本發(fā)明屬于篩選生物菌株用于改良鹽漬化土壤的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種耐高鹽固氮菌株篩選的方法以及相關(guān)培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
我國設(shè)施栽培的蔬菜主要密集于經(jīng)濟(jì)效益相對較高的果菜類作物。果菜類生產(chǎn)要求較高的水肥投入，隨著栽培年限的增加，會導(dǎo)致土壤次生鹽漬化、微生物區(qū)系失衡等問題。其中土壤鹽漬化鹽堿是制約農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)和可持續(xù)發(fā)展的重要影響因素之一。鹽漬化土壤在全世界廣為分布，全世界鹽堿地面積約9.5億hm2，約占陸地總面積的7.6％。中國鹽堿地面積約占全國耕地面積的20％。近年來，土壤鹽漬化的問題日趨嚴(yán)峻。
利用生物學(xué)技術(shù)，如應(yīng)用耐鹽生物菌株改善鹽漬化土壤的質(zhì)量是目前亟待解決的熱點問題。土壤微生物具有較強的恢復(fù)性，并且恢復(fù)鹽漬化土壤中的微生物多樣性是發(fā)揮和改良土壤功能的保證。因而獲得良好的且能夠適應(yīng)于、存活于鹽漬化土壤中的生物菌株則顯得十分必要。但是，目前的耐鹽菌株篩選方法的篩選效率低、篩選的菌株耐鹽度低、且種類有限，難以滿足鹽漬化土壤治理需求。
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述技術(shù)缺陷，迫切需要研制一種篩選用于改良鹽漬化土壤的生物菌株的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，提供一種從冰菜(Mesembryanthemum crystallinum L.)中篩選耐高鹽固氮菌株的方法及其相關(guān)培養(yǎng)基，其能提高耐鹽菌株篩選的效率，不僅能夠獲得數(shù)量多且耐高鹽的固氮菌株，而且增加了耐鹽固氮菌株的種類，為鹽漬化的土壤治理提供了良好的固定氮元素的生物菌株資源。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種從冰菜中篩選耐高鹽固氮菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)、制備細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基
按以下配方配制固氮培養(yǎng)基，并將配制的固氮培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的固氮培養(yǎng)基滅菌25分鐘，得到細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基，所述固氮培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氫鉀0.5g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.01g、混合溶液10ml、氯化鈉10.0g、瓊脂15.0～20.0g和蒸餾水1000ml；
(2)、制備冰菜植物樣品
a)取新鮮的冰菜樣品，進(jìn)行表面消毒，具體步驟如下：采用75％乙醇處理3～5min，之后用無菌水清洗3～5次，再用0.5％次氯酸鈉處理5min，再使用無菌水清洗3～5次；
b)稱取5g表面消毒后的冰菜樣品，加入滅菌研缽中，并加入10ml無菌生理鹽水，研磨成勻漿溶液A；
c)吸取所述勻漿溶液A 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，振蕩1分鐘，得到10-1的稀釋勻漿溶液B；
d)吸取所述稀釋勻漿溶液B 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，得到10-2的稀釋勻漿溶液C；
e)吸取所述稀釋勻漿溶液C 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，得到10-3的稀釋勻漿溶液D；
f)吸取所述稀釋勻漿溶液D 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，得到10-4的稀釋勻漿溶液E；
g)吸取所述稀釋勻漿溶液E 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，得到10-5的稀釋勻漿溶液F；
(3)、分別吸取所述稀釋勻漿溶液D、稀釋勻漿溶液E和稀釋勻漿溶液F各0.2ml，加入到所述細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基中進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)，并在25～28℃下培養(yǎng)4～5天；
(4)、從步驟(3)的培養(yǎng)結(jié)果中挑取菌落，選擇20～200菌落數(shù)的培養(yǎng)皿在所述細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，并在25～28℃下培養(yǎng)4～5天；
(5)、對步驟(4)的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行分離，得到耐高鹽固氮菌株。
進(jìn)一步地，其中，所述從冰菜中篩選耐高鹽固氮菌株的方法進(jìn)一步包括：
(6)、耐高鹽固氮菌株的穩(wěn)定生長
a)制備生長固氮培養(yǎng)基：按以下配方配制生長固氮培養(yǎng)基，并將配制的生長固氮培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的生長固氮培養(yǎng)基滅菌25分鐘，所述生長固氮培養(yǎng)基成分為：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.2g、氯化鈉、混合溶液10ml、瓊脂15.0～20.0g和蒸餾水1000ml，并且，依據(jù)所述氯化鈉的含量分別為10g、12g、15g、18g和21g而配制成多種不同的生長固氮培養(yǎng)基；
b)將所述步驟(5)得到的耐高鹽固氮菌株依次在含有10g、12g、15g、18g和21g氯化鈉的不同生長固氮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在每種生長固氮培養(yǎng)基中在25～28℃條件下培養(yǎng)4～5天，最終純化獲得的菌株即為耐高鹽固氮菌株。
更進(jìn)一步地，其中，所述固氮培養(yǎng)基和所述生長固氮培養(yǎng)基中的混合溶液的組分都為：鉬酸鈉0.025g、硫酸亞鐵0.001g、鉬酸鈉0.025g、三氯化鐵0.05g、生物素0.05g，硫酸錳0.02g、硫酸銅0.008g，用蒸餾水定容至100ml，并且，定容后要用0.22μm濾膜過濾除菌才得所述混合溶液。
此外，本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)耐高鹽固氮菌株的細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基，其特征在于，按以下配方配制固氮培養(yǎng)基，并將配制的固氮培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的固氮培養(yǎng)基滅菌25分鐘，得到細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基，所述固氮培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氫鉀0.5g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.01g、混合溶液10ml、氯化鈉10.0g、瓊脂15.0～20.0g和蒸餾水1000ml；其中，所述混合溶液的組分為：鉬酸鈉0.025g、硫酸亞鐵0.001g、鉬酸鈉0.025g、三氯化鐵0.05g、生物素0.05g，硫酸錳0.02g、硫酸銅0.008g，用蒸餾水定容至100ml，并且，定容后要用0.22μm濾膜過濾除菌才得所述混合溶液。
再次，本發(fā)明還提供一種耐高鹽固氮菌株穩(wěn)定生長用生長固氮培養(yǎng)基，其特征在于，按以下配方配制生長固氮培養(yǎng)基，并將配制的生長固氮培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的生長固氮培養(yǎng)基滅菌25分鐘，所述生長固氮培養(yǎng)基成分為：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.2g、氯化鈉10～21g、混合溶液10ml、瓊脂15.0～20.0g和蒸餾水1000ml，其中，所述混合溶液的組分為：鉬酸鈉0.025g、硫酸亞鐵0.001g、鉬酸鈉0.025g、三氯化鐵0.05g、生物素0.05g，硫酸錳0.02g、硫酸銅0.008g，用蒸餾水定容至100ml，并且，定容后要用0.22μm濾膜過濾除菌才得所述混合溶液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益技術(shù)效果：
一、針對我國設(shè)施蔬菜栽培土壤次生鹽漬化問題，篩選出了適合于鹽漬化土壤施用的菌株。
二、通過本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠提高耐鹽菌株的獲得率，且通過本發(fā)明可顯著提高菌株的耐鹽能力，具體地：通過本發(fā)明，可分離獲得的菌株最高耐鹽濃度達(dá)到18～21％，篩選的菌株數(shù)量占可培養(yǎng)菌落的30～35％，經(jīng)鑒別顯示細(xì)菌的種類保持在5～6類。
三、本發(fā)明為鹽漬化土壤質(zhì)量的治理提供了良好的生物菌株資源。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，實施例的內(nèi)容不作為對本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制。
本發(fā)明涉及從冰菜中篩選耐高鹽固氮菌株的方法，其包括以下步驟：
首先，制備細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基。具體方法如下：
按以下配方配制固氮培養(yǎng)基，并將配制的固氮培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的固氮培養(yǎng)基滅菌25分鐘，得到細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基。其中，所述固氮培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氫鉀0.5g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.01g、混合溶液10ml、氯化鈉10.0g、瓊脂15.0～20.0g和蒸餾水1000ml。
優(yōu)選地，所述混合溶液的組分為：鉬酸鈉0.025g、硫酸亞鐵0.001g、鉬酸鈉0.025g、三氯化鐵0.05g、生物素0.05g，硫酸錳0.02g、硫酸銅0.008g，用蒸餾水定容至100ml，并且，定容后要用0.22μm濾膜過濾除菌才得所述混合溶液。
其次、制備冰菜植物樣品。具體方法如下：
a)取新鮮的冰菜樣品，進(jìn)行表面消毒。具體步驟如下：采用75％乙醇處理3～5min，之后用無菌水清洗3～5次，再用0.5％次氯酸鈉處理5min，再使用無菌水清洗3～5次。
其中，所述冰菜樣品可以為從安徽合肥、阜南等不同地區(qū)采集的冰菜樣品。為了更好地證明本發(fā)明的效果，優(yōu)選地，可以從上述不同地區(qū)采集10種不同的冰菜樣品，分別采用本發(fā)明的方法進(jìn)行試驗。
b)稱取5g表面消毒后的冰菜樣品，加入滅菌研缽中，并加入10ml無菌生理鹽水，研磨成勻漿溶液A。
c)吸取所述勻漿溶液A 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，振蕩1分鐘，得到10-1的稀釋勻漿溶液B。
d)吸取所述稀釋勻漿溶液B 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，得到10-2的稀釋勻漿溶液C。
e)吸取所述稀釋勻漿溶液C 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，得到10-3的稀釋勻漿溶液D。
f)吸取所述稀釋勻漿溶液D 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，得到10-4的稀釋勻漿溶液E。
g)吸取所述稀釋勻漿溶液E 1ml，加入9ml無菌生理鹽水，得到10-5的稀釋勻漿溶液F。
再次、進(jìn)行菌株平板涂布培養(yǎng)。具體方法如下：
分別吸取所述稀釋勻漿溶液D、稀釋勻漿溶液E和稀釋勻漿溶液F各0.2ml，加入到所述細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基中進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)，并在25～28℃下培養(yǎng)4～5天。
然后、進(jìn)行菌株斜面培養(yǎng)。具體方法如下：
從上述的培養(yǎng)結(jié)果中挑取菌落，選擇20～200菌落數(shù)的培養(yǎng)皿在所述細(xì)菌斜面固體培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，并在25～28℃下培養(yǎng)4～5天。
之后，進(jìn)行菌株分離。具體地，對上述的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行分離，得到耐高鹽固氮菌株。
此外，為了提高菌株的質(zhì)量，所述從冰菜中篩選耐高鹽固氮菌株的方法可以進(jìn)行包括耐高鹽固氮菌株的穩(wěn)定生長。其具體方法如下：
a)制備生長固氮培養(yǎng)基。具體方法如下：
按以下配方配制生長固氮培養(yǎng)基，并將配制的生長固氮培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的生長固氮培養(yǎng)基滅菌25分鐘。所述生長固氮培養(yǎng)基成分為：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.2g、氯化鈉、混合溶液10ml、瓊脂15.0～20.0g和蒸餾水1000ml。并且，依據(jù)所述氯化鈉的含量分別為10g、12g、15g、18g和21g而配制成多種不同的生長固氮培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，所述混合溶液的組分為：鉬酸鈉0.025g、硫酸亞鐵0.001g、鉬酸鈉0.025g、三氯化鐵0.05g、生物素0.05g，硫酸錳0.02g、硫酸銅0.008g，用蒸餾水定容至100ml，并且，定容后要用0.22μm濾膜過濾除菌才得所述混合溶液。
b)將上面得到的耐高鹽固氮菌株依次在含有10g、12g、15g、18g和21g氯化鈉的不同生長固氮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在每種生長固氮培養(yǎng)基中在25～28℃條件下培養(yǎng)4～5天，最終純化獲得的菌株即為耐高鹽固氮菌株。
為了鑒定所培養(yǎng)的耐高鹽固氮菌株的性質(zhì)，需要對耐高鹽固氮菌株進(jìn)行鑒定。在本發(fā)明中，進(jìn)行如下兩種鑒定：
(1)、生理生化鑒定：將培養(yǎng)的菌株依次進(jìn)行革蘭氏染色等指標(biāo)檢測，其包括以下步驟(具體方法參見伯杰氏鑒定手冊細(xì)菌部分Holt,J.G.,Kreig,N.R.,Sneath,P.H.A.,Staley,J.T.,Williams,S.T.,1994,Bergey's manual of systematic bacteriology.Vol.1,9th Edn(Baltimore,MD:Williams&Wilkins),1935-2045)：
在無菌操作臺內(nèi)，挑取生長的菌落，涂片固定。草酸銨結(jié)晶紫染溶液染色1分鐘，洗瓶水洗；加碘液覆蓋涂面染約1分鐘，水洗，用吸水紙吸去水分；加95％酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，30秒后水洗，吸去水分；蕃紅染色液染1分鐘后，洗瓶水洗。自然干燥，顯微鏡下鏡檢，記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，篩選獲得的耐鹽菌株均為革蘭氏陽性菌。
(2)、耐高鹽菌株的固氮基因的PCR擴增，其包括以下步驟(具體方法參見Mirza,B.,Welsh,A.,Rasul,G.,Rieder,J.,Paschke,M.,Hahn,D.,2009,Variation in Frankia Populations of the Elaeagnus Host Infection Group in Nodules of Six Host Plant Species after Inoculation with Soil.Microb Ecol 58,384-393和Tan,J.W.,Thong,K.L.,Arumugam,N.D.,Cheah,W.L.,Lai,Y.W.,Chua,K.H.,Rahim,R.A.,Vikineswary,S.,2009,Development of a PCR assay for the detection of nifH and nifD genes in indigenous photosynthetic bacteria.Int.J.Hydrogen Energy 34,7538-7541。
a、液體培養(yǎng)基制備
按以下配方配制液體培養(yǎng)基，并將配制的液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0～7.2，之后，在壓力為0.3Mpa、溫度為115.0℃下對配制的生長培養(yǎng)基滅菌25分鐘。所述液體培養(yǎng)基成分為：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鉀0.6g、硫酸鈣0.2g、七水硫酸鎂0.2g、氯化鈉10～21g、混合溶液10ml和蒸餾水1000ml。
優(yōu)選地，所述混合溶液的組分為：鉬酸鈉0.025g、硫酸亞鐵0.001g、鉬酸鈉0.025g、三氯化鐵0.05g、生物素0.05g，硫酸錳0.02g、硫酸銅0.008g，用蒸餾水定容至100ml。
將制備好的液體培養(yǎng)基按照30ml體積，分裝于250ml的三角瓶中，滅菌備用。
b、菌株培養(yǎng)
將活化的耐鹽菌在操凈臺中，接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25～28℃、200轉(zhuǎn)/分、培養(yǎng)2～3天，備用。
c、細(xì)菌DNA提取
采用SDS-蛋白酶K法，提取DNA，具體步驟如下：3500r/min離心10min，收集菌體，加入100μl溶菌酶懸浮細(xì)胞，室溫30min；加入10％SDS 150μl，蛋白酶K 10μl，37℃水浴30min，加入300ul 5mol/L醋酸鈉混勻，冰浴5min；10000r/min離心10min，取上清，加入雙倍體積預(yù)冷無水乙醇，離心，干燥沉淀，溶于100μl TE緩沖液，備用或-20℃保存。
d、固氮基因擴增
取上述細(xì)菌DNA，作為PCR模板。具體方法參見：((Mirza,B.,Welsh,A.,Rasul,G.,Rieder,J.,Paschke,M.,Hahn,D.,2009,Variation in Frankia Populations of the Elaeagnus Host Infection Group in Nodules of Six Host Plant Species after Inoculation with Soil.Microb Ecol 58,384-393和Tan,J.W.,Thong,K.L.,Arumugam,N.D.,Cheah,W.L.,Lai,Y.W.,Chua,K.H.,Rahim,R.A.,Vikineswary,S.,2009,Development of a PCR assay for the detection of nifH and nifD genes in indigenous photosynthetic bacteria.Int.J.Hydrogen Energy 34,7538-7541)等報道的方法。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果顯示，篩選獲得菌株具有固氮酶基因，說明篩選的菌株具有固氮能力。
本發(fā)明針對我國設(shè)施蔬菜栽培土壤次生鹽漬化問題，篩選適合于鹽漬化土壤施用的菌株。通過使用本發(fā)明的方法，可分離獲得的菌株最高耐鹽濃度達(dá)到18～21％，篩選的菌株數(shù)量占可培養(yǎng)固氮菌落的30～35％，經(jīng)鑒別顯示細(xì)菌的種類保持在5～6類。本發(fā)明的方法提高了目前對于耐鹽菌株篩選的效率，不僅能夠獲得數(shù)量多且耐高鹽的固氮菌株，而且增加了耐鹽固氮菌株的種類，為鹽漬化的土壤治理提供了良好的固定氮元素的生物菌株資源。
本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。