本發(fā)明屬于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于碳氮流定向調(diào)控的混菌發(fā)酵“一鍋法”生產(chǎn)微生物油脂的方法，該方法能夠顯著提高混菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化生物質(zhì)生產(chǎn)油脂產(chǎn)量和得率。
背景技術(shù)：
自然界中某些酵母菌、霉菌、細(xì)菌和藻類在特定條件下，能夠以碳水化合物、碳?xì)浠衔?、二氧化碳等為碳源，在體內(nèi)合成并貯存大量油脂，凡是可以在胞內(nèi)積累油脂并超過(guò)細(xì)胞干重20％w/w(這里w/w表示質(zhì)量比，下同)的微生物稱為產(chǎn)油微生物。微生物油脂，尤其是產(chǎn)油酵母產(chǎn)生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸組成與商品化的動(dòng)植物油脂相似，可作為生物柴油的替代原料。相對(duì)于動(dòng)植物油脂，微生物油脂生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)與氣候限制，原料來(lái)源廣，基本不占用額外耕地資源，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，是極具潛力的新型油脂資源。利用生物質(zhì)資源中的碳水化合物制備微生物油脂，作為生物柴油和功能性油脂的替代原料，是生物煉制的一個(gè)嶄新研究方向。然而，基于生物質(zhì)原料的復(fù)雜特性，當(dāng)前產(chǎn)油酵母轉(zhuǎn)化生物質(zhì)原料制備油脂面臨油脂產(chǎn)量低和工藝流程長(zhǎng)的突出問題。
誘導(dǎo)產(chǎn)油酵母油脂的過(guò)量積累通常需要營(yíng)養(yǎng)限制，其中氮限制是當(dāng)前誘導(dǎo)油脂過(guò)量積累最有效的策略。生物質(zhì)原料來(lái)源廣泛，利用其培養(yǎng)產(chǎn)油酵母，有可能大幅度降低原料成本，并使規(guī)?；苽湮⑸镉椭脑牧系玫奖Ｕ?。然而，生物質(zhì)原料，尤其是草本生物質(zhì)和農(nóng)業(yè)廢棄生物質(zhì)，除可提供碳水化合物外，還富含微生物生長(zhǎng)繁殖必需的其它營(yíng)養(yǎng)組分，其中較高的氮含量，特別不利于誘發(fā)微生物過(guò)量積累油脂，導(dǎo)致油脂產(chǎn)量和油脂得率較低。研究發(fā)現(xiàn)，只要實(shí)現(xiàn)低氮營(yíng)養(yǎng)脅迫，產(chǎn)油酵母就能夠高效地積累油脂。因此，過(guò)量氮源的移除是將生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化為微生物油脂的關(guān)鍵。采用化學(xué)或生物的方法，部分脫除生物質(zhì)原料中的氮、磷等組分，實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)脅迫，可誘發(fā)油脂的過(guò)量積累。然而，這些策略增加了操作工藝，并導(dǎo)致碳水化合物的損失，經(jīng)濟(jì)性很差。
另外，當(dāng)前利用生物質(zhì)原料制備微生物油脂還存在著工藝流程長(zhǎng)的突出問題。統(tǒng)合生物加工(Consolidated bioprocessing,CBP)是指將纖維素酶的生產(chǎn)、酶水解、己糖和戊糖油脂發(fā)酵進(jìn)行高度整合，由同一株菌完成的技術(shù)。由于產(chǎn)油酵母本身并不具備纖維素酶的生產(chǎn)能力，采用重組策略獲得的產(chǎn)油酵母工程菌產(chǎn)酶性能一般，當(dāng)前尚未見產(chǎn)油酵母采用CBP技術(shù)直接轉(zhuǎn)化生物質(zhì)高效制備微生物油脂的報(bào)道。
一種非常有潛力的替代方案是混菌發(fā)酵，即采用高產(chǎn)纖維素酶的霉菌和高產(chǎn)油脂的產(chǎn)油酵母共培養(yǎng)的方式，可實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)原料的“一鍋法”制備微生物油脂。理想狀態(tài)下，前者利用生物質(zhì)中不利于微生物激發(fā)油脂積累的過(guò)量氮源的合成纖維素酶，水解生物質(zhì)為后者提供足夠的碳源，同時(shí)創(chuàng)造誘發(fā)產(chǎn)油酵母油脂過(guò)量積累的氮源脅迫環(huán)境；而后者則主要在氮源營(yíng)養(yǎng)脅迫下，將水解所得的碳水化合物導(dǎo)向油脂合成。然而，當(dāng)前混菌發(fā)酵技術(shù)仍然存在著纖維素酶生產(chǎn)、微生物生長(zhǎng)及油脂積累不協(xié)調(diào)的突出問題；霉菌消耗過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)成分，尤其是碳源，導(dǎo)致用于合成油脂的碳源顯著減少，油脂產(chǎn)量低下。因此，混菌發(fā)酵時(shí)，實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)原料中碳、氮源轉(zhuǎn)化的定向調(diào)控，是強(qiáng)化油脂生產(chǎn)的關(guān)鍵。為了更高效的利用生物質(zhì)資源，需要開發(fā)一種簡(jiǎn)單的調(diào)控方法，實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)原料中碳、氮源的定向轉(zhuǎn)化，解決混菌發(fā)酵過(guò)程中非產(chǎn)油菌株消耗過(guò)多碳源導(dǎo)致油脂產(chǎn)量低的突出問題，顯著提高油脂產(chǎn)量和得率，對(duì)混菌發(fā)酵技術(shù)高效制備微生物油脂具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種基于碳氮流定向調(diào)控的混菌發(fā)酵“一鍋法”生產(chǎn)微生物油脂的方法，旨在解決當(dāng)前混菌發(fā)酵過(guò)程中非產(chǎn)油菌株消耗過(guò)多碳源導(dǎo)致油脂產(chǎn)量低的突出問題，本方法能夠顯著提高油脂產(chǎn)量和得率。
本發(fā)明提出一種基于碳氮流定向調(diào)控的混菌發(fā)酵“一鍋法”生產(chǎn)微生物油脂的方法，具體包括如下步驟：
預(yù)處理生物質(zhì)原料，調(diào)整固液質(zhì)量比至5％-20％，不添加或者少量添加營(yíng)養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)pH至4.0-6.0，高溫濕熱滅菌，制備混菌發(fā)酵培養(yǎng)基；
將里氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶基因敲除，獲得里氏木霉工程菌；
挑取里氏木霉工程菌和產(chǎn)油酵母，分別接種于對(duì)應(yīng)的液體種子培養(yǎng)基中，得到工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液；
將兩種種子液接種至所述混菌發(fā)酵養(yǎng)基中，于25℃-37℃通氣培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基中碳水化合物及其聚合物濃度低于5g/L，終止發(fā)酵，固液分離收集沉淀物；
沉淀物采用酸熱-有機(jī)溶劑法提取油脂。
本發(fā)明的有益效果是：
里氏木霉是一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，其纖維素酶系具有很高的外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶活力，而β-葡萄糖苷酶活性極低，可將纖維素不完全水解為纖維寡糖；產(chǎn)油酵母如彎曲隱球酵母則具有高效的寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和很高的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性，能高效轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝纖維寡糖并大量積累油脂；本發(fā)明首先敲除里氏木霉的關(guān)鍵β-葡萄糖苷酶基因，然后將里氏木霉工程菌和彎曲隱球酵母混合培養(yǎng)，根據(jù)重組里氏木霉和彎曲隱球酵母酶譜互補(bǔ)性和寡糖代謝能力的差異，使得混菌發(fā)酵時(shí)，前者主要利用生物質(zhì)原料中的過(guò)量氮源營(yíng)養(yǎng)合成纖維素酶，水解生物質(zhì)為自身難代謝的寡糖，同時(shí)創(chuàng)造誘發(fā)產(chǎn)油酵母油脂過(guò)量積累的氮源脅迫環(huán)境；而后者則主要在氮源營(yíng)養(yǎng)脅迫下，將水解所得的寡糖主要導(dǎo)向油脂合成，最終實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)原料中碳、氮流的定向自調(diào)控，顯著提高油脂產(chǎn)量和得率。另外，本發(fā)明采用混菌發(fā)酵，將纖維素酶的生產(chǎn)、酶水解和油脂發(fā)酵高度整合，實(shí)現(xiàn)了生物質(zhì)“一鍋法”轉(zhuǎn)化高效制備微生物油脂。綜上所述，本發(fā)明為生物質(zhì)經(jīng)濟(jì)、高效轉(zhuǎn)化制備酵母油脂提供新的方法。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明通過(guò)合理選擇產(chǎn)纖維素酶的菌株和產(chǎn)油酵母菌株，并對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株的酶譜進(jìn)行改造，使得混菌培養(yǎng)時(shí)，前者的主要目的是利用生物質(zhì)原料中過(guò)量的氮源營(yíng)養(yǎng)合成纖維素酶，水解生物質(zhì)為自身難代謝的寡糖，同時(shí)創(chuàng)造誘發(fā)產(chǎn)油酵母油脂過(guò)量積累的氮源脅迫環(huán)境；而后者則主要在氮源營(yíng)養(yǎng)脅迫下，將水解所得的寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)主要導(dǎo)向油脂合成，最終顯著提高混菌發(fā)酵生產(chǎn)油脂的產(chǎn)量和得率。方法極其簡(jiǎn)單，避免了當(dāng)前混菌發(fā)酵技術(shù)中非產(chǎn)油菌株消耗過(guò)多碳源導(dǎo)致油脂產(chǎn)量低的突出問題，顯著提高油脂產(chǎn)量和得率，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明方法具體包括如下步驟：
步驟S101、預(yù)處理生物質(zhì)原料，調(diào)整固液質(zhì)量比至5％-20％，不添加或者少量添加營(yíng)養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)pH至4.0-6.0，高溫濕熱滅菌，制備混菌發(fā)酵培養(yǎng)基。
本步驟所采用的預(yù)處理方法為常用的物理、化學(xué)、物理化學(xué)或生物的生物質(zhì)預(yù)處理方法。
本步驟不添加或添加少量的營(yíng)養(yǎng)成分，包括磷源、硫源和維生素，如硫酸鹽、磷酸鹽、硫胺素等或它們的組合，其中磷源占混菌發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量的0.01％-2％、硫源占混菌發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量的0.01％-1％、維生素占混菌發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量的0.001％以內(nèi)。
本步驟所適用的生物質(zhì)原料為主要成份為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和粗蛋白的生物質(zhì)材料。包括玉米秸稈、玉米芯、稻草、稻殼和麥稈等農(nóng)業(yè)生物質(zhì)，水葫蘆、浮萍和稗子等雜草，柳枝稷和芒草等能源植物中的一種或二種以上組合。
步驟S102、于無(wú)菌操作環(huán)境中，挑取里氏木霉工程菌和產(chǎn)油酵母，分別接種于各自液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，于25℃-37℃通氣培養(yǎng)12-48h，得到工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液。
本步驟中里氏木霉工程菌株所用的液體種子培養(yǎng)基可為營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基或產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基；產(chǎn)油酵母所用的液體種子培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。比如里氏木霉工程菌株所用的液體種子培養(yǎng)基為PDA或產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基；產(chǎn)油酵母選擇彎曲隱球酵母，所用的液體種子培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基。
本步驟中，里氏木霉工程菌為產(chǎn)纖維素酶的菌株，為已敲除其主要的β-葡萄糖苷酶基因如bgl1/Cel3a、Cel1a或Cel1b等的里氏木霉Trichoderma reesei工程菌株，產(chǎn)油微生物為彎曲隱球酵母Cryptococcus curvatus。以上菌株可以直接從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)、中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)、英國(guó)國(guó)家菌株保藏中心(UKNCC)或德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSMZ)等菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買或從自然界中分離，也可以使用與原來(lái)菌株性狀不同的人工或自然突變菌株。
步驟S103、將這兩種種子液接種至所述混菌發(fā)酵養(yǎng)基中，接種總量為2％-20％(v/v)，即接種的兩種種子液與混菌發(fā)酵養(yǎng)基的體積比為2％-20％，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例為0.2:1至1:0.2(v/v)，于25℃-37℃通氣培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基中碳水化合物及其聚合物濃度之和低于5g/L，終止發(fā)酵，固液分離收集沉淀物。
步驟S104、所得沉淀物使用酸熱-有機(jī)溶劑法提取油脂。
這里收集得到的沉淀物為微生物菌體，菌體中含未被利用的生物質(zhì)，然后從收集的菌體中抽提獲得油脂，計(jì)算菌體油脂產(chǎn)量。所述微生物油脂主要為長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物的甘油酯，經(jīng)轉(zhuǎn)酯化后，可制成生物柴油，比如在酸催化條件下轉(zhuǎn)酯化制備生物柴油；或參照文獻(xiàn)(里偉，等.過(guò)程工程學(xué)報(bào),2007,7(1):137–140)的方法，提取微生物油脂，在酶催化條件下轉(zhuǎn)酯化制備生物柴油。另外，微生物油脂含有的不飽和脂肪酸還可用于制備其他高附加值產(chǎn)品。
下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。以下實(shí)施例選取了典型的木質(zhì)纖維素和粗甘油原料為材料培養(yǎng)典型產(chǎn)油微生物的例子，有助于了解本發(fā)明，但不以任何形式限制將本發(fā)明應(yīng)用于其他材料或產(chǎn)油酵母菌株。
對(duì)比例1
1)水葫蘆培養(yǎng)基的制備：稱取100g過(guò)20目篩的水葫蘆，加入1L 2％(w/w)的H2SO4中，按照固液比10％(w/w)，于120℃預(yù)處理60min；調(diào)整固液比至8％(w/w)，調(diào)整pH至5.2后于121℃滅菌20min后備用；
2)在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入綠色木霉Trichoderma viride ATCC 28038(購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏管理中心)，于28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得綠色木霉種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏管理中心)，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量10％(v/v)，里氏木霉種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例0.5:1(v/v)，在30℃下通氣培養(yǎng)120h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量1.9g/L，油脂得率為2.4g/100gds。
對(duì)比例2
1)水葫蘆培養(yǎng)基的制備：稱取100g過(guò)20目篩的水葫蘆，加入1L 2％(w/w)的NaOH中，按照固液比10％(w/w)，于80℃預(yù)處理60min；調(diào)整固液比至8％(w/w)，調(diào)整pH至5.0后于121℃滅菌20min后備用；
2)在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入里氏木霉Trichoderma reesei QM 9414，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得里氏木霉種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，里氏木霉種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例0.5:1(v/v)，在30℃下通氣培養(yǎng)120h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量3.5g/L，油脂得率為4.4g/100gds。
實(shí)施例1
1)水葫蘆培養(yǎng)基的制備：水葫蘆預(yù)處理同對(duì)比例1的步驟1)，調(diào)整固液比至8％(w/w)，調(diào)整pH至5.2后于121℃滅菌20min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel1a△cel1b；在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例0.5:1(v/v)，在30℃下通氣培養(yǎng)120h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量5.5g/L，油脂得率為6.9g/100gds。
實(shí)施例2
1)玉米秸稈培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)(Li BZ,et al.Bioresour Technol,2010,101:1285–1292)，稱取50g過(guò)40目篩的玉米秸稈，氨和玉米秸稈質(zhì)量比2:1(w/w)，于140℃氨爆處理5min；調(diào)整固液比至15％(w/w)，調(diào)整pH至5.0后于121℃滅菌15min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel3a△cel1a△cel1b；在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例0.5:1(v/v)，在30℃下通氣培養(yǎng)192h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量11.7g/L，油脂得率為7.8g/100gds。
實(shí)施例3
1)稗子培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)(Ruan ZH,et al.Biotechnol Bioeng,2013,110:1039–1049)，稱取50g直徑小于1mm的稗子粉末，加入500mL 2％(w/w)的稀硫酸中，固液比10％(w/w)，于130℃處理60min；調(diào)整固液比至5％(w/w)，調(diào)整pH至4.8后于121℃滅菌20min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel1a，在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例0.5:1(v/v)，在28℃下通氣培養(yǎng)168h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量2.7g/L，油脂得率為5.4g/100gds。
實(shí)施例4
1)玉米芯培養(yǎng)基的制備：稱取50g過(guò)20目篩的玉米芯，按20％(w/w)的固液比添加2.5％(w/w)的硫酸浸潤(rùn)24h后，190℃水蒸汽氣爆處理3min；調(diào)整固液比至12％(w/w)，調(diào)整pH至6.0后于121℃滅菌18min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei Rut 30 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel3a，在纖維二糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)48h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例1:1(v/v)，在37℃下通氣培養(yǎng)200h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量8.1g/L，油脂得率為6.8g/100gds。
實(shí)施例5
1)稻草培養(yǎng)基的制備：稱取50g過(guò)20目篩的稻草粉，按20％(w/w)的固液比添加2.5％(w/w)的硫酸浸潤(rùn)24h后，190℃水蒸汽氣爆處理3min；調(diào)整固液比至8％(w/w)，調(diào)整pH至6.0后于121℃滅菌18min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei ATCC 26921 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel1a△cel1b，在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20508，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)12h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中先后接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，先接種工程菌種子液，然后接種產(chǎn)油酵母種子液，間隔時(shí)間為24h，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例為0.5:1(v/v)，在34℃下通氣培養(yǎng)120h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量6.3g/L，油脂得率為7.8g/100gds。
實(shí)施例6
1)小麥桿培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)(Perez JA,et al.Fuel,2008,87:3640–3647)的優(yōu)化方法，稱取50g過(guò)20目篩的小麥桿，進(jìn)行高溫水熱預(yù)處理；調(diào)整固液比至15％(w/w)，調(diào)整pH至5.0后于121℃滅菌20min后備用；
2)用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel3a△cel1a，在CaCO3誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)48h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例0.2:1(v/v)，在25℃下通氣培養(yǎng)196h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量10.8g/L，油脂得率為7.2g/100gds。
實(shí)施例7
1)浮萍培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)(Perez JA,et al.Fuel,2008,87:3640–3647)的優(yōu)化方法，稱取50g過(guò)20目篩的浮萍粉，進(jìn)行高溫水熱預(yù)處理；調(diào)整固液比至7％(w/w)，調(diào)整pH至5.0后于121℃滅菌20min后備用；
2)用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel3a△cel1b，在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)36h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20508，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中先后接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為2％(v/v)，先接彎曲隱球酵母C.curvatus，48h后再接入T.reesei工程菌，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例1:0.2(v/v)，在28℃下通氣培養(yǎng)144h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量5.7g/L，油脂得率為8.1g/100gds。
實(shí)施例8
1)柳枝稷培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)(Varga E,et al.Appl Biochem Biotechnol,2004,113,509–523)的氣爆方法，稱取50g過(guò)40目篩的柳枝稷，進(jìn)行氣爆預(yù)處理；調(diào)整固液比至12％(w/w)，調(diào)整pH至5.5后于121℃滅菌20min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel3a△cel1a△cel1b，在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量20％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例1:0.5(v/v)，在30℃下通氣培養(yǎng)172h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量9.2g/L，油脂得率為7.7g/100gds。
實(shí)施例9
1)芒草培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)(Park JY,et al.Bioresour Technol,2010,101:6805–6811)，稱取50g過(guò)40目篩的芒草進(jìn)行生石灰預(yù)處理；調(diào)整固液比至10％(w/w)，調(diào)整pH至5.0后于121℃滅菌20min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel3a△cel1b，在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例1:0.5(v/v)，在32℃下通氣培養(yǎng)180h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量7.5g/L，油脂得率為7.5g/100gds。
實(shí)施例10
1)稻殼培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)(Zhang J,et al.Bioresour Technol,2011,102:4480–4488)，以稻殼為原料，干燥，粉碎過(guò)40目篩，并用2.5％的硫酸浸漬18h,190℃蒸汽處理3min后，稀釋至料液比為10％(w/w)，調(diào)pH 4.8后于121℃滅菌20min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel3a△cel1a△cel1b，在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 96219，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例0.2:1(v/v)，在30℃下通氣培養(yǎng)168h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量5.7g/L，油脂得率為5.7g/100gds。
實(shí)施例11
1)棉花稈培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)(Singh P,et al.Word J Microbiol Biot,2008,24,667–673)生物預(yù)處理的方法，稱取50g過(guò)40目篩的棉花稈，采用白腐真菌固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理；調(diào)整固液比至16％(w/w)，調(diào)整pH至4.0后于121℃滅菌20min后備用；
2)采用同源雙交換，構(gòu)建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突變體△cel1b，在PDA液體種子培養(yǎng)基中接入該工程菌株，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得工程菌種子液；在YEPD液體種子培養(yǎng)基中接入彎曲隱球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得產(chǎn)油酵母種子液；
3)向步驟1)所得培養(yǎng)基中同時(shí)接入步驟(2)制備的兩種種子液，接種總量為10％(v/v)，工程菌種子液和產(chǎn)油酵母種子液的接種比例1:0.5(v/v)，在30℃下通氣培養(yǎng)240h；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中已檢測(cè)不到可發(fā)酵性糖；固液分離收集沉淀，采用酸熱法提取油脂，油脂量9.7g/L，油脂得率為6.1g/100gds。
實(shí)施例12
參照文獻(xiàn)(Li YH,et al.Enzyme Microb Technol,2007,41:312–317)的方法，從實(shí)施例10獲得菌體中提取微生物油脂，得到0.50g。參照文獻(xiàn)(里偉，等.過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2007,7(1),137–140)的方法，取0.40g油脂在酶催化條件下轉(zhuǎn)酯化制備和純化生物柴油，得到0.38g，生物柴油收率95％，所得生物柴油的辛烷值為59，適合作為柴油的替代品。
通過(guò)比較對(duì)比例1和對(duì)比例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將里氏木霉和彎曲隱球酵母共發(fā)酵，油脂產(chǎn)量和油脂得率均比較高，這主要是因?yàn)槔锸夏久顾a(chǎn)酶系中β-葡萄糖苷酶活力較低，其水解木質(zhì)纖維素得到大量纖維二糖，而彎曲隱球酵母具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝纖維二糖的能力。進(jìn)一步通過(guò)比較對(duì)比例1、2和實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將里氏木霉的主要β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行敲除，油脂產(chǎn)量和油脂得率進(jìn)一步得到顯著提高。實(shí)施例3-11表明，采用里氏木霉工程菌和彎曲隱球酵母共發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂方法，油脂產(chǎn)量和油脂得率都非常高，有助于碳氮流定向調(diào)控，以及生物質(zhì)資源“一鍋法”高產(chǎn)微生物油脂。因此，采用本發(fā)明方案培養(yǎng)產(chǎn)油微生物的油脂產(chǎn)量和原料利用效率均有提高，當(dāng)大量生產(chǎn)時(shí)，可以明顯降低成本。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。