本發(fā)明屬于食品工業(yè)技術(shù)、微生物菌種篩選
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一株人母乳來源的鼠李糖乳桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：益生菌(probiotics)是指活的微生物，以適當(dāng)劑量服用時(shí)，對宿主人或動(dòng)物起到有益健康的作用。嬰幼兒由于自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟，母傳抗體在出生后逐漸消失，在出生后至6周歲這段時(shí)期都處于易感期，這段時(shí)間大多數(shù)嬰兒都會(huì)因胃腸功能、免疫功能不完善，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力較弱，消化功能紊亂，進(jìn)而出現(xiàn)腸吸收不良及感染性疾病。這些異常生理狀態(tài)不但阻礙了嬰兒身體的生長和發(fā)育，而且會(huì)對嬰兒智力發(fā)育、情感社交能力的發(fā)育都帶來不同程度的影響，如果用治療性的化學(xué)藥物，勢必會(huì)擔(dān)心對嬰兒帶來不可估量的傷害，而如果用益生菌進(jìn)行腸道調(diào)節(jié)，有助于改善嬰兒的免疫力、促進(jìn)腸胃消化吸收，預(yù)防各種疾病，保證嬰兒健康均衡成長。益生菌在成年人體內(nèi)也有很多好處：(1)提高人體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力。許多益生菌株在胃腸道內(nèi)可產(chǎn)生消化酶，這些酶可幫助人體更好地消化所攝入的食品和吸收食品中的營養(yǎng)成分。益生菌還可競爭性抑制有害微生物吸收營養(yǎng)物質(zhì)及進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，嗜酸乳桿菌是這方面的代表菌株，可分泌消化乳糖的乳糖酶，從而緩解乳糖不耐癥；(2)定植于人體時(shí)產(chǎn)生重要的營養(yǎng)物質(zhì)。定植于腸道中的益生菌能產(chǎn)生維生素，包括泛酸、尼克酸，以及VB1，VB2，VB6，VK等，同時(shí)能產(chǎn)生短鏈脂肪酸、抗氧化劑、氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)對骨骼成長和心臟健康有重要作用；(3)可以提高機(jī)體抵抗細(xì)菌病毒感染的能力。益生菌通過產(chǎn)生殺滅有害菌的化學(xué)物質(zhì)及在腸道中與有害菌競爭空間和資源以遏制它們的生長；抑制有害菌產(chǎn)生毒素；清除有害菌產(chǎn)生的毒素。益生菌在我國的研究與利用起步較遲，在基礎(chǔ)研究和開發(fā)利用方面與發(fā)達(dá)國家都存在一定的差距。許多益生菌諸如乳酸菌等的應(yīng)用效果不理想。迫切需要開發(fā)新型有效的益生菌產(chǎn)品。母乳是嬰兒最適宜的天然食物，有嬰兒配方奶無法復(fù)制的特殊組分。早期人們認(rèn)為母乳是無菌的，隨著菌株分離技術(shù)的不斷革新，迄今為止在母乳中已分離到200多株細(xì)菌，分屬于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形軍門。利用選擇性培養(yǎng)基，一些具有益生活性的乳酸菌如嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等在母乳中被陸續(xù)分離到(Jostetal,2015)。有研究表明，嬰兒每天從母乳中約獲得104-108的細(xì)菌，這些細(xì)菌在胃腸道具有很強(qiáng)的抗消化性，作為先頭兵在胃腸道定植下來，構(gòu)成腸道微生物區(qū)系的組成部分(Jostetal,2015)。相比其它來源的益生菌，源于母乳中的益生菌具有更好的抗逆、抑菌、抗感染和保持腸道健康的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5。本發(fā)明提供的鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5的保藏編號為CGMCCNo.12920。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑的新用途。本發(fā)明提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在作為益生菌中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在制備益生菌中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在抑菌中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在制備抑菌產(chǎn)品中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述菌為腸道內(nèi)的有害菌，或，所述腸道內(nèi)的有害菌為大腸埃希菌和/或雞白痢沙門氏菌。本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在維護(hù)人或動(dòng)物腸道健康中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在制備維護(hù)人或動(dòng)物胃腸道健康的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在調(diào)節(jié)人或動(dòng)物胃腸道菌群平衡中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在制備調(diào)節(jié)人或動(dòng)物胃腸道菌群平衡的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑在制備保健食品和/或發(fā)酵食品和/或疫苗佐劑和/或動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為上述鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5或其菌懸液或其培養(yǎng)液或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的菌劑；所述產(chǎn)品具有如下1)-5)中任一種功能：1)制備益生菌；2)抑菌；3)維護(hù)人或動(dòng)物胃腸道健康；4)調(diào)節(jié)人或動(dòng)物胃腸道菌群平衡；5)制備保健食品和/或發(fā)酵食品和/或疫苗佐劑和/或動(dòng)物飼料。上述產(chǎn)品中，所述菌為腸道內(nèi)的有害菌，或，所述腸道內(nèi)的有害菌為大腸埃希菌和/或雞白痢沙門氏菌。本發(fā)明提供了一株具有良好益生活性的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)Z5。本發(fā)明提供的鼠李糖乳桿菌，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號為CGMCCNO.12920。本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)Z5最初來源于人母乳，屬鼠李糖乳桿菌新的亞種，通過實(shí)驗(yàn)證明：該菌株具有耐酸、膽鹽及耐受模擬動(dòng)物胃腸道環(huán)境特性、能抑制腸道內(nèi)有害菌大腸桿菌和沙門氏菌生長、很好地黏附到人和動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞的特性?？捎糜谥苽浔＝∈称贰l(fā)酵食品、疫苗佐劑和動(dòng)物飼料，有助于調(diào)節(jié)人和動(dòng)物胃腸道菌群平衡，維護(hù)人和動(dòng)物的腸道健康。附圖說明圖1為菌株在MRS-Ca培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鈣溶圈。圖2為鼠李糖乳桿菌Z5的菌體形態(tài)。圖3為鼠李糖乳桿菌Z5的16SrDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖4為鼠李糖乳桿菌Z5菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖5為鼠李糖乳桿菌Z5全基因組同源基因分析。圖6為鼠李糖乳桿菌Z5發(fā)酵上清液對致病菌的抑菌作用。圖7為鼠李糖乳桿菌Z5與Caco-2細(xì)胞黏附的顯微結(jié)構(gòu)。保藏說明菌種名稱：鼠李糖乳桿菌拉丁名：Lactobacillusrhamnosus菌株編號：Z5保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年9月1日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12920具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、人母乳來源的鼠李糖乳桿菌Z5的分離和鑒定一、人母乳來源的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)Z5的分離1、人母乳樣品的采集成熟母乳樣品(產(chǎn)婦生產(chǎn)后10天)由北京地區(qū)孕足月順產(chǎn)產(chǎn)婦提供，產(chǎn)婦身體狀況良好，無乳腺炎等疾病。母乳取樣方法參考Martín發(fā)明的方法并稍做改進(jìn)，采樣前用無菌水清洗乳頭及乳暈部分，并棄去前500μL母乳，無菌離心管中收集5-10ml成熟母乳。同時(shí)，用滅菌棉簽取乳頭及乳暈部分皮膚樣本，樣本放入?yún)捬醣辛⒓此椭翆?shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離篩選(從取樣到菌種分離時(shí)間不超過3小時(shí))。2、乳酸菌的分離篩選(1)初篩本發(fā)明目的是從母乳中篩選能夠產(chǎn)乳酸的乳酸菌，因此利用乳酸菌發(fā)酵糖產(chǎn)酸使菌落周圍碳酸鈣溶解的原理來鑒別乳酸菌。具體操作為：取新采集的母乳及皮膚樣本1mL加入9mLPBS緩沖液(137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，pH6.8)中，在試管中依次進(jìn)行十倍梯度稀釋制備稀釋樣本懸液，從最大稀釋度開始依次取0.1mL加入培養(yǎng)皿中，采用混菌法將每個(gè)培養(yǎng)皿中分別傾注于40～50℃含0.3％碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基(北京索萊寶生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號：M8540-250)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，培養(yǎng)基冷卻后，倒置培養(yǎng)于37℃厭氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48h至長出單個(gè)菌落。挑選光滑、凸圓、白色或乳白色、有較大透明圈特征的菌落，于MRS固體培養(yǎng)基劃線分離，厭氧培養(yǎng)48h，待長出單菌落后觀察記錄菌落形狀、大小、色澤、透明度等，進(jìn)行革蘭氏染色并于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，具體操作：吸取5μl處于對數(shù)生長期的待測菌液于載玻片上，將菌液盡量涂成一層薄的菌膜后自然風(fēng)干，玻片向上在酒精燈上固定三次，將草酸銨結(jié)晶紫滴于固定好的菌液表面初染1min，用蒸餾水充分淋洗，滴加碘液媒染1-2min后水洗，用95％的乙醇脫色并水洗，最后用沙黃復(fù)染1-2min水洗充分后風(fēng)干，在電子顯微鏡下觀察結(jié)果，從低倍鏡到高倍鏡，最后用油鏡觀察，染色結(jié)果呈藍(lán)紫色為革蘭氏陽性菌，紅色為革蘭氏陰性菌。(2)復(fù)篩將初篩獲得的產(chǎn)酸且革蘭氏陽性的菌落通過過氧化氫酶接觸試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，具體操作為：將生長旺盛的待測菌液接種在MRS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后，將3-15％(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫滴加在菌苔上，待3-5min后觀察，若有氣泡產(chǎn)生則為陽性，若不出現(xiàn)泡則為陰性。將體積分?jǐn)?shù)為3％過氧化氫溶液滴于鏡檢為革蘭氏陽性的菌落上，若無氣泡，初步鑒定為過氧化氫酶陰性。然后將其純化菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧連續(xù)培養(yǎng)24-48h，-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。并將分離得到的菌種命名為Z5。二、人母乳來源的鼠李糖乳桿菌Z5的鑒定1、個(gè)體形態(tài)及菌落特征新鮮母乳及皮膚樣本梯度稀釋后采用混菌法涂布于含0.3％碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基(MRS-Ca培養(yǎng)基)中，將產(chǎn)透明圈的菌落進(jìn)行復(fù)檢，初步鑒定為過氧化氫酶陰性的菌落，在含0.3％碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基平板上分離純化后，觀察菌落形態(tài)，菌落呈圓形，表面光滑，乳白色，邊緣整齊中間突起較白，經(jīng)革蘭氏染色在油鏡下觀察菌體特征，G+，短桿狀，呈短鏈狀排列。分離菌株在MRS-Ca培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鈣溶圈見圖1，分離菌株Z5經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡下形態(tài)見圖2。2、生理生化鑒定(1)淀粉水解試驗(yàn)牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中加入0.2％可溶性淀粉滅菌后劃線接種，37℃培養(yǎng)24-48h后滴加少量盧戈氏碘液，若有無色透明圈則淀粉被水解呈陽性，若出現(xiàn)深藍(lán)色，則為陰性。(2)酪素水解5g脫脂奶粉于50ml蒸餾水與1.5g瓊脂于50ml蒸餾水，115℃，30min分開滅菌后待冷卻至45-50℃時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板，每皿點(diǎn)接3-5株菌，37℃培養(yǎng)1-5d，觀察菌落周圍酪素是否已被分解而呈透明。(3)明膠液化試驗(yàn)將活力較好的菌液穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)，另取未接種試管作為對照，待菌株培養(yǎng)24-48h后放在4℃冰箱或冷水中，觀察凝固情況，當(dāng)對照管凝固后，將全部菌株取出，逐日觀察液化情況結(jié)果(避免室溫高導(dǎo)致的培養(yǎng)基自行融化)。若接種管液化則為陽性反應(yīng)，若接種管凝固則為陰性反應(yīng)。(4)硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)采用三氯化鐵明膠培養(yǎng)基滅菌后趁熱加入5ml滅菌的10％氯化鐵溶液。立即以無菌操作分裝試管，達(dá)5-6cm高，迅速冷凝成高層。穿刺接種，培養(yǎng)于37℃觀察7天，培養(yǎng)基變黑色者為陽性。(5)石蕊牛乳試驗(yàn)含0.004％溴甲酚紫的脫脂牛乳中，接種1％待測菌液，37℃培養(yǎng)24-48h后，觀察牛乳顏色，由于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，培養(yǎng)基有紫紅色變?yōu)辄S色為陽性。(6)糖發(fā)酵試驗(yàn)取含有0.004％溴甲酚紫的棉籽糖、蔗糖、山梨醇、乳果糖、纖維二糖、麥芽糖培養(yǎng)基的試管中接入1％待測菌液，并做對照，將上述已接種的糖發(fā)酵試管和對照管均置于37℃培養(yǎng)24h-48h，觀察試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。上述檢測結(jié)果見表1。該菌分泌胞外多糖，菌株不水解淀粉，明膠不液化，接觸酶陰性，不水解酪素，不產(chǎn)生H2S，石蕊牛乳試驗(yàn)陽性，可以利用山梨醇、纖維二糖、乳果糖、麥芽糖、蔗糖、不利用棉籽糖。根據(jù)生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定該菌為鼠李糖乳桿菌。表1生理生化試驗(yàn)結(jié)果注：“+”表示菌株陽性；“-”表示菌株陰性3、分子鑒定(1)16SrDNA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建以分離菌株Z5總DNA為模板，采用通用的16SrDNA引物(27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系(25μL)：上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，基因組DNA0.5μL，10×Buffer(withMg2+)2.5μL，dNTPeach2.5mM1μL，加雙蒸水至25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；循環(huán)30次(94℃，45s變性；55℃，45s退火；72℃，1min延伸)；72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物于4℃終止反應(yīng)保存。將PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約1500bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖3所示。將PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，并將測序結(jié)果通過BLAST與GenBank中的已知細(xì)菌的核酸序列進(jìn)行同源性比對分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，菌株Z5的測序片段長為1438bp，其16SrDNA序列如序列1所示，具有典型的16SrDNA的特征。將獲得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明：菌株Z5的16SrDNA序列與GenBank中同源性最為接近的菌株為鼠李糖乳桿菌菌株(Lactobacillusrhamnosus)；下載同源性較高的細(xì)菌序列，用MEGA軟件進(jìn)行多序列比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株與Lactobacillusrhamnosus登錄號JN703790.1親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)100％，故確定分離得到的菌株為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)，這與形態(tài)學(xué)、生理生化特性結(jié)果一致。序列比對的同源性分析與進(jìn)化樹構(gòu)建如圖4所示。(2)鼠李糖乳桿菌Z5的全基因測序及比對分析委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)Z5的全基因測序，并選取NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的所有鼠李糖乳桿菌的基因組序列(表2)與本發(fā)明獲得鼠李糖乳桿菌進(jìn)行全基因比對分析。表2NCBI數(shù)據(jù)庫選取的鼠李糖乳桿菌序號來源GenBank登錄號1LactobacillusrhamnosusATCC53103FM179322.12LactobacillusrhamnosusLc705FM179323.13LactobacillusrhamnosusATCC8530CP003094.14LactobacillusrhamnosusLOCK900CP005484.15LactobacillusrhamnosusBPL5LT220504.16LactobacillusrhamnosusASCC290CP014645.17LactobacillusrhamnosusLMS2-1ACIZ00000000.18LactobacillusrhamnosusCASLAFYD00000000.19LactobacillusrhamnosusATCC21052AFZY00000000.110Lactobacillusrhamnosus769_LRHAJUTS00000000.111LactobacillusrhamnosusDSM20021AZCQ00000000.112LactobacillusrhamnosusR0011AGKC00000000.113LactobacillusrhamnosusMTCC5462AEYM00000000.114Lactobacillusrhamnosus2166AVFG00000000.2A、同源基因分析采用OrthoMCLv2.0.3軟件對鼠李糖乳桿菌Z5和NCBI數(shù)據(jù)庫中14個(gè)鼠李糖乳桿菌全基因組中所有參與分析的物種的氨基酸(或核苷酸)序列進(jìn)行比對，選取閾值一般在30-80％之間進(jìn)行相似性聚類，獲得同源基因的列表。統(tǒng)計(jì)每一個(gè)蛋白聚類cluster的物種分布情況，進(jìn)行種內(nèi)的范基因組、核心基因組的研究比對。結(jié)果如圖5所示。其中，圖5中心部分表示15個(gè)鼠李糖乳桿菌的共有基因簇為1118個(gè)，遠(yuǎn)端數(shù)字代表不同鼠李糖乳桿菌特有的基因簇?cái)?shù)量。從圖中可以看出，鼠李糖乳桿菌Z5特有的基因簇?cái)?shù)量為213個(gè)，證明該菌在基因組序列上與其它菌株存在著較大差異。B、平均核苷酸相似度(ANI)分析利用Jspecies(http://imedea.uib-csic.es/jspecies/)軟件分析物種全基因組之間平均核苷酸相似度(ANI)的特征性，屬間、種間及亞種間兩兩菌株間ANI與其分類地位相關(guān)，具有明顯的屬種特異性，其中屬間的ANI值分布于50-65％，種間的ANI值分布于65-90％，亞種間的ANI值分布于90-99％，同時(shí)基因組中的四核苷酸(Tetra)回歸系數(shù)與ANI值具有相關(guān)性，表現(xiàn)明顯屬種特征性。同源基因是物種構(gòu)建親緣進(jìn)化關(guān)系的依據(jù)，平均核苷酸相似度是基于物種全基因組系列，通過分析比較同源基因序列來判定物種間的遺傳關(guān)聯(lián)性的重要參數(shù)。與單基因如16SrDNA基因相比，其親緣性不受單個(gè)基因或者少數(shù)基因變化的遺傳速率和基因水平轉(zhuǎn)移影響。ANI與16SrDNA基因序列的同源性相關(guān)，并且可以克服在種水平上0-30％平均核苷酸錯(cuò)配種存在的0-5％的16SrDNA基因錯(cuò)配引起的16SrDNA基因不充分的問題。證實(shí)ANI與作為原核生物基因組中基因組標(biāo)簽的四核苷酸(Tetra)具有相關(guān)性，Tetrade頻率具有種屬特異性。鼠李糖乳桿菌Z5與已發(fā)表的14個(gè)鼠李糖乳桿菌的全基因進(jìn)行平均核苷酸相似度分析(ANI)，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌Z5與其它亞種間的ANI值分布于97-99％(表3)。以上結(jié)果證明，從人母乳中分離到的鼠李糖乳桿菌Z5是鼠李糖乳桿菌一個(gè)新的亞種。表3不同鼠李糖乳桿菌的平均核苷酸相似度分析綜合上述鑒定結(jié)果表明，Z5菌株的分類命名為鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosus，該菌株已于2016年9月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.12920。實(shí)施例2、鼠李糖乳桿菌Z5作為益生菌的體外活性評價(jià)1、Z5菌株酸耐受能力的測定將鼠李糖乳桿菌Z5接種于不同pH值(pH2.5、pH3.0、pH6.5)的MRS培養(yǎng)基中，在37℃厭氧條件下培養(yǎng)0h、3h和6h，每組三個(gè)平行，采用活菌計(jì)數(shù)法觀察該菌株耐酸情況并計(jì)算存活率。結(jié)果如表4所示，Z5菌株在pH2.5條件下6h后活菌數(shù)lgcfu/ml值由初始0h時(shí)7.25變?yōu)?h后6.35，存活率為87.58％，在pH3.0條件下6h后活菌數(shù)lgcfu/ml值由初始0h時(shí)7.91變?yōu)?h后7.75，菌株存活率仍達(dá)到97.98％，說明Z5菌株具有較強(qiáng)的酸耐受力。表4不同pH值條件下菌株存活數(shù)與存活率2、Z5菌株膽鹽耐受能力的測定將鼠李糖乳桿菌Z5菌株分別接種于含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)牛膽鹽(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，產(chǎn)品目錄號：01-017)(0.05％、0.1％、0.15％、0.20％)的MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃厭氧的條件下恒溫培養(yǎng)0h、3h和6h，每組三個(gè)平行，采用活菌計(jì)數(shù)法觀察該菌株耐酸情況并計(jì)算存活率。結(jié)果如表5所示，Z5菌株在膽鹽濃度為0.05％條件下培養(yǎng)6h，菌株存活不受膽鹽影響，能繼續(xù)生長，活菌數(shù)的lgcfu/ml值由初始0h時(shí)7.61變?yōu)?h后8.00，存活率達(dá)到105.06％；隨著膽鹽濃度的升高，各菌株的生長受到不同程度的抑制，在0.15g/L的膽鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)6h后，其存活率達(dá)到76.14％，當(dāng)膽鹽濃度為0.2％較高時(shí)，菌株受到嚴(yán)重的抑制，表現(xiàn)為不生長，存活數(shù)為0。表5不同濃度膽鹽條件下乳酸菌的存活數(shù)與存活率3、Z5菌株耐人工胃、腸液能力的測定人工胃腸液配制方法參照Carteris的模擬胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體系。人工胃液的配制：胃蛋白酶(Sigma-aldrich公司，產(chǎn)品目錄號CAS：8049-47-6)溶于PBS緩沖液至終濃度為3g/L，調(diào)節(jié)pH至3.0，過濾除菌；人工腸液的配制：胰蛋白酶(Sigma-aldrich公司，產(chǎn)品目錄號CAS：9001-75-6)和牛膽鹽溶于PBS緩沖液至終濃度分別為1g/L和0.1％，調(diào)節(jié)pH為8.0。將傳代2次的鼠李糖乳桿菌Z5接種于上述配置的人工胃液0h，3h后采用平板計(jì)數(shù)法，計(jì)算其人工胃液耐受存活率，每組三個(gè)平行。將在pH3.0人工胃液中消化3h后的1.0ml供試菌液，轉(zhuǎn)接入9.0ml人工腸液中，繼續(xù)消化0h、3h后采用平板計(jì)數(shù)法，計(jì)算其人工腸液耐受存活率，每組三個(gè)平行。結(jié)果如圖6所示：將鼠李糖乳桿菌Z5接種于pH值為3.0的人工胃液3h后，其活菌數(shù)基本不受影響，存活率保持在92％以上，隨即分別接入pH值為8.0的人工腸液后菌株仍然保持較高的存活率，高達(dá)96.42，如表6所示。這一結(jié)果說明鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusZ5具有較強(qiáng)抗人工胃液消化能力。表6人工胃、腸液條件下乳酸菌的存活數(shù)與存活率4、抑制致病菌試驗(yàn)將含有指示菌致病性大腸埃希菌(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，CVCC3367)、雞白痢沙門氏菌(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，CVCC520)種子液(109cfu/mL)混入50℃左右的LB培養(yǎng)基中，搖勻，傾注于冷卻的瓊脂平皿上，其上垂直放入已滅菌的牛津杯(內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高10mm)，待上層LB瓊脂培養(yǎng)基凝固后，取出牛津杯，在牛津杯形成的孔中加入200μL鼠李糖乳桿菌Z5發(fā)酵上清液，同時(shí)，等量MRS液體培養(yǎng)基作對照，室溫下放置4h后，37℃恒溫培養(yǎng)24-48h，觀察測量抑菌圈直徑，每組三個(gè)平行。將鼠李糖乳桿菌Z5發(fā)酵上清液加入到含有指示菌致病性大腸埃希菌、雞白痢沙門氏菌種子液的瓊脂平皿上，發(fā)現(xiàn)Z5對上述兩株菌的生長都表現(xiàn)出了抑制作用(圖6)，抑菌圈直徑分別為21.25±0.35mm和22.5±0.71mm。說明鼠李糖乳桿菌Z5對兩株致病菌均有明顯的抑制作用。5、Z5菌株對Caco-2細(xì)胞黏附能力的測定從液氮罐中取出Caco-2細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)，并迅速解凍，培養(yǎng)在7mlMEM完全培養(yǎng)基(10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中復(fù)蘇，細(xì)胞生長在37℃，CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部貼壁量達(dá)80％以上，用含0.05％胰酶、0.53mMEDTA的消化液處理3min后加入3mLMEM含10％熱滅活的FBS中止反應(yīng)，將消化后細(xì)胞傳代至24孔板中進(jìn)行粘附試驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞長滿整個(gè)24孔板底部時(shí)，調(diào)整鼠李糖乳桿菌Z5菌液濃度(濃度約為1×107)，用PBS(pH7.4)清洗每孔細(xì)胞后，每孔添加1ml鼠李糖乳桿菌Z5菌液，37℃培養(yǎng)90min進(jìn)行黏附試驗(yàn)。黏附完成后，PBS每孔清洗3次未被黏附的細(xì)菌，再加入1ml無菌蒸餾水37℃孵育60min進(jìn)行細(xì)胞裂解，將每孔中的細(xì)胞與菌懸液全部吸出，梯度稀釋后涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，每組3個(gè)平行，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算鼠李糖乳桿菌Z5與Caco-2的粘附情況。Caco-2細(xì)胞經(jīng)活化傳代培養(yǎng)后，24孔板中每板約為5×105個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過37℃孵育90min后，可黏附8.8×105個(gè)鼠李糖乳桿菌Z5，相當(dāng)于1個(gè)Caco-2細(xì)胞能黏附1-2個(gè)鼠李糖乳桿菌Z5。同時(shí)在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌Z5菌體黏附時(shí)形態(tài)完整，并且能夠黏附在Caco-2單層細(xì)胞的刷狀邊緣上(如圖7所示)。說明鼠李糖乳桿菌Z5有很好地黏附到人和動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞的特性，可用于制備保健食品、發(fā)酵食品、疫苗佐劑和動(dòng)物飼料，有助于調(diào)節(jié)人和動(dòng)物胃腸道菌群平衡，維護(hù)人和動(dòng)物的腸道健康。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所<120>一株人母乳來源的鼠李糖乳桿菌及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>1438bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1tcgacgagtatctgattattagaaaggtgcttgcatcttgatttaattttgaacgagtgg60cggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaaca120gatgctaataccgcataaatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagc180tatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaacggctcaccaag240gcaatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggccc300aaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagc360aacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatgg420tcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacg480tgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaag540cgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagtgca600tcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaa660atgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacg720ctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaa780acgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaag840cattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgc900acaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttga960catcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgc1020atggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccc1080ttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccgg1140aggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgct1200acaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccatt1260ctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcg1320gatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatg1380agagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaaccctttagggagcgagccgtctaagt1438當(dāng)前第1頁1 2 3