本發(fā)明涉及羥基酪醇衍生物的制備，更具體地說，涉及一種利用脂肪酶制備羥基酪醇-二十二碳六烯酸酯的方法。

背景技術：

羥基酪醇(3,4-二羥基苯乙醇)是一種天然多酚類化合物，主要來源于橄欖油和加工橄欖油產(chǎn)生的廢水中。相關研究表明，羥基酪醇是一種重要的生物活性物質(zhì)，對人體有許多健康有益作用，如增加人體高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、降低人體脂質(zhì)氧化損傷、抑制炎癥、提升內(nèi)皮功能、降低收縮壓、抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、保護中樞神經(jīng)等。

盡管羥基酪醇對人體有許多健康有益作用，且在腸道內(nèi)吸收較好，但事實上其生物利用度較低。羥基酪醇在腸上皮細胞和肝細胞內(nèi)代謝較快，生成極少量的代謝物，而產(chǎn)生的代謝物在血液和組織內(nèi)的濃度非常低。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于合成羥基酪醇衍生物——羥基酪醇-二十二碳六烯酸酯，可以增強羥基酪醇進入細胞和組織的能力，提高其半衰期；同時保證合成方法反應條件溫和、制備及純化過程簡單、終產(chǎn)物純度高。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種利用脂肪酶制備羥基酪醇-二十二碳六烯酸酯的方法，包括如下步驟：

S1、向羥基酪醇中加入甲基叔丁基醚，超聲充分混勻，得到羥基酪醇溶液，所述羥基酪醇與甲基叔丁基醚摩爾體積比為1:25～50(mol/L)；

S2、取二十二碳六烯酸(DHA)加入到步驟S1所得的羥基酪醇溶液中，超聲充分混勻，得到醇酸混合溶液；所述二十二碳六烯酸與羥基酪醇摩爾比為6～12:1；

S3、取脂肪酶EC 3.1.1.3加入到步驟S2所得的醇酸混合溶液中，密封充氮氣，得到脂肪酶溶液；所述脂肪酶EC 3.1.1.3≥5000U/g，所述脂肪酶EC3.1.1.3與羥基酪醇質(zhì)量體積比為30～60:1(g/mol)；

優(yōu)選方式下，所述脂肪酶EC 3.1.1.3為Novozyme-435，來自南極假絲酵母。

S4、將步驟S3所得的脂肪酶溶液，置于35～50℃，100～200rpm環(huán)境下振蕩反應24～72h后，取出置于冰水浴中冷卻，得酶反應溶液；

S5、將步驟S4所得的酶反應溶液過濾處理，除去脂肪酶，再于35～45℃、相對真空度-0.05～-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；

S6、將步驟S5所得粗產(chǎn)物溶解于體積濃度為95％的乙醇中，加入碳酸鈉、水，氮氣保護，40～50℃下回流皂化20～30min，得皂化溶液；所述粗產(chǎn)物與體積濃度為95％的乙醇質(zhì)量體積比為1:10～20(g/mL)，所述粗產(chǎn)物與碳酸鈉質(zhì)量比為1:0.8～1.2，所述粗產(chǎn)物與水質(zhì)量體積比為1:4～6(g/mL)；

S7、將步驟S6所得的皂化溶液用正己烷萃取1～3次，得到的正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于35～45℃、相對真空度-0.05～-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到羥基酪醇-二十二碳六烯酸酯；每次萃取所用正己烷的體積與步驟S6中所用體積濃度為95％的乙醇的體積的比為2～6:1。

本發(fā)明的技術創(chuàng)新在于：

1、本發(fā)明反應條件溫和，產(chǎn)物酯化率高，制備的羥基酪醇-DHA酯不需要采用柱層析等方法純化，終產(chǎn)物的純度高。

2、本發(fā)明在酶的催化下，將羥基酪醇與二十二碳六烯酸(DHA)反應制備羥基酪醇酯，制得的產(chǎn)品可以增強羥基酪醇進入細胞和組織的能力，提高其半衰期；同時，DHA具有抑制炎癥、降低血脂、增強記憶與思維能力等功能。

3、本發(fā)明通過合成的羥基酪醇-DHA酯，可同時發(fā)揮羥基酪醇和DHA在健康有益方面的作用。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實施例1

S1、取0.1mol羥基酪醇，緩慢加入甲基叔丁基醚，羥基酪醇:甲基叔丁基醚為1:25(mol/L)，超聲充分混勻；

S2、取0.6mol DHA加入S1所得溶液中，然后通過超聲充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme-435，來自南極假絲酵母，EC 3.1.1.3)加入S2所得溶液中，酶:羥基酪醇控制在30:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置于恒溫振蕩器中進行反應，反應溫度為40℃，振蕩速度為100rpm，反應時間為48h。反應完成后，取出置于冰水浴中冷卻；

S5、將S4所得的溶液過濾處理，除去脂肪酶，再于溫度35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；

S6、將S5所得粗產(chǎn)物溶解于體積濃度為95％的乙醇，粗產(chǎn)物:95％乙醇控制在1:15(g/mL)；加入碳酸鈉，粗產(chǎn)物的質(zhì)量:碳酸鈉的質(zhì)量控制在1:0.8(g/g)；加入水，粗產(chǎn)物的質(zhì)量:水的體積控制在1:5(g/mL)，將上述反應混合物在氮氣流保護下，于40℃反應溫度，回流皂化30min；

S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次萃取用正己烷的體積:S5中95％乙醇的體積控制在6:1(mL/mL)，得到的正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到羥基酪醇-DHA酯，其質(zhì)量為19.1833g。

通過上述步驟，羥基酪醇的酯化率為41.3％。采用HPLC-UV(高效液相-紫外檢測器)檢測，羥基酪醇-DHA酯，純度為86.4％。

實施例2

S1、取0.1mol羥基酪醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，羥基酪醇:甲基叔丁基醚控制在1:50(mol/L)，然后通過超聲充分混勻；

S2、取1.2mol DHA加入S1所得溶液中，然后通過超聲充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme-435，來自南極假絲酵母，EC 3.1.1.3)加入S2所得溶液中，酶:羥基酪醇控制在50:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置于恒溫振蕩器中進行反應，反應溫度為45℃，振蕩速度為150rpm，反應時間為48h。反應完成后，取出置于冰水浴中冷卻；

S5、將S4所得的溶液過濾處理，除去脂肪酶，再于溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；

S6、將S5所得粗產(chǎn)物溶解于95％乙醇，粗產(chǎn)物:95％乙醇控制在1:20(g/mL)；加入碳酸鈉，粗產(chǎn)物的質(zhì)量:碳酸鈉的質(zhì)量控制在1:1.2(g/g)；加入水，粗產(chǎn)物:水控制在1:6(g/mL)，將上述反應混合物在氮氣流保護下，于40℃反應溫度，回流皂化30min；

S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在4:1(mL/mL)，得到的正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度45℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到羥基酪醇-DHA酯，其質(zhì)量為19.9265g。

通過上述步驟，羥基酪醇的酯化率為42.9％。采用HPLC-UV(高效液相-紫外檢測器)檢測，羥基酪醇-DHA酯，純度為87.2％。

實施例3

S1、取0.1mol羥基酪醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，羥基酪醇:甲基叔丁基醚控制在1:30(mol/L)，然后通過超聲充分混勻；

S2、取0.8mol DHA加入S1所得溶液中，然后通過超聲充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme-435，來自南極假絲酵母，EC 3.1.1.3)加入S2所得溶液中，酶的質(zhì)量:羥基酪醇的摩爾數(shù)控制在40:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置于恒溫振蕩器中進行反應，反應溫度為40℃，振蕩速度為150rpm，反應時間為48h。反應完成后，取出置于冰水浴中冷卻；

S5、將S4所得的溶液過濾處理，除去脂肪酶，再于溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；

S6、將S5所得粗產(chǎn)物溶解于95％乙醇，粗產(chǎn)物的質(zhì)量:95％乙醇的體積控制在1:15(g/mL)；加入碳酸鈉，粗產(chǎn)物的質(zhì)量:碳酸鈉的質(zhì)量控制在1:0.8(g/g)；加入水，粗產(chǎn)物的質(zhì)量:水的體積控制在1:5(g/mL)，將上述反應混合物在氮氣流保護下，于40℃反應溫度，回流皂化30min；

S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在6:1(mL/mL)，得到的正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到羥基酪醇-DHA酯，其質(zhì)量為19.4156g。

通過上述步驟，羥基酪醇的酯化率為41.8％。采用HPLC-UV(高效液相-紫外檢測器)檢測，羥基酪醇-DHA酯，純度為86.5％。

實施例4

S1、取0.1mol羥基酪醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，羥基酪醇:甲基叔丁基醚控制在1:50(mol/L)，然后通過超聲充分混勻；

S2、取1.2molDHA加入S1所得溶液中，然后通過超聲充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme-435，來自南極假絲酵母，EC 3.1.1.3)加入S2所得溶液中，酶的質(zhì)量:羥基酪醇的摩爾數(shù)控制在60:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置于恒溫振蕩器中進行反應，反應溫度為50℃，振蕩速度為200rpm，反應時間為72h，反應完成后，取出置于冰水浴中冷卻；

S5、將S4所得的溶液過濾處理，除去脂肪酶，再于溫度45℃、相對真空度-0.05Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；

S6、將S5所得粗產(chǎn)物溶解于95％乙醇，粗產(chǎn)物:95％乙醇控制在1:20(g/mL)；加入碳酸鈉，粗產(chǎn)物:碳酸鈉控制在1:1.2(g/g)；加入水，粗產(chǎn)物:水控制在1:6(g/mL)，將上述反應混合物在氮氣流保護下，于50℃反應溫度，回流皂化30min；

S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在4:1(mL/mL)，得到的正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到羥基酪醇-DHA酯，其質(zhì)量為19.6942g。

通過上述步驟，羥基酪醇的酯化率為42.4％。采用HPLC-UV(高效液相-紫外檢測器)檢測，羥基酪醇-DHA酯，純度為87.1％。

實施例5

S1、取0.1mol羥基酪醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，羥基酪醇:甲基叔丁基醚控制在1:40(mol/L)，然后通過超聲充分混勻；

S2、取1molDHA加入S1所得溶液中，然后通過超聲充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme-435，來自南極假絲酵母，EC 3.1.1.3)加入S2所得溶液中，酶:羥基酪醇控制在45:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置于恒溫振蕩器中進行反應，反應溫度為45℃，振蕩速度為150rpm，反應時間為48h，反應完成后，取出置于冰水浴中冷卻；

S5、將S4所得的溶液過濾處理，除去脂肪酶，再于溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；

S6、將S5所得粗產(chǎn)物溶解于95％乙醇，粗產(chǎn)物的質(zhì)量:95％乙醇的體積控制在1:15(g/mL)；加入碳酸鈉，粗產(chǎn)物:碳酸鈉控制在1:1.0(g/g)；加入水，粗產(chǎn)物:水控制在1:5(g/mL)，將上述反應混合物在氮氣流保護下，于50℃反應溫度，回流皂化25min；

S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在4:1(mL/mL)，得到的正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到羥基酪醇-DHA酯，其質(zhì)量為19.4620g。

通過上述步驟，羥基酪醇的酯化率為41.9％。采用HPLC-UV(高效液相-紫外檢測器)檢測，羥基酪醇-DHA酯,純度為86.0％。

實施例6

S1、取0.1mol羥基酪醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，羥基酪醇:甲基叔丁基醚控制在1:45(mol/L)，然后通過超聲充分混勻；

S2、取1mol DHA加入S1所得溶液中，然后通過超聲充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme-435，來自南極假絲酵母，EC 3.1.1.3)加入S2所得溶液中，酶:羥基酪醇控制在50:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置于恒溫振蕩器中進行反應，反應溫度為50℃，振蕩速度為200rpm，反應時間為72h，反應完成后，取出置于冰水浴中冷卻；

S5、將S4所得的溶液過濾處理，除去脂肪酶，再于溫度45℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；

S6、將S5所得粗產(chǎn)物溶解于95％乙醇，粗產(chǎn)物:95％乙醇控制在1:20(g/mL)；加入碳酸鈉，粗產(chǎn)物:碳酸鈉控制在1:1.0(g/g)；加入水，粗產(chǎn)物:水控制在1:6(g/mL)，將上述反應混合物在氮氣流保護下，于40℃反應溫度，回流皂化30min；

S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷：S5中95％乙醇控制在4:1(mL/mL)，得到的正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到羥基酪醇-DHA酯，其質(zhì)量為19.5084g。

通過上述步驟，羥基酪醇的酯化率為42.0％。采用HPLC-UV(高效液相-紫外檢測器)檢測，羥基酪醇-DHA酯，純度為86.7％。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。