本發(fā)明屬于微生物飼料發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)含共軛亞油酸發(fā)酵物的制備方法。
背景技術(shù)：
共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid ，CLA)是由必需脂肪酸亞油酸衍生的共軛雙烯酸的多種位置和幾何異構(gòu)體的總稱。CLA是一種非常令人感興趣的營(yíng)養(yǎng)添加劑，已大量用于農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)。目前，盡管對(duì)CLA 的功能尚未有完整的了解，但CLA 已被證實(shí)具有重要的生理功能，包括抗癌，降低血液和肝臟膽固醇，強(qiáng)化免疫，促生長(zhǎng)，改善肉品質(zhì)，抑制脂肪沉積等。具有活性的CLA異構(gòu)體主要存在于反芻（瘤胃）動(dòng)物的乳脂及肉制品中，含量甚微(每克乳脂中含CLA 2～25 mg) ，難以富集，而且多種異構(gòu)體并存，難以純化。普通植物油中幾乎不含CLA ，只有在一些稀有植物種子中發(fā)現(xiàn)有共軛多烯酸的存在，但未發(fā)現(xiàn)具有生理活性的異構(gòu)體的存在。目前，CLA 作為一種天然的功能性脂肪酸被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中，具有減少體脂、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、改善胴體品質(zhì)等特殊生理功能，在畜禽生產(chǎn)中受到高度重視。
天然CLA 主要存在于反芻動(dòng)物的乳脂及其肉制品中，是亞油酸和亞麻酸在瘤胃微生物作用下發(fā)生氫化反應(yīng)然后在去飽和酶作用下生成的。在一些植物中也發(fā)現(xiàn)了CLA 的存在，但是含量非常少，動(dòng)物產(chǎn)品中所含的CLA 較植物油中多。在動(dòng)物中，反芻動(dòng)物組織中CLA 含量較非反芻動(dòng)物組織高。
天然CLA 的數(shù)量難以滿足日常的使用需求，因此大量研究者通過其他方法合成能夠使用的CLA。CLA 的化學(xué)合成一般以亞油酸或富含油酸、亞油酸的植物油( 如脫水蓖麻油、紅花油、亞麻油、棉籽油、玉米胚芽油和葵花籽油) 為原料，采用生物化學(xué)的方法進(jìn)行誘導(dǎo)異構(gòu)化，可得到多種異構(gòu)體的混合物，主要為cis- trans、trans - cis 異構(gòu)體和少量的cis - cis、trans - trans 異構(gòu)體?；瘜W(xué)合成法的缺點(diǎn)是合成的CLA 是多種異構(gòu)體的混合物，難以分離、純化得到單個(gè)異構(gòu)體，這也限制了產(chǎn)品的應(yīng)用。因此，尋求一種新的方法替代化學(xué)合成。與化學(xué)合成相比，微生物發(fā)酵法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，可以得到較單一的異構(gòu)體，與天然食物中CLA 異構(gòu)體組成相似，安全性較高，有利于產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用。
目前常用于微生物發(fā)酵產(chǎn)共軛亞油酸的菌株有乳酸菌、丁酸弧菌、瘤胃菌、丙酸桿菌、雙歧桿菌等。這些菌株在合適的基料中培養(yǎng)，然后在一定條件下轉(zhuǎn)化亞油酸生成CLA，這緣于所篩選的菌株在生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生亞油酸異構(gòu)酶，該酶具有專一性，能將底物亞油酸轉(zhuǎn)化為特定的、比較純的活性異構(gòu)體，所以利用乳酸菌等微生物來生產(chǎn)CLA 具有非常重大的意義。然而微生物發(fā)酵產(chǎn)共軛亞油酸方法的缺點(diǎn)是生產(chǎn)CLA 的菌株大多數(shù)為嚴(yán)格厭氧菌，在工業(yè)或?qū)嶒?yàn)室中不易培養(yǎng)且產(chǎn)量較低，難以廣泛應(yīng)用；過量的游離亞油酸和副產(chǎn)物的生成會(huì)抑制產(chǎn)CLA 菌株的生長(zhǎng)，從而影響其轉(zhuǎn)化率；亞油酸在水中的溶解度低，會(huì)阻礙轉(zhuǎn)化效率。因此，需要尋找新的發(fā)酵方法解決現(xiàn)有的技術(shù)以及已有專利存在的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)含共軛亞油酸發(fā)酵物的制備方法，它能夠解決目前天然共軛亞油酸數(shù)量難以滿足日常的使用需求，具有轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量較大、應(yīng)用廣發(fā)等特點(diǎn)。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)含共軛亞油酸發(fā)酵物的制備方法，其制備步驟是：
（1）配制發(fā)酵基質(zhì)：選取適量的米糠、大豆粉及大米粉，并將各原料通過95 kw隧道式微波機(jī)進(jìn)行微波處理，微波時(shí)間為4 min，冷卻后再用1.0mm篩片的粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎制得發(fā)酵基質(zhì)；
（2）配制菌種混合液：先按照料液比1: 7的比例準(zhǔn)備好乳酸桿菌和啤酒酵母菌種，再選取適量米粉倒入10 m3的發(fā)酵罐中，再加入適量的水，煮沸20 min，冷卻到95℃，加入適量液化酶，酶解2～4h，將發(fā)酵罐的溫度降至65℃，加入適量糖化酶，酶解24～48h，酶解結(jié)束后，將溫度降至到37℃，將已經(jīng)活化好的乳酸桿菌和啤酒酵母菌種加入酶解好10 m3米乳罐中進(jìn)行擴(kuò)培，37℃溫度發(fā)酵，制得菌種混合液；
（3）將步驟（2）制得的菌種混合液通過流量計(jì)計(jì)量后與步驟（1）配制好的發(fā)酵基質(zhì)通過攪拌機(jī)混合攪拌均勻后經(jīng)輸送至滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵混合物；
（4）將發(fā)酵混合物加入烘干機(jī)進(jìn)行烘干，烘干降溫后進(jìn)行粉碎，得到富含有共軛亞油酸發(fā)酵物。
所述步驟（1）中各物質(zhì)質(zhì)量百分比配方為米糠50-90%，大豆粉5-40%，大米粉，5-10%。
在所述步驟（2）中菌種混合液與發(fā)酵基質(zhì)混合時(shí)控制混合物中的水分為35%。
所述步驟（2）發(fā)酵前1～3 d進(jìn)行有氧發(fā)酵，溫度控制在25～32℃，每隔2～4 h輸入過濾空氣，發(fā)酵72小時(shí)后停止輸入過濾空氣；第4～25 d后為厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在35～42℃，每隔2小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)5～10 min。
所述共軛亞油酸發(fā)酵物含有共軛亞油酸≥6.0%。
本發(fā)明的積極效果是：它能夠解決目前天然共軛亞油酸數(shù)量和品質(zhì)難以滿足日常的使用需求，具有轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量較大、應(yīng)用廣發(fā)等特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)含共軛亞油酸發(fā)酵物的制備方法，其制備步驟是：
（1）配制發(fā)酵基質(zhì)：選取適量的米糠、大豆粉及大米粉，并將各原料通過95 kw隧道式微波機(jī)進(jìn)行微波處理，微波時(shí)間為4 min，冷卻后再用1.0mm篩片的粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎制得發(fā)酵基質(zhì)；
（2）配制菌種混合液：先按照料液比1: 7的比例準(zhǔn)備好乳酸桿菌和啤酒酵母菌種，再選取適量米粉倒入10 m3的發(fā)酵罐中，再加入適量的水，煮沸20 min，冷卻到95℃，加入適量液化酶，酶解2～4h，將發(fā)酵罐的溫度降至65℃，加入適量糖化酶，酶解24～48h，酶解結(jié)束后，將溫度降至到37℃，將已經(jīng)活化好的乳酸桿菌和啤酒酵母菌種加入酶解好10 m3米乳罐中進(jìn)行擴(kuò)培，37℃溫度發(fā)酵，制得菌種混合液；
（3）將步驟（2）制得的菌種混合液通過流量計(jì)計(jì)量后與步驟（1）配制好的發(fā)酵基質(zhì)通過攪拌機(jī)混合攪拌均勻后經(jīng)輸送至滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵混合物；
（4）將發(fā)酵混合物加入烘干機(jī)進(jìn)行烘干，烘干降溫后進(jìn)行粉碎，得到富含有共軛亞油酸發(fā)酵物。
所述步驟（1）中各物質(zhì)質(zhì)量百分比配方為米糠50-90%，大豆粉5-40%，大米粉，5-10%。
在所述步驟（2）中菌種混合液與發(fā)酵基質(zhì)混合時(shí)控制混合物中的水分為35%。
所述步驟（2）發(fā)酵前1～3 d進(jìn)行有氧發(fā)酵，溫度控制在25～32℃，每隔2～4 h輸入過濾空氣，發(fā)酵72小時(shí)后停止輸入過濾空氣；第4～25 d后為厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在35～42℃，每隔2小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)5～10 min。
所述共軛亞油酸發(fā)酵物含有共軛亞油酸≥6.0%。
具體實(shí)施例1
（1）配制發(fā)酵基質(zhì)：按照下列發(fā)酵基質(zhì)配方配制發(fā)酵物，米糠10000kg，大豆粉8000kg，大米粉2000kg，將上述配方中各種原料通過隧道式微波機(jī)（95 kw）進(jìn)行微波處理，微波時(shí)間為4 min，冷卻后再用粉碎機(jī)（1mm篩子）進(jìn)行粉碎。
（2）菌種制備，按照料液比1: 7的比例準(zhǔn)備好的乳酸桿菌和啤酒酵母培養(yǎng)基。具體操作步驟如下：
A．將1 000 kg米粉倒入10 m3的發(fā)酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷卻到95 ℃，加入300 mL液化酶，酶解1 h，再將發(fā)酵罐的溫度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解24h，酶解結(jié)束后，將溫度降至到37℃。
B．配制菌種混合液：將2000mL已經(jīng)活化好的乳酸桿菌和啤酒酵母菌種加入酶解好10 m3米乳罐中進(jìn)行擴(kuò)培，37℃溫度發(fā)酵24h，作為發(fā)酵種子，備用。
（3）將擴(kuò)培后的發(fā)酵種子與粉碎后的發(fā)酵基質(zhì)混合，混合時(shí)控制混合物中的水分為35%，混合均勻倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵前3d進(jìn)行有氧發(fā)酵，溫度控制在28℃，每隔4 h輸入過濾空氣，第4d后為厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在37℃，停止輸入過濾空氣，每隔2小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)5～10分鐘，發(fā)酵25d。
（4）將滾筒中發(fā)酵好的固態(tài)發(fā)酵物加入到烘干機(jī)中進(jìn)行烘干，烘干時(shí)入口溫度控制在不高于115℃，出口溫度控制為小于65℃，烘干50 min后物料進(jìn)行降溫粉碎，然后進(jìn)行包裝。
具體實(shí)施例2
（1）配制發(fā)酵基質(zhì)：按照下列發(fā)酵基質(zhì)配方配制發(fā)酵物，米糠12000 kg，大豆粉6000 kg，大米粉2000 kg，將上述配方中各種原料通過隧道式微波機(jī)（95 kw）進(jìn)行微波處理，微波時(shí)間為4 min，冷卻后再用粉碎機(jī)（1 mm篩子）進(jìn)行粉碎。
（2）菌種制備，按照料液比1: 7的比例準(zhǔn)備好的乳酸桿菌和啤酒酵母的培養(yǎng)基。具體操作步驟如下：
A．將1000 kg米粉倒入10 m3的發(fā)酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷卻到95℃，加入300 mL液化酶，酶解2 h，再將發(fā)酵罐的溫度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解36h，酶解結(jié)束后，將溫度降至到37℃。
B．配制菌種混合液：將2000mL已經(jīng)活化好的乳酸桿菌和啤酒酵母菌種加入酶解好10 m3米乳罐中進(jìn)行擴(kuò)培，37℃溫度發(fā)酵36h，作為發(fā)酵種子，備用。
（3）將擴(kuò)培后的發(fā)酵種子與粉碎后的發(fā)酵基質(zhì)混合，混合時(shí)控制混合物中的水分為35%，混合均勻倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵前3d進(jìn)行有氧發(fā)酵，溫度控制在28℃，每隔4 h輸入過濾空氣；第4d后為厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在37℃，停止輸入過濾空氣，每隔2小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)5～10分鐘，發(fā)酵25d。
（4）將滾筒中發(fā)酵好的固態(tài)發(fā)酵物加入到烘干機(jī)中進(jìn)行烘干，烘干時(shí)入口溫度控制不高于115℃，出口溫度控制小于60℃，烘干50 min后物料進(jìn)行降溫粉碎，然后進(jìn)行包裝。
具體實(shí)施例3
（1）配制發(fā)酵基質(zhì)：按照下列發(fā)酵基質(zhì)配方配制發(fā)酵物，米糠14000kg，大豆粉4000kg，大米粉2000kg，將上述配方中各種原料通過隧道式微波機(jī)（95 kw）進(jìn)行微波處理，微波時(shí)間為4 min，冷卻后再用粉碎機(jī)（1mm篩子）進(jìn)行粉碎。
（2）菌種制備，按照料液比1:7的比例準(zhǔn)備好的乳酸桿菌和啤酒酵母培養(yǎng)基。具體操作步驟如下：
A．將1 080 kg米粉倒入10 m3的發(fā)酵罐中，再加入7.5m3水，煮沸20 min，冷卻到95℃，加入300 mL液化酶，酶解4 h，再將發(fā)酵罐的溫度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解48h，酶解結(jié)束后，將溫度降至到37℃。
B．配制菌種混合液：將2000mL已經(jīng)活化好的乳酸桿菌和啤酒酵母菌種加入酶解好10 m3米乳罐中進(jìn)行擴(kuò)培，37℃溫度發(fā)酵24h，作為發(fā)酵種子，備用。
（3）將擴(kuò)培后的發(fā)酵種子與粉碎后的發(fā)酵基質(zhì)混合，混合時(shí)控制混合物中的水分為35%，混合均勻倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵前3d進(jìn)行有氧發(fā)酵，溫度控制在28℃，每隔4 h輸入過濾空氣，第4d后為厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在37℃，停止輸入過濾空氣，每隔2小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)5～10分鐘，發(fā)酵25d。
（4）將滾筒中發(fā)酵好的固態(tài)發(fā)酵物加入到烘干機(jī)中進(jìn)行烘干，烘干時(shí)入口溫度控制不高于115℃，出口溫度控制為小于65℃，烘干50 min后物料進(jìn)行降溫粉碎，然后進(jìn)行包裝。
具體實(shí)施例4
（1）配制發(fā)酵基質(zhì)：按照下列發(fā)酵基質(zhì)配方配制發(fā)酵物，米糠16000kg，大豆粉2000kg，大米粉2000kg，將上述配方中各種原料通過隧道式微波機(jī)（95 kw）進(jìn)行微波處理，微波時(shí)間為4min，冷卻后再用粉碎機(jī)（1mm篩子）進(jìn)行粉碎。
（2）菌種制備，按照料液比1:7的比例準(zhǔn)備好的乳酸桿菌和啤酒酵母培養(yǎng)基。具體操作步驟如下：
A．將1 000 kg米粉倒入10 m3的發(fā)酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷卻到95℃，加入300 mL液化酶，酶解4 h，再將發(fā)酵罐的溫度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解48h，酶解結(jié)束后，將溫度降至到37℃。
B．配制菌種混合液：將2000mL已經(jīng)活化好的乳酸桿菌和啤酒酵母菌種加入酶解好10 m3米乳罐中進(jìn)行擴(kuò)培，37℃溫度發(fā)酵48h，作為發(fā)酵種子，備用。
（3）將擴(kuò)培后的發(fā)酵種子與粉碎后的發(fā)酵基質(zhì)混合，混合時(shí)控制混合物中的水分為35%，混合均勻倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵前4d進(jìn)行有氧發(fā)酵，溫度控制在28℃，每隔4 h輸入過濾空氣，第5d后為厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在37℃，停止輸入過濾空氣，每隔2小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)5～10分鐘，發(fā)酵25d。
（4）將滾筒中發(fā)酵好的固態(tài)發(fā)酵物加入到烘干機(jī)中進(jìn)行烘干，烘干時(shí)入口溫度控制不高于115℃，出口溫度控制為小于60℃，烘干50 min后物料進(jìn)行降溫粉碎，然后進(jìn)行包裝。
具體實(shí)施例5
（1）配制發(fā)酵基質(zhì)：按照下列發(fā)酵基質(zhì)配方配制發(fā)酵物，米糠17000kg，大豆粉1000kg，大米粉2000kg，將上述配方中各種原料通過隧道式微波機(jī)（95 kw）進(jìn)行微波處理，微波時(shí)間為4 min，冷卻后再用粉碎機(jī)（1mm篩子）進(jìn)行粉碎。
（2）菌種制備，按照料液比1:7的比例準(zhǔn)備好的乳酸桿菌和啤酒酵母培養(yǎng)基。具體操作步驟如下：
A．將1 000 kg米粉倒入10 m3的發(fā)酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷卻到95℃，加入300 mL液化酶，酶解4 h，再將發(fā)酵罐的溫度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解48h，酶解結(jié)束后，將溫度降至到37℃。
B．配制菌種混合液：將2000mL已經(jīng)活化好的乳酸桿菌和啤酒酵母菌種加入酶解好10 m3米乳罐中進(jìn)行擴(kuò)培，37℃溫度發(fā)酵48h，作為發(fā)酵種子，備用。
（3）將擴(kuò)培后的發(fā)酵種子與粉碎后的發(fā)酵基質(zhì)混合，混合時(shí)控制混合物中的水分為35%，混合均勻倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵前4d進(jìn)行有氧發(fā)酵，溫度控制在28℃，每隔4 h輸入過濾空氣，第5d后為厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在37℃，停止輸入過濾空氣，每隔2小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)5～10分鐘，發(fā)酵25d。
（4）將滾筒中發(fā)酵好的固態(tài)發(fā)酵物加入到烘干機(jī)中進(jìn)行烘干，烘干時(shí)入口溫度控制不高于115℃，出口溫度控制為小于60℃，烘干50 min后物料進(jìn)行降溫粉碎，然后進(jìn)行包裝。
具體實(shí)施例6
（1）配制發(fā)酵基質(zhì)：按照下列發(fā)酵基質(zhì)配方配制發(fā)酵物，米糠18000kg，大豆粉1000kg，大米粉1000kg，將上述配方中各種原料通過隧道式微波機(jī)（95 kw）進(jìn)行微波處理，微波時(shí)間為4 min，冷卻后再用粉碎機(jī)（1mm篩子）進(jìn)行粉碎。
（2）菌種制備，按照料液比1:7的比例準(zhǔn)備好的乳酸桿菌和啤酒酵母。具體操作步驟如下：
A．將1000 kg米粉倒入10 m3的發(fā)酵罐中，再加入7m3水，煮沸20 min，冷卻到95℃，加入300 mL液化酶，酶解4 h，再將發(fā)酵罐的溫度降至65℃，加入500 mL糖化酶，酶解48h，酶解結(jié)束后，將溫度降至到37℃。
B．配制菌種混合液：將2000mL已經(jīng)活化好的乳酸桿菌和啤酒酵母菌種加入酶解好10 m3米乳罐中進(jìn)行擴(kuò)培，37℃溫度發(fā)酵48h，作為發(fā)酵種子，備用。
（3）將擴(kuò)培后的發(fā)酵種子與粉碎后的發(fā)酵基質(zhì)混合，混合時(shí)控制混合物中的水分為35%，混合均勻倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，倒入滾筒中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵前4d進(jìn)行有氧發(fā)酵，溫度控制在28℃，每隔24h輸入過濾空氣，第5d后為厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在37℃，停止輸入過濾空氣，每隔2小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)5～10分鐘，發(fā)酵25d。
（4）將滾筒中發(fā)酵好的固態(tài)發(fā)酵物加入到烘干機(jī)中進(jìn)行烘干，烘干時(shí)入口溫度控制不高于115℃，出口溫度控制為小于60℃，烘干50 min后物料進(jìn)行降溫粉碎，然后進(jìn)行包裝。