本發(fā)明涉及玉米類芽胞桿菌(Paenibacillus mealiensis)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

內(nèi)生菌(Endophyte)概念是在1866年首先由Barry提出的，是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的組織或器官內(nèi)部的微生物(主要為真菌和細(xì)菌)。內(nèi)生菌的菌絲生長于植物組織的細(xì)胞間，分布于葉鞘、種子、花、莖、葉片和根。目前農(nóng)用內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生菌對(duì)農(nóng)作物本身的影響和從植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)具有農(nóng)用生物活性的新化合物兩方面，這其中也包括內(nèi)生菌的抗病原真菌作用。

真菌病害嚴(yán)重危及全球糧食安全，植物病害中有70％-80％是病原真菌的侵染所導(dǎo)致，例如，水稻紋枯病是水稻生產(chǎn)上的主要病害之一，甚至一些真菌類病害還導(dǎo)致了嚴(yán)重的動(dòng)植物死亡和滅絕?；瘜W(xué)防治是目前防治真菌病害最有效的措施，我國每年化學(xué)農(nóng)藥的使用量為50萬噸-60萬噸，對(duì)環(huán)境和生態(tài)帶來了嚴(yán)重的污染和危害，在一些國家和地區(qū)化學(xué)殺菌劑已經(jīng)被限制使用。而生物防治因其見效快、殺菌譜廣、環(huán)境友好，并且不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

用于生物防治的微生物種類主要有細(xì)菌、真菌、放線菌和病毒。然而，近年來，隨著生防細(xì)菌的發(fā)掘和研究，尋找新的具有病原真菌拮抗作用的細(xì)菌難度越來越大，但是篩選新的具有病原真菌拮抗作用的細(xì)菌仍然具有重要的科學(xué)價(jià)值的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，結(jié)合我國的種植資源，從在中國水稻所富陽基地玉米種植區(qū)域內(nèi)的玉米根中分離得到了眾多玉米內(nèi)生菌的細(xì)菌菌株，并對(duì)這些細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序分析，以確定這些細(xì)菌種屬分類關(guān)系。并利用其對(duì)病原真菌拮抗能力等進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在獲得高效廣譜的生防菌，以期為植物真菌病害的防治提供材料。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種可以用于農(nóng)作物病害防治，特別是水稻病害防治的類芽胞桿菌屬的新的物種。

具體來講，本發(fā)明提供了一種玉米類芽胞桿菌(Paenibacillus mealiensis)。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述玉米類芽胞桿菌為保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.13158的菌株。

一種如本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌，特別是保藏編號(hào)為CGMCC NO.13158的菌株的應(yīng)用。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為所述玉米類芽胞桿菌在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述玉米類芽胞桿菌用于保護(hù)植物；所述植物主要指的是農(nóng)作物；所述農(nóng)作物可以為水稻。

一種對(duì)本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌CGMCC NO.13158進(jìn)行遺傳改良后得到的工程菌。其中，由于該工程菌以本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌CGMCC NO.13158為靶標(biāo)，采取向其中轉(zhuǎn)入和/或敲除特定的基因和/或序列等獲得，因此，該工程菌仍然為玉米類芽胞桿菌。另外，該工程菌可以為提高了對(duì)上述病害活性的工程菌。還可以為兼具其他病蟲害活性以及獲得了其他特性的工程菌株。

一種如本發(fā)明的工程菌的應(yīng)用。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述工程菌在用于防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述工程菌用于保護(hù)植物；所述植物主要指的是農(nóng)作物；所述農(nóng)作物可以為水稻。

一種包含如本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌的組合物。其中的玉米類芽胞桿菌可以包括本發(fā)明的野生菌株CGMCC NO.13158，也可以包括對(duì)本發(fā)明的野生菌株CGMCC NO.13158進(jìn)行遺傳改良后得到的工程菌，或者野生菌株和工程菌株都包括在內(nèi)。所述組合物可以為固態(tài)形式，也可以為液態(tài)形式。所述組合物還可以包含與本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌具有增效作用的其他物質(zhì)，所述其他物質(zhì)可以是微生物來源抑菌活性物質(zhì)，也可以是抑菌化合物。所述組合物進(jìn)一步可以包括與本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌相配合的輔劑、增稠劑和/或分散劑。

一種如本發(fā)明的組合物的應(yīng)用。

一種如本發(fā)明所述的組合物在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。

一種如本發(fā)明所述的組合物在保護(hù)植物中的應(yīng)用；所述植物主要指的是農(nóng)作物；所述農(nóng)作物可以為水稻。

一種包含如本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌的農(nóng)藥制劑。其中的玉米類芽胞桿菌可以包括本發(fā)明的野生菌株CGMCC NO.13158，也可以包括對(duì)本發(fā)明的野生菌株CGMCC NO.13158進(jìn)行遺傳改良后得到的工程菌，或者野生菌株和工程菌株都包括在內(nèi)。所述農(nóng)藥制劑可以為固態(tài)形式，也可以為液態(tài)形式。所述農(nóng)藥制劑還可以包含與本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌具有增效作用的其他物質(zhì)，該物質(zhì)可以是微生物來源抑菌活性物質(zhì)，也可以是抑菌化合物。所述農(nóng)藥制劑進(jìn)一步可以包括與本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌相配合的輔劑、增稠劑和/或分散劑。

一種如本發(fā)明的農(nóng)藥制劑的應(yīng)用。

一種如本發(fā)明所述的農(nóng)藥制劑在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。

一種如本發(fā)明所述的農(nóng)藥制劑在保護(hù)植物中的應(yīng)用；所述植物主要指的是農(nóng)作物；所述農(nóng)作物可以為水稻。

在本發(fā)明中，術(shù)語“保護(hù)”的意思是通過預(yù)防和/或治療靶標(biāo)生物產(chǎn)生的病蟲害等，從而使靶標(biāo)生物免于或減輕遭受所述病蟲害的為害。例如通過使用所述玉米類芽胞桿菌預(yù)防和/或治療水稻紋枯病。

在本發(fā)明中，術(shù)語“16S rDNA”是指16S rRNA的基因。

由于本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌可以作為植物的內(nèi)生菌，而內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，不易受環(huán)境條件的影響，其可以在植物體內(nèi)獨(dú)立的分裂繁殖和傳遞，因此，本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌在生物防治中具有非常大的應(yīng)用潛力。并且在本發(fā)明的玉米類芽胞桿菌進(jìn)行遺傳改造，可以使其作為生防載體菌和/或其他有益功能的載體菌而加以利用。

附圖說明

圖1為玉米類芽胞桿菌YMN-7對(duì)峙培養(yǎng)法抑制水稻紋枯病病原菌的效果圖。其中，A為空白對(duì)照，B為YMN-7的抑菌實(shí)驗(yàn)。

圖2為根據(jù)16S rDNA使用軟件MEGA6.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實(shí)施方式

以下通過優(yōu)選的實(shí)施例的形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。

本發(fā)明篩選的一株類芽胞桿菌被定名為YMN-7，該菌株保藏于保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.13158，保藏日期為2016年10月27日，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。其系統(tǒng)分類為玉米類芽胞桿菌(Paenibacillus mealiensis)。

病原菌：供試病原真菌水稻紋枯病病原菌(Rhizoctonia solani Kühn)由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

LB液體培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10g，酵母抽提5g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml，pH7.2。常規(guī)滅菌后使用。若為固體培養(yǎng)基，在滅菌前向其中添加瓊脂15g。

PDA固體培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15克，蒸餾水1000毫升，自然pH。常規(guī)滅菌后使用。

相對(duì)抑菌率(％)＝(對(duì)照菌落半徑－處理菌落半徑)/對(duì)照菌落半

實(shí)施例1

1、菌株的分離

在中國水稻所富陽基地玉米種植區(qū)域內(nèi)，隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)挖取玉米根，將根系上的土壤和附帶物用流水沖洗干凈。選取幼根作為分離材料，用剪刀剪成3-4cm小段放置于空培養(yǎng)皿中，在無菌條件下，先用75％灑精浸泡2min，然后用5％NaClO溶液浸泡15min，后用無菌水漂洗根段5-6次，用經(jīng)過消毒的剪刀剪成0.5cm根段放置在含PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，每培養(yǎng)皿中放置6個(gè)根段。將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，28℃培養(yǎng)。待根段兩頭周圍長出菌落后，挑取不同形態(tài)菌落在新鮮PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化，挑取單菌落保存于PDA固體斜面，4℃短期保存。單菌落接種LB液體，28℃過夜培養(yǎng)后，與40％甘油等體積混合后置－80℃長期保存。將其中分離到的一株玉米內(nèi)生細(xì)菌命名為YMN-7。

2、菌株YMN-7的抑菌譜

1)采用平板對(duì)峙法：一方面，將病源真菌水稻紋枯病病原菌(Rhizoctonia solani Kühn)分別提前在25℃下在PDA固體培養(yǎng)基上活化，并分別用6mm打孔器沿著菌絲邊緣打菌餅備用。另一方面，將供試菌株YMN-7于PDA平板上活化后，挑取單克隆接種3ml LB液體培養(yǎng)基，28℃200rpm震蕩培養(yǎng)10-12小時(shí)，后取3μl培養(yǎng)液滴加于PDA培養(yǎng)基中心點(diǎn)兩側(cè)(距中心2.5cm)28℃培養(yǎng)24小時(shí)后，取上述制備的其中一個(gè)菌餅，菌絲面朝下，接種到已經(jīng)接種供試菌YMN-7的PDA培養(yǎng)基中央。病原菌接種三個(gè)平板作為重復(fù)。同時(shí)以不接供試菌而只接種病原真菌(為水稻紋枯病病原菌(Rhizoctonia solani Kühn))的平板為對(duì)照。28℃進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，在第3天和第5天后觀察并記錄，抑菌情況見圖1。

YMN-7對(duì)水稻紋枯病病源真菌(Rhizoctonia solani Kühn)表現(xiàn)出明顯抑制作用。在測(cè)定病原菌的菌落半徑并根據(jù)相對(duì)抑菌率公式計(jì)算相對(duì)抑菌率之后，得到Y(jié)MN-7對(duì)水稻紋枯病病源真菌(Rhizoctonia solani Kühn)的相對(duì)抑菌率為65％。

3、菌株YMN-7的16S rDNA測(cè)序及序列分析將供試菌株YMN-7在PDA平板活化后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，28℃200rpm震蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右，收集菌體，使用DNAiso Reagent(Takara)進(jìn)行基因組提取。用細(xì)菌16S rDNA通用引物：27F：5’－agagtttgatcctggctcag-3’(如SEQ ID No.1所示)和1492R：5’-cggttaccttgttacgactt-3’(如SEQ ID No.2所示)擴(kuò)增YMN-7的16S rDNA序列。50μl的反應(yīng)體系包括：10×PCR緩沖液5μl，dNTP(2.5mM)4μl，27F(20μm)1μl，1492R(20μm)1μl，TaqDNA聚合酶(5IU)0.25μl，DNA模板(50ng/μl)1μl，ddH₂O補(bǔ)充至50μl。PCR擴(kuò)增條件：94度3min預(yù)變性，94度45sec，58度45sec，72度90sec，共30個(gè)循環(huán)，72度10min終延伸。得到的約1.5kp片段，經(jīng)過切膠純化后直接進(jìn)行測(cè)序(由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成測(cè)定工作)，所得序列為1449bp(如SEQ ID No.3所示)。將SEQ ID No.3放在EzTaxon網(wǎng)站(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)進(jìn)行16S rDNA的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.3最為接近的16S rDNA為杰米拉類芽胞桿菌(Paenibacillus jamilae)的16S rDNA，兩者的相似度為98.61％；另外，SEQ ID No.3與與膠凍樣類芽胞桿菌(Paenibacillus kribbensis)的16S rDNA的相似度為97.93％。本領(lǐng)域的人員公認(rèn)，在該網(wǎng)站中16S rDNA的比對(duì)結(jié)果可以作為物種分類的標(biāo)準(zhǔn)，特別是當(dāng)最接近的兩種16S rDNA序列的相似度低于99％的情況下，則認(rèn)為該最接近的兩種16S rDNA所屬的物種不屬于相同的物種。采用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)。

綜合16S rDNA的相似度分析以及圖2的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，進(jìn)一步確定本發(fā)明的YMN-7雖然與膠凍樣類芽胞桿菌(Paenibacillus kribbensis)AM49^T的分類地位最為接近，但兩者的16s rRNA相似度僅為97.93％；而其與分類地位較遠(yuǎn)的杰米拉類芽胞桿菌(Paenibacillus jamilae)CECT 5266^T的16s rRNA相似度可達(dá)到98.61％。由此可以確定本發(fā)明的YMN-7的系統(tǒng)分類為類芽胞桿菌中的新的物種，該新的物種定名為玉米類芽胞桿菌(Paenibacillus mealiensis)并將該菌株保藏于保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.13158，保藏日期為2016年10月27日，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。

YH1662428CN 核 苷 酸 序 列 表

<110> 中國水稻研究所

<120> 一種玉米類芽胞桿菌及其應(yīng)用

<130> YH1662428CN

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>27F

<400> 1

agagtttgatcctggctcag；

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1492R

<400> 2

cggttaccttgttacgactt；

<210>3

<211> 1449

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>玉米類芽胞桿菌（Paenibacillus mealiensis）的16S rDNA

<400>3

GGCTGCGCGTGCTATACTGCAGTCGAGCGGGGTTAGTTAGAAGCTTGCTTCTAACTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGATAGAGTAACTGCTCTTGAAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGATCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGGAGCGATGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGAGCCAGCCGCCGAAGTTGGTAA。