲得靶點(diǎn)CAS002突變體水稻T₀植株數(shù)為21株，其突變效率為29.5％；獲得靶點(diǎn)CAS003突變體水稻T₀植株數(shù)為35株，其突變效率為49.3％。

表1、多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)在水稻基因組上應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在多靶點(diǎn)載體中，Csy4蛋白均能識別并切割其對應(yīng)序列，靶位點(diǎn)BADH2、靶位點(diǎn)CAS002和靶位點(diǎn)CAS003均可被有效切割，并獲得相應(yīng)的突變體；說明Csy4蛋白可以應(yīng)用于多靶點(diǎn)編輯系統(tǒng)，識別并切割其對應(yīng)序列，從而指導(dǎo)Cas9蛋白打靶多個(gè)靶位點(diǎn)。

第十二實(shí)施例、在單點(diǎn)切割效率和片段缺失效率上Csy4系統(tǒng)與tRNA系統(tǒng)的比較

1、水稻靶位點(diǎn)的選擇

根據(jù)Cas9蛋白識別PAM序列(NGG/NGGNG)的原則，在水稻品種日本晴基因Os03G17700上選擇四個(gè)靶位點(diǎn)(如圖9所示)，即T1靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:36所示；T2靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:37所示；T3靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:38所示；T4靶位點(diǎn)序列，如SEQ ID NO:39所示。

2、構(gòu)建tRNA剪刀載體

按照第二實(shí)施例中1所述構(gòu)建重組克隆剪刀載體的方法，將合成的所述Cas9核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆tRNA剪刀載體，其中，Cas9為Cas9核苷酸序列(如SEQ ID NO:40所示)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆tRNA剪刀載體中所述Cas9核苷酸序列正確插入。

按照第二實(shí)施例中2所述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN-剪刀的方法，將SnabI和SpeI酶切重組克隆剪刀載體切下的所述Cas9核苷酸序列插入表達(dá)載體DBN-PAT，得到重組表達(dá)載體DBN-tRNA剪刀。酶切和測序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN-tRNA剪刀中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID NO:40所示核苷酸序列，即Cas9核苷酸序列，所述Cas9核苷酸序列可以連接所述pr35S啟動子和t35S終止子。

3、構(gòu)建靶點(diǎn)載體

按照第三實(shí)施例構(gòu)建煙草靶點(diǎn)載體DBN-GET372的方法，以合成的sgRNA+Csy4切割識別序列為擴(kuò)增模板(擴(kuò)增體系中<250ng)，將T1靶位點(diǎn)、T2靶位點(diǎn)、T3靶位點(diǎn)和T4靶位點(diǎn)通過下述引物帶入模板，而后經(jīng)過PCR擴(kuò)增、酶切插入表達(dá)載體DBN-Cys4-PMI中，得到水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET374。酶切和測序驗(yàn)證水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET374中4個(gè)靶點(diǎn)(T1靶位點(diǎn)+T2靶位點(diǎn)+T3靶位點(diǎn)+T4靶位點(diǎn))正確插入，水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET374的載體示意圖如圖10所示(RB：右邊界；prOsU6：水稻U6啟動子(SEQ ID NO:16)；Csy4-R：Csy4切割識別序列(如SEQ ID NO:8所示)；T1：T1靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:36)；T2：T2靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:37)；T3：T3靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:38)；T4：T4靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:39)；sgRNA：sgRNA序列(如SEQ ID NO:15所示)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:6)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQ ID NO:19)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO:20)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:18)；LB：左邊界)。

引入T1靶位點(diǎn)、T2靶位點(diǎn)、T3靶位點(diǎn)和T4靶位點(diǎn)的3對引物如下：

引物F7：actacaggtctccaaacagatgtcgtagagcaggtacgttttagagctagaaatagc，如SEQ ID NO:41所示；

引物R7：aggtaaggtctctcgtggcgatgtagactgcctatacggcagtgaacgcac，如SEQ ID NO:42所示；

引物F8：acaatcggtctcccacggagctcagttttagagctagaaatagc，如SEQ ID NO:43所示；

引物R8：aggtaaggtctctcaatgggcatgatgggctgcctatacggcagtgaacgcac，如SEQ ID NO:44所示；

引物F9：acaatcggtctccattggccggttttagagctagaaatagc，如SEQ ID NO:45所示；

引物R9：aggtaaggtctctaaaacggcagtgctcttctgacagtctgcctatacggcagtgaacgcac，如SEQ ID NO:46所示；

其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護(hù)堿基，斜體小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI，帶下劃線的小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI的粘性末端。

按照上述構(gòu)建水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET374的方法，以合成的sgRNA+tRNA切割識別序列為擴(kuò)增模板(擴(kuò)增體系中<250ng)，將T1靶位點(diǎn)、T2靶位點(diǎn)、T3靶位點(diǎn)和T4靶位點(diǎn)通過下述引物帶入模板，而后經(jīng)過PCR擴(kuò)增、酶切插入表達(dá)載體DBN-tRNA-PMI中，得到水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET375。酶切和測序驗(yàn)證水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET375中4個(gè)靶點(diǎn)(T1靶位點(diǎn)+T2靶位點(diǎn)+T3靶位點(diǎn)+T4靶位點(diǎn))正確插入，水稻靶點(diǎn)載體DBN-GET375的載體示意圖如圖11所示(RB：右邊界；prOsU6：水稻U6啟動子(SEQ ID NO:16)；pre-tRNA：tRNA切割識別序列(如SEQ ID NO:47所示)；T1：T1靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:36)；T2：T2靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:37)；T3：T3靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:38)；T4：T4靶位點(diǎn)序列(SEQ ID NO:39)；sgRNA：sgRNA序列(如SEQ ID NO:15所示)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:6)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQ ID NO:19)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO:20)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:18)；LB：左邊界)。

引入T1靶位點(diǎn)、T2靶位點(diǎn)、T3靶位點(diǎn)和T4靶位點(diǎn)的3對引物如下：

引物F10：actacaggtctccaaacagatgtcgtagagcaggtacgttttagagctagaaatagcaa，如SEQ ID NO:48所示；

引物R10：ctggaaggtctcgcgtggcgatgtagatgcaccagccgggaa，如SEQ ID NO:49所示；

引物F11：actacaggtctcccacggagctcagttttagagctagaaatagcaa，如SEQ ID NO:50所示；

引物R11：ctggaaggtctcgcaatgggcatgatgggtgcaccagccgggaa，如SEQ ID NO:51所示；

引物F12：actacaggtctccattggccggttttagagctagaaatagcaa，如SEQ ID NO:52所示；

引物R12：ctggaaggtctcgaaaacggcagtgctcttctgacagttgcaccagccgggaa，如SEQ ID NO:53所示；

其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護(hù)堿基，斜體小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI，帶下劃線的小寫字母為酶切位點(diǎn)BsaI的粘性末端。

4、剪刀載體和水稻靶點(diǎn)載體共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

按照第九實(shí)施例所述共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的方法，分別將己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN-剪刀和DBN-GET374、DBN-tRNA剪刀和DBN-GET375用液氮法共轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，用限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN-剪刀和DBN-GET374、DBN-tRNA剪刀和DBN-GET375結(jié)構(gòu)完全正確。

5、在單點(diǎn)切割效率上的比較實(shí)驗(yàn)

按照第十實(shí)施例所述方法獲得水稻抗性愈傷。測序結(jié)果如表2所示，在T1靶位點(diǎn)、T2靶位點(diǎn)和T4靶位點(diǎn)上，表達(dá)載體DBN-GET374的突變效率(突變效率＝對應(yīng)突變抗性愈傷數(shù)量/抗性愈傷總數(shù)×100％)高于表達(dá)載體DBN-GET375，分別為61.7％、88.8％和53.5％；而在T3靶位點(diǎn)上，表達(dá)載體DBN-GET374的突變效率低于表達(dá)載體DBN-GET375，為57.9％；即整體上Csy4蛋白的切割效率明顯高于tRNA剪切系統(tǒng)。

表2、在單點(diǎn)切割效率上Csy4系統(tǒng)與tRNA系統(tǒng)的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6、在片段缺失效率上的比較實(shí)驗(yàn)

利用上述獲得的水稻抗性愈傷，通過下述引物檢測相應(yīng)位置的片段缺失效率，擴(kuò)增區(qū)域和引物相對位置如圖12所示。測序結(jié)果如表3所示，在T1T4區(qū)域、T1T3區(qū)域和T2T4區(qū)域，表達(dá)載體DBN-GET374的缺失率(缺失率＝發(fā)生缺失的抗性愈傷數(shù)量/抗性愈傷總數(shù)×100％)高于表達(dá)載體DBN-GET375，分別為13.6％、22.2％和23.5％，片段缺失總概率(片段缺失總概率＝任何形式缺失的抗性愈傷數(shù)量/抗性愈傷總數(shù)×100％)高達(dá)43.2％；即Csy4蛋白的片段缺失效率明顯高于tRNA剪切系統(tǒng)。

檢測相應(yīng)位置的片段缺失效率的引物如下：

引物F13：gctgccttcgcctctcg，如SEQ ID NO:54所示；

引物R13：aattggtcccaattactccatc，如SEQ ID NO:55所示；

引物F14：gcacctcgaccacgagaac，如SEQ ID NO:56所示；

引物R14：ggtacaggaaatactgcaacaacac，如SEQ ID NO:57所示；

引物F15：gccaccttccttcctcatccg，如SEQ ID NO:58所示；

引物R15：gttgctcggcttcaggtcgc，如SEQ ID NO:59所示。

表3、在片段缺失效率上Csy4系統(tǒng)與tRNA系統(tǒng)的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜上所述，本發(fā)明首次將Csy4蛋白及其對應(yīng)識別序列應(yīng)用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，利用Csy4蛋白能夠切割并識別對應(yīng)的RNA序列，使得多個(gè)sgRNA在同一個(gè)表達(dá)盒中同時(shí)轉(zhuǎn)錄后，可以被切割成獨(dú)立的片段，實(shí)現(xiàn)對基因組的多靶點(diǎn)編輯；同時(shí)單靶點(diǎn)的切割效率相比現(xiàn)有技術(shù)tRNA剪切系統(tǒng)明顯提高，且對由多靶點(diǎn)切割引起的片段缺失效率也較tRNA剪切系統(tǒng)高。

最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。