本發(fā)明涉及一株地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用，尤其涉及一株能高效降解石油的地衣芽孢桿菌及其在生物修復(fù)石油污染環(huán)境中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

石油作為現(xiàn)代工業(yè)的血液，為人類文明的進(jìn)步和發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。然而石油在給人們帶來巨大經(jīng)濟(jì)利益的同時，也對生態(tài)環(huán)境造成了巨大的威脅。在勘察、開采、運輸以及儲存過程中，石油所造成的土壤污染問題是一個長期存在的環(huán)境問題，石油污染使得土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，不利于農(nóng)作物生長；石油烴中不易被土壤吸附的部分會逐漸滲入到地下，進(jìn)一步污染地下水源。因此治理石油所造成的土壤污染具有十分重要的現(xiàn)實意義，針對石油污染土壤的修復(fù)研究也是目前環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域中的研究熱點(2003年，Hamme等)。

目前土壤中石油污染的處理方法按其性質(zhì)可分為3種：物理方法，化學(xué)方法和生物方法。物理方法包括挖掘填埋法、氣提吹脫法、電解法、洗滌法和隔離控制法等；化學(xué)方法包括氧化劑氧化法、光化學(xué)氧化法、熱分解法、萃取法等等。以前使用的主要是這兩類方法，雖可產(chǎn)生一定的實效，但是處理費用昂貴而且容易造成嚴(yán)重的二次污染。相較而言，生物方法具有物理方法和化學(xué)方法不可比擬的優(yōu)勢，首先是處理費用低，其處理成本大約只有物化方法的三分之一；其次是修復(fù)操作簡單，可以原位進(jìn)行修復(fù)(2011年，Mukherjee和Bordoloi)；再次生物法修復(fù)對環(huán)境的二次污染較小(2002年，Ron和Rosenberg)。

石油烴降解菌是能將石油烴作為唯一碳源進(jìn)行生物降解，并產(chǎn)生氣體、脂肪酸及生物表面活性劑等代謝產(chǎn)物的一類微生物的總稱。石油烴降解菌在石油污染環(huán)境的生物修復(fù)中有著重要的作用，在微生物采油研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛(1997年，何良菊等)。由于自然界中的微生物具備資源豐富、易于培養(yǎng)和對環(huán)境的耐受性較強(qiáng)等諸多優(yōu)點，對于生物修復(fù)石油污染環(huán)境具有廣闊的應(yīng)用前景。但檢索發(fā)現(xiàn)目前有關(guān)能高效降解石油的地衣芽孢桿菌及其在生物修復(fù)石油污染環(huán)境中的應(yīng)用還鮮見報道。

參考文獻(xiàn)

1.Hamme J.D.V.,Singh A.,Ward O.P.Microbiol Mol Biol Rev,2003,67(4):503-549.

2.Mukherjee A.K.,Bordoloi N.K.Environ.Sci.Pollut.Res.Int,2011,471:478.

3.Ron E.Z.,Rosenberg E.Curr.Opin.Biotechnol,2002,249:252.

4.何良菊，魏德洲，張維慶.環(huán)境科學(xué)進(jìn)展,1997,7(3):110-115.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決問題是提供一株能高效降解石油的地衣芽孢桿菌及其在修復(fù)石油污染環(huán)境中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述能高效降解石油的地衣芽孢桿菌，其特征在于：該菌株名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Yb1，菌株已于2015年9月18日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC No.11427。

上述的能高效降解石油的地衣芽孢桿菌，其生物學(xué)特征是：呈現(xiàn)桿狀，單個，細(xì)胞大小為(0.6μm～0.8μm)×(1.3μm～2.0μm)，20-24小時開始生孢子，37℃固體培養(yǎng)時菌落初期呈橢圓形，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸呈不規(guī)則狀，菌落扁平且不透明、表面粗糙、邊緣不齊；其生理生化特征是：革蘭氏染色陽性，兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，最適生長溫度為30～37℃，最適合生長pH值為6.5～7.5，生理生化實驗結(jié)果與地衣芽孢桿菌模式菌株相比一致，詳見表1。

表1：Yb1菌株與Bacillus licheniformis的生理生化特征比較

注：“+”表示菌株陽性；“-”表示菌株陰性。

*：東秀珠蔡妙英等，常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊，科學(xué)出版社，2001，第一版，p62-63

上述用于菌體形態(tài)觀察的液體培養(yǎng)基組成是：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，并調(diào)節(jié)pH 7.5。

上述用于菌體形態(tài)觀察的固體培養(yǎng)基組成是：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，瓊脂粉15g，并調(diào)節(jié)pH 7.5。

上述形態(tài)特征觀測的實驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，科學(xué)出版社，2001，第一版，p353-363。

上述生理生化試驗培養(yǎng)基及實驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，科學(xué)出版社，2001，第一版，p364-398。

實驗證實：本發(fā)明所述的Yb1菌株在以石油為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時能夠降解石油，同時產(chǎn)生明顯的降解圈，結(jié)果見圖3。測定顯示該菌株對石油的降解率接近43％。預(yù)示其在治理石油污染土壤或水體方面具有較好的應(yīng)用前景。

對本發(fā)明所述菌株Yb1測定16S rRNA基因序列的結(jié)果顯示，其基因序列長度為1419bp，該核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通過使用美國生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)BLASTN程序比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的Yb1菌株16S rRNA的基因序列與NCBI注冊的多株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)16S rRNA的基因序列具有高度同源性，可以確定本發(fā)明所述Yb1菌株是一株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。

選取同源性比較高的典型地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的16S rDNA序列作為參比對象；采用鄰近法(Neighbour-Joining)運用Mega 5軟件構(gòu)建Yb1菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹，選用Pseudomonas aeruginosa作為外群分支。結(jié)果見附圖4。

本發(fā)明所述的能降解石油的地衣芽孢桿菌Yb1菌種選育的基本方法是：

將采集到的石油污染的土壤樣品用無菌生理鹽水溶解，振蕩混勻制成土壤懸液，梯度稀釋涂布平板，37℃條件下靜置培養(yǎng)，至有明顯的石油降解圈出現(xiàn)，挑取石油降解圈較大的菌落，劃線轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基，37℃條件下靜置培養(yǎng)，至有明顯的單菌落產(chǎn)生，經(jīng)兩次純化后，甘油凍藏保菌。該菌株已于2015年9月18日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC No.11427。

本發(fā)明所述能高效降解石油的地衣芽孢桿菌在降解石油中的應(yīng)用或在生物修復(fù)石油污染環(huán)境中的應(yīng)用。

其中：所述石油污染環(huán)境優(yōu)選是指石油污染的土壤或石油污染的水。

具體的，上述應(yīng)用涉及的方法是：

(1)菌種選擇：選地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Yb1菌株；

(2)斜面培養(yǎng)活化菌種：將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，35～40℃條件下，靜止培養(yǎng)20～40小時，備用；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于含有50mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶(250mL)中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為180～220轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，35～40℃培養(yǎng)18～24小時，得種子液；

(4)生物修復(fù)石油污染環(huán)境及石油分解率檢測：以1～5％的體積比的接種量，將種子液接種于模擬石油污染環(huán)境的含有50mL已添加100mg原油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶(250mL)中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為180～220轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，35～40℃培養(yǎng)8～10天；然后用四氯化碳萃取培養(yǎng)基中殘留的石油烴，以四氯化碳作參比溶液，采用紅外分光光度計于2930cm-1、2960cm-1、3030cm-1處測量其吸光度值；同時將不接入Yb1菌株的培養(yǎng)基作為空白對照，在相同條件下進(jìn)行測定，按照中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)(HJ 637-2012水質(zhì)石油類和動植物油類的測定紅外分光光度法)中列出的公式計算樣品中總石油烴的含量，得出石油分解率；

其中：

上述斜面培養(yǎng)基組成為：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，瓊脂粉15g，并調(diào)節(jié)pH 7.5；

上述液體種子培養(yǎng)基組成為：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，并調(diào)節(jié)pH 7.5。

上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基組成為：NaNO₃ 1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄0.5g/L，KCl 0.5g/L，F(xiàn)eSO₄ 0.01g/L，CaCl₂ 0.002g/L，原油5g/L，pH 7.0，蒸餾水配制。

上述方法中，步驟(2)、(3)、(4)所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選37℃±0.2℃。

上述方法中，步驟(2)、(3)所述培養(yǎng)時間優(yōu)選24小時。

上述方法中，步驟(4)所述種子液接入體積比優(yōu)選2％。

本發(fā)明公開的一株能高效降解石油的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Yb1可以將石油作為唯一碳源，降解石油，且降解率較高，預(yù)示其可用于石油污染的土壤或水體的治理，在消除石油污染方面具有較好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價值。

附圖說明

本發(fā)明所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Yb1菌株已于2015年9月18日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.11427。

圖1為地衣芽孢桿菌Yb1菌株在顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)。

圖2為地衣芽孢桿菌Yb1菌株在顯微鏡下的芽孢形態(tài)。

圖3為地衣芽孢桿菌Yb1菌株在以石油為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

圖4為地衣芽孢桿菌Yb1菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

具體實施方式

下面通過給出的具體實施例對本發(fā)明內(nèi)容做詳細(xì)說明和深入理解，但下述實施例僅對本發(fā)明進(jìn)行解釋而不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實施例1：能高效降解石油的地衣芽孢桿菌的篩選

取1g采集到的石油污染的土壤樣品，放入250ml三角瓶中，向其中加入9ml無菌生理鹽水，振蕩混勻制成土壤懸液，按10倍的濃度梯度進(jìn)行倍比稀釋。分別取100μl稀釋度為10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的土壤懸液，滴加到以石油為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻，在37℃條件下靜置培養(yǎng)7天。

待有明顯的石油降解圈出現(xiàn)，用接種環(huán)挑取石油降解圈較大的菌落，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，在37℃條件下靜置培養(yǎng)，至有明顯的單菌落產(chǎn)生。轉(zhuǎn)接劃線兩次。

用接種環(huán)挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到裝有8ml液體培養(yǎng)基的試管中，在37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)過夜。向凍藏管中分別加入200μl甘油和800μl的菌液，混合均勻后放置-80℃超低溫冰箱中保存，菌株編號為Yb1。

上述無菌生理鹽水組成為：0.85％NaCl溶液。

上述無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基組成為：NaNO₃ 1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KCl 0.5g/L，F(xiàn)eSO₄ 0.01g/L，CaCl₂ 0.002g/L，瓊脂粉15g/L，原油5g/L，pH 7.0，蒸餾水配制。

上述固體培養(yǎng)基組成為：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，瓊脂粉15g，并調(diào)節(jié)pH 7.5。

實施例2：Yb1菌株形態(tài)觀察及生理生化特征鑒定

采用尼康倒置顯微鏡的油鏡對Yb1菌株的形態(tài)進(jìn)行觀察。

Yb1菌株生理生化特征鑒定方法參照東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(科學(xué)出版社，2001，第一版)，鑒定試驗培養(yǎng)溫度均設(shè)為37℃。同時分析Yb1菌株在以石油為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上生長時的最適溫度與最適合生長pH值。

Yb1菌株的生物學(xué)特征是：呈現(xiàn)桿狀，單個，細(xì)胞大小為(0.6μm～0.8μm)×(1.3μm～2.0μm)，20-24小時開始生孢子，37℃固體培養(yǎng)時菌落初期呈橢圓形，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸呈不規(guī)則狀，菌落扁平且不透明、表面粗糙、邊緣不齊。(見圖1)

Yb1菌株的生理生化特征是：革蘭氏染色陽性，兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，過氧化氫酶試驗、VP試驗、檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水解和明膠水解試驗呈現(xiàn)陽性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、甲基紅試驗呈現(xiàn)陰性。最適生長溫度為30～37℃，最適合生長pH值為6.5～7.5，生理生化實驗結(jié)果與地衣芽孢桿菌模式菌株相比一致，詳見表1。

表1：Yb1菌株與Bacillus licheniformis的生理生化特征比較

注：“+”表示菌株陽性；“-”表示菌株陰性。

*：東秀珠蔡妙英等，常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊，科學(xué)出版社，2001，第一版，p62-63上述用于菌體形態(tài)觀察的液體培養(yǎng)基組成是：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，并調(diào)節(jié)pH 7.5。

上述用于菌體形態(tài)觀察的固體培養(yǎng)基組成是：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，瓊脂粉15g，并調(diào)節(jié)pH 7.5。

Yb1菌株在以石油為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時能夠降解石油，同時產(chǎn)生明顯的降解圈，結(jié)果見圖3。

Yb1菌株名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Yb1，菌株已于2015年9月18日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.11427。

實施方式3：Yb1菌株的16S rRNA基因鑒定

根據(jù)TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒(TianGen公司，貨號DP302-02)的操作說明，提取分離純化的Yb1菌株的總基因組DNA。提取的總基因組DNA采用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，取3.0μl總基因組DNA樣品與0.6μl 6×Loading Buffer充分混合均勻后注入點樣孔中，Marker選用λ-Hind III DNA Marker，電泳電壓120V，電泳時間35分鐘。選用上游引物27F(5’-3’：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和下游引物1492R(5’-3’：GGTTACCTTGTTACGACTT)擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA基因，PCR反應(yīng)體系和條件如下表所示：

PCR產(chǎn)物采用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，取3.0μl PCR產(chǎn)物與0.6μl 6×Loading Buffer充分混合均勻后注入點樣孔中，Marker選用DL 2000DNA Marker，電泳電壓120V，電泳時間30分鐘。根據(jù)TIANGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TianGen公司，貨號DP209-02)的操作說明，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，回收后的PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳方法同上。純化回收后的PCR產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行測序。

將測序所得的16S rRNA基因序列遞交到NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行BLASTN比對。結(jié)果顯示該菌株的16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他衣芽孢桿菌的16S rRNA基因序列的同源性非常高，個別菌株的相似性甚至高達(dá)100％。選取同源性比較高的典型的Bacillus licheniformis 16S rRNA基因序列作為參比對象；采用鄰近法(Neighbour-Joining)運用Mega 5軟件構(gòu)建Yb1菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹，選用Pseudomonas aeruginosa作為外群分支。結(jié)果見圖4。

實施例4：Yb1菌株在生物修復(fù)石油污染中的應(yīng)用方法步驟是：

(1)菌種選擇：選地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Yb1菌株；

(2)斜面培養(yǎng)活化菌種：將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，37℃條件下，靜止培養(yǎng)40小時，備用；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于含有50mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶(250mL)中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為180～220轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，37℃培養(yǎng)24小時，得種子液；

(4)生物修復(fù)石油污染環(huán)境及石油分解率檢測：以2％的體積比的接種量，將種子液接種于模擬石油污染環(huán)境的含有50mL已添加100mg原油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶(250mL)中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，37℃培養(yǎng)8～10天；

將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10ml四氯化碳振蕩3min，期間經(jīng)常開啟旋塞排氣。靜置分層后，將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至事先已加入3g無水硫酸鈉的錐形瓶中，搖動數(shù)次除去殘留的水分。如果無水硫酸鈉結(jié)晶成塊，需要補(bǔ)加無水硫酸鈉，靜置。用四氯化碳作參比溶液，采用紅外分光光度計于2930cm-1、2960cm-1、3030cm-1處測量其吸光度值。設(shè)置3個平行實驗，取3組實驗數(shù)據(jù)的平均值，同時計算正負(fù)誤差。將不接入Yb1菌株的培養(yǎng)基在相同條件下進(jìn)行處理，作為空白對照。按照中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)(HJ 637-2012水質(zhì)石油類和動植物油類的測定紅外分光光度法)中列出的公式計算樣品中總石油烴的含量。

結(jié)果顯示，接入Yb1菌株后，培養(yǎng)基中總石油烴的含量從最初的100mg下降至57±4mg，石油的去除率接近43％。

上述斜面培養(yǎng)基組成為：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，瓊脂粉15g，并調(diào)節(jié)pH 7.5。

上述液體種子培養(yǎng)基組成為：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，并調(diào)節(jié)pH 7.5。

上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基組成為：NaNO₃ 1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄0.5g/L，KCl 0.5g/L，F(xiàn)eSO₄ 0.01g/L，CaCl₂ 0.002g/L，pH 7.0，蒸餾水配制。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>一株能高效降解石油的地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用

<141> 2016-11-21

<160> 1

<210> 1

<211> 1419

<212> rRNA

<213> 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）

<221> 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）Yb1 CGMCC No.11427

<222>（1）…（1419）

<400> 1

tcggcggctg gctccaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt 60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120

ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt 180

tgtgggattg gcttagcctc gcggcttcgc tgccctttgt tctgcccatt gtagcacgtg 240

tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300

tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 420

tgtcactctg cccccgaagg ggaagcccta tctctagggt tgtcagagga tgtcaagacc 480

tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600

gtttgctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720

acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780

tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc 840

cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgcg cgctttacgc 900

ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960

gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtgccgccct attcgaacgg tacttgttct 1020

tccctaacaa cagagtttta cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt 1080

cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt 1140

gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt cgccttggtg 1200

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