本發(fā)明涉及分子生物學和植物品種鑒別
技術領域：
，特別是涉及一種蠶豆SSR指紋圖譜的構建方法以及利用構建得到的不同品種蠶豆的指紋圖譜鑒別蠶豆品種的方法及應用。
背景技術：
：蠶豆(ViciafabaL.)作為一種糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物,在我國農(nóng)作物中占有重要地位。蠶豆在世界各洲均有生產(chǎn)和分布，全世界有超過43個國家生產(chǎn)蠶豆。蠶豆在我國已有2000余年的栽培歷史，全國除山東、海南和東北三省極少種植外，其余各地均有種植。近10年，中國蠶豆的種植面積達140多萬hm2，占世界總種植面積50％左右，是世界第一蠶豆生產(chǎn)大國。蠶豆可通過與根瘤菌共生結瘤，固定大氣中的氮素，在改善土壤營養(yǎng)結構中起著重要的作用。蠶豆營養(yǎng)豐富，蛋白質平均含量為27.6％，維生素含量均超過大米和小麥。因此開展蠶豆品種的有效甄別顯得尤為重要。目前我國對蠶豆品種進行鑒定主要方法是按照NY/T2345-2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南蠶豆》進行田間測定來鑒定的。該方法簡便、經(jīng)濟，但由于許多形態(tài)學性狀鑒定周期長、易受環(huán)境影響，不能精確、快捷地為新品種侵權案件提供鑒定依據(jù)，同時也常出現(xiàn)不同測試人員對某些性狀的認識存在偏差，導致判定結果不一致的問題。隨著育種親本的利用集中化，傳統(tǒng)的形態(tài)學和細胞學鑒定方法測試性狀多、工作量大，很難做到準確而真實的鑒定蠶豆的品種差別，為此需要在分子水平上進行分析鑒定。隨著生物技術的發(fā)展，基于分子標記技術而建立起來的DNA指紋圖譜(fingerprint)在品種、品系鑒別方面發(fā)揮著重要作用。品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構建在蠶豆品種純度及真實性鑒定、種子質量標準化、品種審定及產(chǎn)權登記保護、真假種辨別、品種糾紛等方面具有重要應用價值，在探究我國蠶豆種質資源的親緣關系、雜種優(yōu)勢群劃分、種質資源創(chuàng)新利用及新品種選育等方面發(fā)揮著顯著作用。當前用于構建作物DNA指紋圖譜的標記技術主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。簡單重復序列(Simplesequencerepeat,SSR)，是第二代基于PCR技術的分子標記技術。與其它類型分子標記相比，SSR標記具有多態(tài)性豐富、遺傳信息多、操作便利、共顯性、高度可重復性等優(yōu)點，已被廣泛應用于植物資源遺傳研究和分子輔助育種實踐中。DNA指紋圖譜能夠從DNA水平上鑒定出品種間的差異或遺傳相似性。微衛(wèi)星(又稱為簡單重復序列，SSR)是由1-6個核苷酸組成的短序列串聯(lián)重復多次而組成的一段DNA。由于微衛(wèi)星中重復單元的重復次數(shù)不同，因而擴增出的微衛(wèi)星序列的長度呈現(xiàn)多態(tài)性。微衛(wèi)星序列具有多態(tài)性較高，重復性和穩(wěn)定性好等特點，是十分有效的分子標記，被廣泛應用于品種鑒定、指紋圖譜構建等領域。為了有效保護我國蠶豆的品種知識產(chǎn)權，有必要在我國開展蠶豆開發(fā)微衛(wèi)星標記開發(fā)，并應用于蠶豆優(yōu)良品種“分子身份證”構建的研究。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種蠶豆SSR指紋圖譜的構建方法，本發(fā)明的另一目的在于提供一種高效、準確、低成本的利用基因組SSR指紋圖譜鑒別蠶豆品種的方法。本發(fā)明的目的還在于提供該方法的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以48份代表性蠶豆品種基因組DNA為模板，通過分析蠶豆基因組序列和EST序列，合成核心基因組SSR和EST-SSR引物。經(jīng)過篩選，分別有15對基因組SSR和6對EST-SSR引物組成的分子標記組合可完全鑒別48份蠶豆品種的差異。所述的48份代表性蠶豆品種見表1。表148份蠶豆品種經(jīng)過多次篩選，選擇在連鎖群上的均勻分布、多態(tài)性較高、PCR擴增較穩(wěn)定，同時滿足常規(guī)非變性凝膠電泳檢測和毛細管熒光電泳檢測兩種技術平臺，最終篩選出在蠶豆品種間多態(tài)性信息含量值最高、等位位點數(shù)最多、重復性好、擴增帶型清晰度高、染色體分布均勻的SSR引物作為蠶豆品種指紋圖譜庫構建的核心引物?；谏鲜龊Y選方法，本發(fā)明提供用于鑒別蠶豆品種的分子標記組合，其特征在于，含有15個SSR分子標記和6個EST-SSR分子標記，分別為SSR11908、EST181、SSR11771、SSR12080、SSR13683、SSR12396、SSR14328、EST1672、EST1280、EST1741、SSR17991、SSR10911、SSR13106、SSR760、EST1142、SSR11052、SSR13771、SSR11885、SSR12536、SSR12868、EST1584；所述分子標記分別通過以下引物對擴增得到：SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10、SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14、SEQIDNO.15-16、SEQIDNO.17-18、SEQIDNO.19-20、SEQIDNO.21-22、SEQIDNO.23-24、SEQIDNO.25-26、SEQIDNO.27-28、SEQIDNO.29-30、SEQIDNO.31-32、SEQIDNO.33-34、SEQIDNO.35-36、SEQIDNO.37-38、SEQIDNO.39-40、SEQIDNO.41-42所示的引物。本發(fā)明提供一種引物組合，含有以下21對特異性引物對，其核苷酸序列分別如SEQIDNO.1-42所示。本發(fā)明提供含有上述引物組合的試劑盒。本發(fā)明提供了上述分子標記組合或引物組合在鑒定蠶豆品種中的應用。本發(fā)明提供了上述分子標記組合或引物組合在蠶豆種質資源改良中的應用。本發(fā)明提供了上述分子標記組合或引物組合在構建蠶豆SSR植物圖譜中的應用。本發(fā)明還提供一種蠶豆品種SSR指紋圖譜的構建方法，以本發(fā)明所述的含有上述21對引物的引物組合對不同蠶豆品種的DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測或對PCR產(chǎn)物進行熒光毛細管電泳檢測，純合位點的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大?。浑s合位點的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0；上述“/”前為小片段，“/”后為大片段；通過對不同位點的數(shù)據(jù)整合，形成不同蠶豆品種的SSR指紋圖譜。其中，PCR擴增方法為：反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性35s，60℃退火40s，72℃延伸45s，共32個循環(huán)；72℃延伸5min，10℃保溫5min；10μL擴增體系為：2×TaqPCRMasterMix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O2.5μL。其中，當采用非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測時，是采用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電壓300V，電流280mA，功率260W。當采用熒光毛細管電泳檢測時，為引物加入熒光標記，詳細情況見表2。本發(fā)明提供了利用上述構建方法構建得到的蠶豆品種指紋圖譜。本發(fā)明構建得到的蠶豆品種指紋圖譜，其如表5-表16所示。本發(fā)明進而提供一種鑒定蠶豆品種的方法，包括如下步驟：(1)提取待檢蠶豆品種的DNA，以權利要求2所述的引物組合中的21對引物對分別對檢蠶豆品種的DNA進行PCR擴增；(2)擴增產(chǎn)物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，銀染顯色，根據(jù)擴增產(chǎn)物在電泳凝膠上的相對位置；或對擴增產(chǎn)物進行熒光毛細管電泳檢測，根據(jù)擴增產(chǎn)物的相對位置，純合位點的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大?。浑s合位點的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0；上述“/”前為小片段，“/”后為大片段；(3)結果對照表5-表16的蠶豆品種指紋圖譜，品種間差異位點數(shù)≥3，則為不同品種；品種間差異位點數(shù)<3，則為近似品種。本發(fā)明提供了上述方法在蠶豆種質資源改良中的應用。本發(fā)明蠶豆DNA指紋圖譜的構建方法，利用了SSR引物組合對某一蠶豆品種DNA進行擴增，得到一組特有的DNA指紋，于是本發(fā)明方法采用引物組合鑒別的方法對蠶豆品種進行分析和篩選，使每一個品種都找到了它特有的DNA指紋。本發(fā)明的SSR和EST-SSR引物的擴增產(chǎn)物帶型間大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分不同的品種。對同一品種內的個體間的擴增產(chǎn)物，其帶型一致。本發(fā)明的檢測方法在短時間內即可完成蠶豆種子品種鑒定與遺傳多樣性評價工作，具有高效、準確、低成本、操作簡便等優(yōu)勢。同時本發(fā)明的檢測方法可以有效的對蠶豆種子真?zhèn)芜M行監(jiān)控，從DNA水平揭示品種的遺傳變異與親緣關系，保護了作物品種，防止假冒偽劣品種進入市場，也為蠶豆品種選育過程中優(yōu)異種質的合理利用提供了技術參考。附圖說明圖1為48份代表性蠶豆品種聚類分析結果圖。圖2為實施例2中48份代表性蠶豆品種的PCR擴增結果電泳圖。具體實施方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。本發(fā)明品種判定原則遵照以下國家標準進行，NY/T2594-2014植物品種鑒定DNA指紋方法總則；NY/T2345-2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南蠶豆》；GB/T19557.1植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則。實施例1用于鑒定蠶豆品種的SSR和EST-EST引物的篩選本實施例以我國蠶豆主產(chǎn)區(qū)代表性推廣的48個蠶豆(見表1)品種基因組DNA為模板，通過分析蠶豆基因組序列和EST序列，合成核心基因組SSR和EST-SSR引物。經(jīng)過篩選，分別有15對基因組SSR和6對EST-SSR引物組成的分子標記組合可完全鑒別48份蠶豆品種的差異。最終篩選得到15對基因組SSR分子標記和6對EST-SSR分子標記。表221對SSR核心引物上述表1的引物分別對應序列表中的SEQIDNO.1-42。實施例2蠶豆品種特征指紋圖譜的構建與蠶豆品種鑒定方法的建立1、蠶豆品種總DNA提取采用改良CTAB法提取供試品種DNA：取2g左右的新鮮幼嫩葉片，在液氮中研磨成粉末狀裝入2.0ml離心管中，放入-80℃冰箱保存待用；將預熱到65℃的2×CTAB提取液，按占溶液容量的1％的比例加入β-巰基乙醇，充分混勻；取出研磨好的葉片組織，每份樣品中加入800μL預熱后的CTAB提取液，渦旋1-2min，65℃水浴1h(每15min上下顛倒輕翻一次，充分混勻)；水浴加熱結束后，加入800μL氯仿/異戊醇(24：1)溶液于離心管中，混合15-20min，之后10000rpm離心15min；吸取600μL左右上清液移至新離心管(量可適當減少，但切不可接觸蛋白質層)，后加入95％等體積乙醇，搖勻后于-20℃冰箱放置2h或者4℃冰箱過夜，保證充分沉淀；12000rpm離心10min，倒掉上清，保留沉淀；用90％乙醇500μL清洗白色沉淀，10000rpm離心5min，小心倒掉上清；室溫風干，加入100μLddH2O充分溶解沉淀。利用Nanodrop2000/2000C儀器檢測樣品DNA濃度，將DNA濃度稀釋到50ng/μL，4℃保存?zhèn)溆谩?、以實施例1所述48份蠶豆品種為材料，利用實施例1篩選得到的用于擴增21個分子標記的引物分別對實施例1所述的48份代表性蠶豆品種的DNA進行PCR擴增，反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性35s，60℃退火40s，72℃延伸45s，共32個循環(huán)；72℃延伸5min，10℃保溫5min；10μL擴增體系為：2×TaqPCRMasterMix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O2.5μL。3、PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳及銀染顯色：擴增產(chǎn)物采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為0.5×TBE，200V穩(wěn)壓電泳2-2.5h，至加樣緩沖液移到凝膠底部時電泳結束。銀染顯色，照相記錄。(1)玻璃板清洗用清水和洗滌劑將平、凹玻璃板充分清洗干凈，然后用蒸餾水沖洗，置于玻璃板架晾干；為防止灌膠時有氣泡產(chǎn)生，灌膠前用酒精擦洗玻璃板，晾干備用；將組裝好的玻璃板水平放齊，用夾子固定。(2)灌膠在45ml8％PAGE膠中加入TEMED45μL和10％過硫酸銨450μLTEMED(TEMED和過硫酸銨的使用量應依據(jù)環(huán)境溫度做出相應調整)，迅速混勻后灌膠。待膠液充滿玻璃板夾層時，在上部輕輕插入梳子(根據(jù)上樣量自行調整梳子插入深度)，使其聚合25min左右(具體聚合時間應隨不同環(huán)境溫度做出相應調整)。在灌膠過程中，應防止氣泡的產(chǎn)生(若出現(xiàn)小氣泡，可借助塑料薄片將其趕出)。(3)PCR擴增產(chǎn)物預處理在10μLPCR擴增產(chǎn)物中加入2.5μL6×Loadingbuffer，混勻30s待用。(4)電泳用移液器吹吸加樣槽，清除雜質和氣泡。每加樣孔點入1.5μL產(chǎn)物進行檢測，電泳1-1.5小時(電壓300V，電流280mA，功率260W)，電泳時間長短可根據(jù)目標片段大小和實際功率適度調節(jié)。待上部的指示帶(二甲苯青)到達膠板底部，電泳結束，小心剝離聚丙烯酰胺凝膠，待染色。(5)銀染漂洗：使用蒸餾水快速漂洗聚丙烯酰胺凝膠1次，時間不超過10s。銀染：按以下銀染液配比對凝膠進行染色，然后平行震蕩染色10min。表3清洗：染色10min后，將染色液倒入廢液桶，繼續(xù)用蒸餾水漂洗2次，每次不超過15s。顯色：按以下顯色液配比，加入適當?shù)娘@色液于塑料盒中，輕輕混勻后置于平行震蕩儀，使凝膠與顯色液充分作用，直至條帶清晰。表4洗滌：將顯影液倒掉并用蒸餾水清洗2-3次，每次不超過15s。保存：清洗干凈后，將凝膠平鋪在玻璃板上，用保鮮膜將其密封，讀出條帶結果并統(tǒng)計記錄，然后照相留存。結果記錄：純合位點的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異(小片段在前，大片段在后)；無效等位變異的大小記錄為0/0。從圖2可以看出引物的多態(tài)性好，能夠很好的鑒別品種。構建的48份蠶豆的指紋圖譜見表5-表16。4、與上述步驟3平行的檢測方法，還可采用對PCR擴增產(chǎn)物進行熒光毛細管電泳檢測，具體如下：PCR產(chǎn)物樣品準備及電泳分析結果將FAM(藍色)和HEX(綠色)熒光標記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋25倍，分別取等體積的上述2種稀釋后溶液混合形成混合液，吸取1μL混合液、0.1μLLIZ500分子量內標和8.9μL去離子甲酰胺分別加入到DNA分析儀專用深孔板孔中；然后將其在PCR儀上95℃變性5min，取出后立即置于碎冰上，冷卻15min左右；瞬時離心10s，進行毛細管電泳檢測，用GENEMAPPER進行圖像分析和數(shù)據(jù)采集。以DNAMarkerI為DNA分子量標準，純合位點的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大??；雜合位點的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0(注：小片段在前，大片段在后)。通過對多個位點的數(shù)據(jù)整合，最終形成不同蠶豆品種的SSR指紋圖譜(表5-表16)。除待測樣品外，每個SSR位點還應同時包括3～5個參照品種的擴增產(chǎn)物。不同熒光標記的擴增產(chǎn)物的最適稀釋倍數(shù)最好通過預試驗確定。檢測結果判定：品種間差異位點數(shù)≥3，則為不同品種；品種間差異位點數(shù)<3，則為近似品種；比較48份品種的指紋數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)任意兩個品種間的差異位點數(shù)都大于3，說明這21對核心引物可以有效的把這些品種鑒別開；利用PowerMarker和MEGA軟件進行品種聚類，分析品種間的遺傳關系，從圖中可以發(fā)現(xiàn)在遺傳相似系數(shù)小于0.11時可以把全部品種區(qū)分開(圖1)。表5-表16中的C1-C48分別對應表1中的各蠶豆品種名稱。表5表6SSR13771EST1142EST1584SSR11771SSR12868EST1672SSR13683C1163/163213/219183/183149/149144/146181/187147/150C2157/161206/217184/187136/142143/146190/190145/145C3158/158230/236185/185139/146146/146181/184146/150C4164/164206/206185/185149/149144/146187/193144/144C5163/163206/217184/184143/143143/143186/186149/149C6162/162208/218187/187146/146144/147181/181144/144C7162/162217/221188/188146/146144/144190/190150/150C8159/159206/206185/185142/142143/143187/187150/150C9163/167206/206184/184142/142143/143181/193144/144C10160/164206/208188/188141/146144/144181/181145/145C11159/159219/219187/187142/146143/143186/186150/150C12159/159219/237182/182146/149144/147181/181144/147表7SSR760SSR10911SSR13106SSR11052SSR14328SSR12536SSR17991C1168/168166/169167/167187/187177/177192/198181/181C2165/168163/169167/177184/184177/179202/202158/181C3165/174160/176167/167184/184177/177195/195158/158C4165/174166/180167/171184/193177/177198/198159/181C5171/171166/166167/167193/193171/178198/198158/158C6168/168158/158167/169193/193177/177198/198159/159C7168/171157/166169/169184/184171/171198/198158/158C8168/168163/163167/167193/193178/178198/198159/159C9168/167166/166167/167184/193177/182198/198159/180C10159/159163/176169/169193/193177/177201/201158/158C11168/168166/166167/167184/184170/170201/201159/159C12158/168166/169164/164184/187177/177192/198158/158表8表9SSR13771EST1142EST1584SSR11771SSR12868EST1672SSR13683C13161/161210/219186/186136/136143/143181/181150/150C14159/159218/218185/185136/136146/146181/190146/148C15161/167217/217187/187136/136143/143181/181147/147C16162/162217/217182/182136/136143/143181/181144/144C17160/160221/221188/188146/146144/144187/187147/147C18161/161230/230187/187136/142143/146180/192144/150C19163/163226/226187/187136/136146/146181/181147/147C20159/159224/226180/184142/149147/147190/190147/147C21159/159217/219183/187142/146144/144187/187146/146C22161/161206/215184/184136/146144/147181/193144/144C23157/161206/206187/187136/146144/144187/190147/150C24159/159208/218184/184146/146146/146181/187144/144表10SSR760SSR10911SSR13106SSR11052SSR14328SSR12536SSR17991C13168/168163/163169/169187/187177/177199/199160/181C14168/168158/158171/173184/184177/177193/198180/180C15165/165169/169167/167184/184178/178195/198157/157C16165/165169/169167/167178/178178/178192/192159/159C17159/174166/166171/171178/178177/177198/198158/158C18165/165169/169165/165187/187177/177192/198157/157C19174/174166/169167/167187/193178/181193/193159/159C20171/174169/169171/171184/193179/179198/198180/180C21174/174166/166167/169187/187171/178198/198158/158C22168/168166/166171/171193/193178/181201/201158/179C23159/168163/163169/169178/193178/178193/201158/180C24168/168163/169167/167193/193178/178195/198158/181表11表12SSR13771EST1142EST1584SSR11771SSR12868EST1672SSR13683C25157/157217/221185/188146/146144/150181/181146/150C26159/159206/206187/187136/136146/146181/181145/145C27159/159206/206187/187146/146143/143193/193144/144C28158/167213/217187/187146/146146/146181/193145/147C29160/160223/225188/188136/142144/147181/184145/145C30159/159212/227187/187136/146146/146181/181146/146C31161/161221/221187/187146/146144/144187/187145/145C32159/159217/226182/182136/149144/147187/193145/145C33161/163216/216187/187146/146144/147187/187145/145C34163/163218/218187/187146/146144/144187/187145/145C35159/159206/206188/188146/146144/144187/187145/145C36159/159221/221188/188143/143143/143187/187144/144表13SSR760SSR10911SSR13106SSR11052SSR14328SSR12536SSR17991C25159/168166/166165/165184/196171/178195/195160/181C26168/168163/163167/167193/193181/181202/202158/158C27168/168158/166171/171193/193178/178198/198158/158C28171/171166/169167/171184/184177/177198/198180/180C29158/167168/171171/177184/184178/178198/198158/158C30168/171166/169165/165178/184177/177198/198157/180C31168/168163/163171/171136/136178/178198/198158/158C32174/174163/169167/167187/187171/181198/201180/180C33168/168166/166171/171193/193177/177198/198158/158C34174/174163/163169/171193/239177/177198/198181/181C35174/174166/166169/169194/194177/177199/199158/158C36168/168163/163171/171236/236178/178198/198158/158表14表15SSR13771EST1142EST1584SSR11771SSR12868EST1672SSR13683C37164/164221/221186/186146/146144/144187/187145/145C38162/162206/206185/185146/146144/144187/187145/145C39163/163219/219186/188136/136143/143187/187150/150C40162/162219/219188/188146/146144/144181/187147/147C41159/159206/206185/185146/146143/143181/181145/145C42159/159217/217183/183143/143146/146187/187150/150C43159/159211/211185/185146/146147/147181/181146/146C44159/159204/204185/185127/127143/143190/190147/147C45159/159225/230184/187136/136146/146187/187144/149C46160/165221/228185/188146/146144/144187/183144/144C47161/161212/219185/188136/146147/147187/193145/150C48160/160217/217188/188146/146144/144187/187145/145表16SSR760SSR10911SSR13106SSR11052SSR14328SSR12536SSR17991C37174/174158/158171/171237/237178/178203/203158/158C38174/174163/163169/169237/237178/178199/199158/158C39168/168163/163167/167184/184170/178195/202160/160C40168/168163/163167/167184/193170/177196/203157/157C41168/168163/163167/167184/184177/177201/201159/159C42158/158169/169165/167184/184178/178199/199158/158C43165/165169/169167/167187/187181/181198/198158/158C44174/174166/166169/169187/187179/179198/198159/159C45165/174166/169167/167184/184178/178192/198157/157C46168/168163/163167/171193/193178/182196/202158/158C47159/171163/166167/169193/193178/182199/199159/159C48168/168167/167167/167237/237178/178199/199180/180實施例3本發(fā)明鑒定蠶豆品種方法的應用提取已知品種名稱的6個蠶豆樣品的葉片DNA，以本發(fā)明實施例1篩選得到的分子標記組合中的21對引物分別對待檢蠶豆品種的DNA進行PCR擴增；參照本發(fā)明實施例2的PCR反應體系，PCR反應程序，聚丙烯酰胺凝膠電泳和變異位點記錄方法(方法1)，同時重復實驗采用熒光毛細管電泳法和變異位點記錄方法(方法2)，將得到的指紋代碼與本發(fā)明得到的蠶豆品種的特征指紋圖譜(表5-表16)進行比對，以驗證本發(fā)明實施例2建立的鑒定方法準確度。結果發(fā)現(xiàn)：21對引物組合對6個蠶豆品種進行PCR擴增，上述兩種方法測得的6個蠶豆樣品變異位點均一致，結果見表17-表19，且與本發(fā)明建立的蠶豆指紋圖譜目標品種的品種間差異位點數(shù)＜3，F(xiàn)1-F6為待測6個蠶豆品種，經(jīng)過對比鑒定得到F1-F6分別對應臨蠶3號，啟豆5號，青海4號，成胡11號，翼蠶二號，云豆83-63，與已知品種名稱一致，準確度100％。表明本發(fā)明實施例1篩選得到的21對引物組合可以較好的可以區(qū)分不同蠶豆品種。表17DNA編號EST181SSR11885SSR12396SSR11908SSR12080EST1280EST1741F1200/202167/167164/164163/169211/214184/184181/181F2208/208167/167171/171166/166207/207186/186186/186F3206/206170/170170/170163/163210/210184/184189/189F4208/208168/171164/164160/163211/211184/186181/181F5200/207167/167170/170161/161204/211183/183181/181F6208/208167/167170/170166/166204/204198/198180/180表18DNA編號SSR13771EST1142EST1584SSR11771SSR12868EST1672SSR13683F1158/158230/236185/185139/146146/146181/184146/150F2159/159219/219187/187142/146143/143186/186150/150F3162/162217/217182/182136/136143/143181/181144/144F4157/157217/221185/188146/146144/150181/181146/150F5159/159212/227187/187136/146146/146181/181146/146F6163/163218/218187/187146/146144/144187/187145/145表19DNA編號SSR760SSR10911SSR13106SSR11052SSR14328SSR12536SSR17991F1165/174160/176167/167184/184177/177195/195158/158F2168/168166/166167/167184/184170/170201/201159/159F3165/165169/169167/167178/178178/178192/192159/159F4159/168166/166165/165184/196171/178195/195160/181F5168/171166/169165/165178/184177/177198/198157/180F6174/174163/163169/171193/239177/177198/198181/181說明應用本發(fā)明實施例2提供的鑒別蠶豆品種的方法準確性較高，適合推廣使用。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所<120>一種蠶豆SSR指紋圖譜的構建方法<130>KHP161117235.4<160>42<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1tccatgggatcttcacaaca20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2tcgaagtcccttcatcatca20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gagaaaagcggctgcttaga20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4gctgtcaccgagaatgatga20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5tcctccaggtccaaaaacac20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6aacccgatccgtttcatct19<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7ccgatttcagcaacctgttt20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8gtgaccccatttgcagactc20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9aaatatgggttggcgacttg20<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>10gaattgaccattgactctcttca23<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11gctagtggacctcccattga20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12tccaatgcaaactctccaaac21<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13gcaccgtgctaagatgatga20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14gggcccactcatttttgtta20<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15gctgacatattgtctgcaataacc24<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>16tgcggaaaacagtaatattgaaa23<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17tgctggaacaacaacctgaa20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18tgtgcactctccgcatctac20<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>19cggccacaaacaaggttta19<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>20caatccaagcacaccaatca20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21cacctccaccccgtactcta20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>22aaacaaggtgcttccaccag20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>23accaccttctgaggaacagc20<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>24ttgtgcaaatatgacattttatttaag27<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>25ctctctagtggcctgggtgt20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>26cgatggggtgtttctctctc20<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>27gaattttcaaaacatgagtccca23<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28ccggatctgaaaagacttgc20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>29ccaaagcaaacccaacaagt20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>30cctttgcttccagattctcc20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31tcctcaaacatgcaggacag20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>32ttgttccgagcaacagtttg20<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>33cacccttcttgttcccttttt21<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34ccggcggaactaggtatctt20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>35ctccgcgagcatcactttat20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>36ttgcacgatctcaactcacc20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>37cgttgcctggttcgtactct20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>38acgacgaatttccaccactc20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>39aaattggtgggagacaccag20<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40aagaactaccggaagcagaca21<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>41agccaatttgacccatcatt20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>42tcctcccttagtggctcttg20當前第1頁1 2 3