本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用米根霉菌體進行全細胞催化制備L-乳酸的方法，具體涉及一種利用高密度米根霉細胞，進行全細胞催化，高通量和快速合成L-乳酸的生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)：

L-乳酸是一種重要的有機酸，在食品行業(yè)、材料行業(yè)有廣泛的應(yīng)用。其作為一種綠色化學(xué)品，可以合成聚乳酸、乳酸乙酯等可降解材料，因而在材料領(lǐng)域備受關(guān)注。米根霉是微生物合成純L-乳酸的主要菌株。目前，米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸最主要的問題是產(chǎn)量低(60-120g/l)，生產(chǎn)強度低(0.7-2.5g/l/h)，糖酸轉(zhuǎn)化率低(90％以下)，從而導(dǎo)致米根霉很難應(yīng)用于L-乳酸的生產(chǎn)。

傳統(tǒng)米根霉生產(chǎn)L-乳酸的技術(shù)中，幾乎都采用分階段的策略，如將乳酸的生產(chǎn)分為菌體生長和酸生產(chǎn)階段，并以此設(shè)計開發(fā)了相應(yīng)的工藝，即：通過提供不同的培養(yǎng)基或者培養(yǎng)策略來適應(yīng)該分階段培養(yǎng)技術(shù)需求。比如，在菌體生長階段，提供相應(yīng)的培養(yǎng)基以供孢子的萌發(fā)以及菌體最初的需要，該培養(yǎng)基中富含菌體生長的營養(yǎng)，如蛋白胨、酵母膏、以及含氮的各種粉漿；在生長階段結(jié)束以后，富含營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基與具有轉(zhuǎn)化能力的菌體被轉(zhuǎn)運至用于生產(chǎn)的培養(yǎng)基中，經(jīng)過新環(huán)境的生長適應(yīng)期，菌體生長并進行乳酸的生產(chǎn)，直至發(fā)酵結(jié)束。其中，分階段發(fā)酵策略最明顯的特征即進行的移種操作，移種量通常為發(fā)酵液體積的5-15％，通常的生長適應(yīng)期也從12-24小時不等。該發(fā)酵策略帶來的技術(shù)問題在于，環(huán)境的改變會帶來遲滯期，遲滯期通常認為是對發(fā)酵不利的，如延長發(fā)酵的周期，部分菌體由于對環(huán)境的改變而失去代謝或者催化能力。為了解決遲滯的問題，現(xiàn)有技術(shù)也采取了各種工藝調(diào)整，如增加移種的量，雖然可以解決部分問題，但是也帶來不利的效果，比如移種量的加大會導(dǎo)致產(chǎn)量下降以及糖酸轉(zhuǎn)化率的降低。

發(fā)明人而在后期的研究過程中，發(fā)現(xiàn)，米根霉菌體培養(yǎng)和產(chǎn)酸可以在同一個培養(yǎng)基中連續(xù)進行(可參見發(fā)明專利：連續(xù)法發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，公開號：CN104498542A)，在這種工藝條件下，米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的菌體量增加了，同時減少了發(fā)酵階段的延滯期，從而使L-乳酸生產(chǎn)強度和產(chǎn)量得到了極大地提高。然而，該方法雖然能極大地提高乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強度，但在進行多批次操作過程中，還存在缺陷，不利于菌體多批次循環(huán)使用。在一步連續(xù)發(fā)酵的基礎(chǔ)上，還需進一步高效利用米根霉菌體，實現(xiàn)米根霉細胞多批次循環(huán)使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

傳統(tǒng)的連續(xù)發(fā)酵的工藝是孢子液接入到培養(yǎng)液中，前期進行米根霉菌體的培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至18-24h時(此時開始有乳酸生成)，減少發(fā)酵液體體積至原體積的50％-70％，菌體量保持不變，即增加菌體密度，繼續(xù)進行產(chǎn)酸。該工藝經(jīng)驗證能極大地提高乳酸的生產(chǎn)強度，縮短發(fā)酵時間，同時，采用連續(xù)補料發(fā)酵，乳酸的產(chǎn)量也得到了極大的提高，但是該工藝存在如下弊端還有待改進：連續(xù)培養(yǎng)過程中，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液較為粘稠，多以乳酸鈣為主，在無菌操作條件下，菌體與發(fā)酵液分離較為困難，菌體較難回收，不利于后期菌體的二次利用，造成菌體的利用率下降，增加生產(chǎn)成本，存在弊端，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；在乳酸發(fā)酵過程中，氮源量較少(培養(yǎng)開始時，添加2-3g/l蛋白胨，蛋白胨基本上用于菌體生長)，因此，發(fā)酵體系中，氮源主要用于米根霉生長，而發(fā)酵期，氮源量較少，菌體生成量較低。氮源主要用于維持細胞代謝，基于此，本發(fā)明改進一步發(fā)酵工藝，提出全細胞催化制備乳酸。

本發(fā)明的目的是克服上述不足之處提供一種高效利用米根霉菌體，實現(xiàn)米根霉細胞多批次循環(huán)使用的米根霉菌體全細胞催化制備L-乳酸的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的：

一種米根霉菌體全細胞催化制備L-乳酸的方法，該方法包括將米根霉孢子液接入到菌體培養(yǎng)液中進行米根霉菌體培養(yǎng)，米根霉菌體培養(yǎng)18-24小時后，過濾，回收菌體，將回收后的菌體置入催化反應(yīng)器中，以菌體培養(yǎng)液為催化體系，過量的碳酸鈣作為中和劑，通過補加葡萄糖進行全細胞乳酸催化反應(yīng)，直至反應(yīng)至菌體培養(yǎng)液基本成固狀且糖耗在5g/l以下結(jié)束，過濾，分離菌體和乳酸鈣，回收的菌體繼續(xù)在催化反應(yīng)器中以菌體培養(yǎng)液為催化體系，過量的碳酸鈣作為中和劑，通過補加葡萄糖進行全細胞乳酸催化反應(yīng)，如此循環(huán)，直到菌體催化效率降至50％以下。

該工藝極大地簡化乳酸合成工藝，降低生產(chǎn)成本，同時增加菌體的使用次數(shù)。

所述的通過補加葡萄糖進行全細胞乳酸催化反應(yīng)具體為：當(dāng)葡萄糖耗至5g/l以下，補加葡萄糖，每次補糖30-60g/l，繼續(xù)在催化反應(yīng)器中與菌體培養(yǎng)液進行催化反應(yīng)，直至反應(yīng)至菌體培養(yǎng)液基本成固狀且糖耗在5g/l以下結(jié)束。上述補加葡萄糖總量為160-200g/l。

全細胞乳酸催化反應(yīng)過程中乳酸轉(zhuǎn)化溫度30℃，攪拌速度100-150r/min。

米根霉菌體培養(yǎng)采用的條件為5L發(fā)酵罐培養(yǎng)，30℃，轉(zhuǎn)速150-300r/min，通氣量0.5-1vvm，培養(yǎng)18-24h。得到米根霉細胞。

米根霉菌體培養(yǎng)采用的菌體培養(yǎng)液：葡萄糖20-40g/l，蛋白胨3-5g/l，KH₂PO₄ 0.2-0.4g/l，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4g/l。

制備孢子液過程如下：將米根霉菌體放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)7天，然后用無菌水把PDA表面的真菌孢子洗下來，濃度為1*10⁸個孢子/ml。

米根霉菌種可以為米根霉NRRL-395，來源R.oryzae LA-UN-1；也可以選擇通用米根霉菌種。

與現(xiàn)有技術(shù)比較本發(fā)明的有益效果：一步連續(xù)發(fā)酵過程中，前期采用無菌發(fā)酵培養(yǎng)得到米根霉菌體，后期產(chǎn)酸階段，本發(fā)明改變傳統(tǒng)的無菌發(fā)酵模式，利用米根霉菌體進行全細胞催化制備L-乳酸，菌體在催化多次循環(huán)利用后，L-乳酸的產(chǎn)量、生產(chǎn)強度、糖酸轉(zhuǎn)化率均未有顯著改變。因此，利用米根霉全細胞催化制備L-乳酸，具有更大的優(yōu)勢，更有利于大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步說明:

實施例1

米根霉菌體放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，在30℃的溫度下培養(yǎng)七天。然后用無菌水把PDA表面的真菌孢子洗下來，濃度為1*10⁸個孢子/ml，并放置在在4℃的環(huán)境中保存。

5L發(fā)酵罐培養(yǎng)，5L發(fā)酵罐裝液量為3L培養(yǎng)液，取50ml濃度10⁸個/ml的孢子液加入發(fā)酵罐，200-300r/min，通氣量1vvm，30℃培養(yǎng)24h后，過濾，得到米根霉菌體細胞，過濾液作為催化體系的催化液繼續(xù)使用。

菌體培養(yǎng)基：葡萄糖2g/l，蛋白胨3g/l，KH₂PO₄ 0.2g/l，MgSO₄·7H₂O 0.2g/l。

將得到的米根霉菌體細胞，經(jīng)過濾后，分別取2g干重/L，4g干重/L，6g干重/L，8g干重/L，10g干重/L的米根霉菌體細胞，置于1000ml的三口反應(yīng)瓶，裝液量為500ml，以菌體培養(yǎng)液(菌體培養(yǎng)液是前述發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體得到的過濾液)為催化體系，添加碳酸鈣作為中和劑，通過補加葡萄糖進入反應(yīng)瓶，進行全細胞催化實驗，每次補糖50g/l，當(dāng)糖耗至5g/l以下，繼續(xù)補糖，補糖總量為160g/l(考慮到催化液基本成固狀，不利于轉(zhuǎn)化)，反應(yīng)至糖耗在5g/l以下結(jié)束。L-乳酸轉(zhuǎn)化溫度30℃，攪拌速度100r/min。

表1不同細胞濃度對細胞催化的影響

可以看出，隨著菌體量的增加，其催化效果越好，當(dāng)菌體量達到10g/l時，其生產(chǎn)強度達到了4.74g/l/h，基本與細菌合成L-乳酸的生產(chǎn)強度相當(dāng)。以10g/l菌體量為標(biāo)準，繼續(xù)考察循環(huán)催化生產(chǎn)L-乳酸的效率變化。

每一次催化，都是以總糖160g/l為基準，10g/l菌體干重為催化量，每次催化技術(shù)后，用水過濾菌體，后繼續(xù)置入催化液進行催化，只到循環(huán)催化10批次。

表2循環(huán)次數(shù)對催化的影響

從表2中可以看出，利用米根霉全細胞催化合成L-乳酸，當(dāng)催化合成10批次后，乳酸的產(chǎn)量，生產(chǎn)強度并未有較大變化，可見，利用米根霉全細胞催化合成L-乳酸，突破了傳統(tǒng)的米根霉發(fā)酵合成L-乳酸的瓶頸限制，已經(jīng)具備了工業(yè)化生產(chǎn)的能力。

對比例1

按照CN104498542A實施例步驟生產(chǎn)L-乳酸，實驗結(jié)果如表3：

表3

表4

從表3-4中可以看出，利用一步發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸，在菌體利用一次時，乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率相對較高，但隨著循環(huán)批次的進行，乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強度都明顯下降，循環(huán)六次時，本工藝的乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強度都比連續(xù)發(fā)酵提高了69％和300％。