本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法。

背景技術：

癌痛是由癌癥所致的疼痛，與腫瘤細胞侵襲機體組織所造成，真實的或可能存在的組織損傷有關，是癌癥患者常見的一種并發(fā)癥，嚴重影響晚期癌癥患者的生活質量和治療效果。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，確診的腫瘤患者中至少有1/3存在著不同程度的疼痛，晚期患者更是高達60％～90％。因此，癌痛控制與癌癥的早期預防、早期診斷、早期治療被列為WHO的4項重點規(guī)劃。

盡管癌痛的藥物治療及非藥物治療方法多種多樣，但是，在所有止痛治療方法中，阿片類鎮(zhèn)痛藥是癌痛治療必不可少的藥物。而藥物反應的個體差異，是臨床用藥中的常見現(xiàn)象，不同個體間藥物穩(wěn)定劑量的差異，可達40倍以上。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)不同患者，有效鎮(zhèn)痛劑量差異很大，有研究人員發(fā)現(xiàn)10％～30％癌癥患者經(jīng)阿片類藥物治療后，仍不能有效緩解癌痛。根據(jù)相關研究，除了疾病的嚴重程度、藥物之間的相互作用，營養(yǎng)狀況等影響個體的用藥反應外，阿片類藥物如嗎啡、羥考酮、.美沙酮、芬太尼作用時可能受藥物代謝酶、轉運蛋白、受體和藥物作用靶點的基因多態(tài)性影響。因此，鎮(zhèn)痛療效相關基因的多態(tài)性及其對癌痛治療的影響逐漸受到關注。

人類OPRM1基因定位于染色體6q24～25，是阿片類藥物遺傳差異的主要候選基因。μ阿片受體是內源性和外源性阿片物質鎮(zhèn)痛的主要靶點，OPRM1基因編碼μ阿片受體，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類OPRM1基因存在100多個基因多態(tài)性位點和4個連鎖不平衡(LD)區(qū)。研究證實，與鎮(zhèn)痛相關的多態(tài)性位點有A6V、N40D、R260H、R265H和S268P，其中N40D(A118G)是最常見的多態(tài)性。A118G多態(tài)性在不同民族之間突變頻率有一定的差異，非洲人N40D的突變率為4.7％，歐洲人N40D的突變率15.4％，日本人該基因的發(fā)生頻率為48.5％，西班牙人則為14％，而在中國人等位基因G的發(fā)生頻率約為30％。

A118G(N40D)突變是位于第118位的核苷酸由腺苷酸被鳥苷酸所取代，這個替換導致了μ-阿片受體細胞外N-末端第40位氨基酸由天冬氨酸取代天冬酰胺，使μ-阿片受體丟失了一個糖基化位點。在體內外實驗中都已證實A118G(N40D)多態(tài)性能夠影響阿片類藥物的療效，當118G為純合子時，β-內啡肽與受體的結合是118A純合子的3倍，通過藥物動力學和藥效動力學，對嗎啡代謝后的活化形式嗎啡-6-萄糖醛酸(morphine-6-glucuronide，M6G)進行的研究發(fā)現(xiàn)，118G純合子會降低M6G的止痛作用，從而影響嗎啡的鎮(zhèn)痛療效。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡對不同OPRM1基因型攜帶者都有一定的鎮(zhèn)痛效應。但鎮(zhèn)痛效應的強弱，三種基因型卻顯示出不同：突變型(GG型)的受試者前后痛閾差明顯低于野生型(AA型)和雜合型(AG型)，提示等劑量嗎啡對發(fā)生OPRM1基因型A118G的突變型(GG型)基因女性攜帶者的鎮(zhèn)痛效應，明顯弱于野生型(AA型)和雜合型(AG型)。也可以說，基因型為AA對嗎啡鎮(zhèn)痛用藥更為敏感，GG型的患者嗎啡的需求量大于AA型的患者。因此，檢測OPRM1基因多態(tài)性可作為阿片類藥物(如嗎啡、芬太尼、曲馬多、氨酚羥考酮、度冷丁)個體化劑量給藥的預測指標。

目前，市面上用于檢測OPRM1基因多態(tài)性A118G位點的方法主要有直接測序法、基因芯片和液相芯片法及PCR-RFLP法。直接測序的方法雖然稱為金標準，但其檢測靈敏度低，操作流程較復雜，樣本易污染，耗時較長，且檢測成本較高。基因芯片法和液相芯片法同樣操作過程復雜，檢測成本高，檢測周期長，且結果準確性不高，容易發(fā)生樣本污染，導致假陽性結果。PCR-RFLP法操作復雜，樣本多時，易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染，且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過度，而出現(xiàn)假陰性或假陽性的結果，可靠性低。以上缺點限制了這四種方法在實際臨床工作中的發(fā)展和應用，無法滿足快速指導臨床評估的需求。因此，一種快速、準確且低成本的新型檢測方法成為了迫切需求。

技術實現(xiàn)要素：

為克服以上現(xiàn)有檢測人類OPRM1基因多態(tài)性方法的不足，本發(fā)明的目的是提供一組用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的核酸。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的試劑盒及其檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一組用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的核酸，該核酸包括檢測針對A118G位點的野生型上游引物、突變型上游引物、公用下游引物和公用檢測探針，其中，所述野生型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突變型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述公用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述公用檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

如上所述的核酸，優(yōu)選的，所述核酸還包括內部質控，所述內部質控包括質控引物對和質控探針，所述質控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述質控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

如上所述的核酸，優(yōu)選的，所述核酸還包括野生型陽性對照物、突變型陽性對照物和質控陽性對照物，其中，所述野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，和/或所述質控陽性對照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

一種用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒用于實時熒光PCR檢測人類OPRM1基因A118G位點的野生型和突變型，所述試劑盒包括如上所述的核酸，所述公用檢測探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團，和/或質控探針的5＇端連接有不同于所述公用檢測探針的熒光基團，3＇端連接有不同于所述公用檢測探針的淬滅基團。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：PCR緩沖液、DNA聚合酶、礦物油、陰性對照物：無核酸酶水。

一種檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的方法，該方法包括以下步驟：

(1)從樣本中提取DNA；

(2)對提取的所述DNA，同時進行野生型體系和突變型體系的實時熒光PCR擴增；其中，所述野生型體系中野生型引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反突變型體系中突變型引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，公用檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用檢測探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團；

(3)收集熒光信號，選擇對應熒光基團的熒光檢測模式，基線調整取3～15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；

(4)結果判定：待測樣本的所述野生型反應體系和所述突變型反應體系的熒光信號達到設定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值的差值△Ct值來確定樣本DNA的基因型。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述野生型體系和所述突變型體系還包括有作為內部質控的質控引物對和質控探針，所述質控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述質控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，該質控探針的5＇端連接有不同于所述公用檢測探針的熒光基團，3＇端連接有不同于所述公用檢測探針的淬滅基團。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在所述野生型體系和所述突變型體系中，各條引物和探針的終濃度為100-1000n mol/L；所述熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述實時熒光PCR擴增的反應程序為：

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在各自的所述野生型體系和所述突變型體系中，所述野生型引物對的終濃度均為200nmol/L，所述突變型引物對的終濃度均為200nmol/L，所述公用檢測探針的終濃度為200nmol/L，所述內部質控的引物對的終濃度均為150nmol/L，所述質控探針的終濃度為100n mol/L；所述檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，所述質控探針的5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1；

所述確定樣本DNA的基因型，如下：

△Ct＝|野生型Ct值-突變型Ct值|≤2.5為雜合型樣本；

△Ct＝野生型Ct值-突變型Ct值>2.5為突變型樣本；

△Ct＝突變型Ct值-野生型Ct值>2.5為野生型樣本。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，還設有陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列為模板，進行所述野生型體系和突變型體系的實時熒光PCR擴增；所述陰性對照為以無核酸酶水為模板，進行所述野生型體系和突變型體系的實時熒光PCR擴增；

在步驟(4)中，所述陽性對照的野生型體系和突變型體系的FAM均有明顯的擴增曲線，且FAM信號的Ct值≤25，和/或JOE有明顯的擴增曲線且JOE信號的Ct值≤25，符合要求，檢測結果可靠；所述陰性對照的野生型體系和突變型體系的FAM都沒有明顯的擴增曲線，符合要求，檢測結果可靠，否則應重新配置檢測體系，重新進行檢測。

本發(fā)明提供了一組用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的核酸及試劑盒，同時建立具有特異性強、靈敏度高、準確度高、操作簡單的檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的檢測方法，為阿片類藥物(如嗎啡、芬太尼、曲馬多、氨酚羥考酮、度冷丁)個體化劑量給藥提供指導方案。

本發(fā)明提供的檢測方法采用完全閉管操作，操作簡單、方便快捷、通過直接探測PCR過程中熒光信號值的獲得檢測的結果，不需要PCR后處理或電泳檢測，克服了常規(guī)PCR技術的易污染、出現(xiàn)假陽性，能有效避免非特異性擴增難題，并且適合大批量樣本的檢測。

本發(fā)明提供的檢測試劑盒及方法，用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性時，為了避免漏檢、及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內，設有內部質控，為了判斷檢測體系是否正常，還設有陰性對照和檢測引物的陽性對照；為了避免假陰性及漏檢，設有陽性對照，其陽性對照檢測呈陽性結果，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陰性結果及漏檢；為了避免假陽性及漏檢，設有陰性對照，其陰性對照檢測呈陰性結果，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陽性結果及漏檢；檢測試劑盒及方法設計嚴謹，有效避免漏檢、錯檢的可能。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明運用ARMS引物分野生型和突變型基因，有如下有益效果和顯著進步：

(1)靈敏度高，可以準確檢出低至10copies/μL的基因組DNA，檢測結果可信，且對于保存時間過長以及口腔拭子這些提取濃度很低的樣本能準確檢出。

(2)特異性強，對于高至3×10⁴copies/μL的ABCB1基因組DNA不會出現(xiàn)非特異性的結果。與其他相似功能的基因不會出現(xiàn)交叉反應，提取出的樣本直接上母液都能準確檢測而不會出現(xiàn)非特異性。

(3)適用于多種樣本類型：本發(fā)明不僅能檢測常規(guī)的EDTA抗凝的全血細胞DNA，還能檢測提取質量差的口腔拭子，檢測結果準確度高。

(4)成本低，ARMS分型法相對Taqman探針分型法，不僅能保留Taqman的高靈敏度和高特異性，而且還能節(jié)約成本，ARMS引物合成快速簡單，合成成本低，擴增效果更佳。

(5)檢測速度快，整個檢測過程只需要90分鐘。

(6)應用Fast premix預混在反應體系中，減少了酶與樣本混合的步驟，減少了樣本的污染，操作更簡單，一步加樣，避免了氣溶膠污染引起的假陽性。

(7)安全：整個試劑盒不包含有毒有害物質，對操作人員和環(huán)境無危害。

總之，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明采用了特異性ARMS引物和探針阻斷技術，可以特異性的檢測人類OPRM1基因A118G多態(tài)性。建立實時熒光PCR擴增反應體系實現(xiàn)對OPRM1基因A118G多態(tài)性的快速檢測；且操作簡單，結果易讀。同時，本方法靈敏度高，可實現(xiàn)10copies/μL基因的穩(wěn)定檢出；特異性好，3×10⁴copies/μL相似功能的基因組DNA無非特異性擴增。

附圖說明

圖1為本發(fā)明優(yōu)選的實時熒光PCR方法檢測陽性對照的擴增曲線。

圖2為本發(fā)明優(yōu)選的實時熒光PCR方法檢測陰性對照的擴增曲線。

圖3為本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測野生型靈敏度的擴增曲線。

圖4為本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測突變型靈敏度的擴增曲線。

圖5為本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測野生型精密度的擴增曲線。

圖6為本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測突變型精密度的擴增曲線。

圖7為本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測野生型特異性的擴增曲線。圖8為本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測突變型特異性的擴增曲線。

圖9為本發(fā)明優(yōu)選的檢測方法檢測樣本1的擴增曲線。

圖10為本發(fā)明優(yōu)選的檢測方法檢測樣本2的擴增曲線。

具體實施方式

以下結合具體實例對本發(fā)明做進一步詳細說明，并非對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補序列也可實現(xiàn)本發(fā)明，如無特殊說明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1引物、探針、驗證模板設計

ARMS-PCR擴增基本原理：在PCR擴增時，引物的延伸是從其3'未端開始的，而這種延伸的進行要求引物3'端的堿基與模板需完全配對，只有這樣引物才能延伸，擴增才得以進行下去而得到預期的擴增產(chǎn)物，若引物3'端與模板不能配對，則引物的延伸即阻斷，不能得到相對應的擴增產(chǎn)物，基于以上事實，可利用3'端含突變堿基的引物來檢測靶DNA中有無相應的突變位點，此即3'特異PCR擴增。擴增阻滯突變系統(tǒng)及等位特異PCR，該反應系統(tǒng)包含兩個PCR擴增反應，有兩對引物但它們的3'端有差異，一為正常引物，另一為3'端編食突變的引物，正常引物只與正常模板互解，PCR時擴增相應的產(chǎn)物，而食突變的引物只與突變的模板附擴增出相應的產(chǎn)物。利用該系統(tǒng)進行基因突變檢測時不僅能檢出突變的純合子，而且能檢出雜合子個體。

本發(fā)明的具體原理是：針對人類OPRM1基因A118G位點分別設計野生型和突變型ARMS引物和共用的Taqman-MGB探針和下游引物，結合熒光定量PCR反應，對從人外周血細胞或口腔拭子中提取的基因組DNA進行檢測，通過實時熒光PCR儀上收集信號，計算野生型和突變型的△Ct值來確定樣本DNA的基因型。

針對人類OPRM1基因A118G位點設計野生型上游引物、突變型上游引物、公用下游引物和公用檢測探針，通過多次試驗、優(yōu)化、最后獲得野生型上游引物(OPRM1FW)、突變型上游引物(OPRM1FM)、公用下游引物(OPRM1R)和公用檢測探針(OPRM1P)的序列，其核苷酸序列如下：

OPRM1FW(SEQ ID No.1)：5’-CAACTTGTCCCACTTAGAAGGCA-3’；

OPRM1FM(SEQ ID No.2)：5’-GTCAACTTGTCCCACTTAGATGGTG-3’；

OPRM1R(SEQ ID No.3)：5’-GCTTTCCTTACCTGACAATCACATAC-3’；

OPRM1P(SEQ ID No.4)：5’-CCTGTCCGACCCATG-3’

其中，野生型引物擴增產(chǎn)物長度為206kb，突變型引物擴增片段長度為208kb。擴增產(chǎn)物可作為陽性對照，即野生型陽性對照物含SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、突變型陽性對照物含SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，具體如下：

SEQ ID No.8:

5’-CAACTTGTCCCACTTAGATGGCAACCTGTCCGACCCATGCGGTCCGAACCGCACCGACCTGGGCGGGAGAGACAGCCTGTGCCCTCCGACCGGCAGTCCCTCCATGATCACGGCCATCACGATCATGGCCCTCTACTCCATCGTGTGCGTGGTGGGGCTCTTCGGAAACTTCCTGGTCATGTATGTGATTGTCAGGTAAGGAAAGC-3’。

SEQ ID No.9:

5’-GTCAACTTGTCCCACTTAGATGGCGACCTGTCCGACCCATGCGGTCCGAACCGCACCGACCTGGGCGGGAGAGACAGCCTGTGCCCTCCGACCGGCAGTCCCTCCATGATCACGGCCATCACGATCATGGCCCTCTACTCCATCGTGTGCGTGGTGGGGCTCTTCGGAAACTTCCTGGTCATGTATGTGATTGTCAGGTAAGGAAAGC-3’。

進一步，為了對實時熒光PCR反應體系和實驗操作過程進行質控，同時檢測樣本的質量，避免漏檢，本發(fā)明選用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內參基因，GAPDH(NC_000012.12)酶基因為管家(house keeping)基因，幾乎在所有組織中都高水平表達，在同種細胞或者組織中該基因的含量一般是恒定的，可作為熒光定量PCR的內參基因，在該基因上設計的內部控制引物和內控探針，并對內控的上下游引物進行篩選，使非模版體系(NTC)沒有明顯的擴增曲線(不起線)，樣本有明顯的擴增曲線(起線)正常。GAPDH基因作為人類基因組的保守基因，不僅可以作為試劑盒內部的質控，還可作為樣本DNA的質控。通過內部質控的質控引物對、質控探針的篩選和體系優(yōu)化，建立了實時熒光PCR內部質控檢測體系，其中，質控引物對(GAP F、GAP R)、質控探針(GAP P)最后確定的核苷酸序列如下：

GAP F(SEQ ID No.5)：5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’；

GAP R(SEQ ID No.6)：5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3’；

GAP P(SEQ ID No.7)：5’-TGGTGCTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3’。

作為內部質控的質控引物對進行PCR擴增時，其擴增序列的大小為98bp，將擴增序列作為內部質控陽性對照物，即包含如SEQ ID No.10所示序列，作為驗證是否漏檢的陽性對照。

SEQ ID No.10：

5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACA-3’。

作為試劑盒特異性驗證進行PCR擴增時，選擇人類基因組ABCB1基因，位于7號染色體上，其C3435T基因多態(tài)性也與阿片類藥物個體化用藥密切相關。為試劑盒有無交叉反應驗證所需，其質粒序列如SEQ ID No.11所示序列，長度為100bp。

SEQ ID No.11：

5’-TGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATCGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGTCACTGCCTAATGTAAGTCTC-3’。

實施例2采用實時熒光PCR檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的方法

將實施例1篩選設計的野生型上游引物、突變型上游引物、公用下游引物和公用檢測探針進行合成，在檢測探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團，其中，熒光基團可為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，淬滅基團可為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

采用實時熒光PCR檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的方法如下：

(1)從樣本中提取DNA；

(2)對提取的樣本DNA進行進行人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的實時熒光PCR擴增檢測，采用野生型反應體系和突變型反應體系，其中，所述野生型體系中野生型引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，公用檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反突變型體系中突變型引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，公用檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；均用40μL反應體系，PCR反應液組分如下：

MgCl₂：2.0～5.0mmol

dNTP：0.2～0.8mmol

各條引物：0.1～1.0μmol

各條探針：0.1～1.0μmol

DNA聚合酶采用Fast master premix：6～10μL或熱啟動酶0.3～0.6μL

樣本DNA模板：10μL

其余用無核酸酶水補足總體積：40μL。

實時熒光PCR擴增反應條件優(yōu)選為：

第一階段：95℃5min；

第二階段：95℃5s，58℃30s，10個循環(huán)；

第三階段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；

第三階段:35個循環(huán)中，72℃時收集熒光信號，第二階段設有10個循環(huán)，58℃的退火延伸溫度，有利于模板的富集。

(3)收集熒光信號，選擇對應熒光基團的熒光檢測模式，基線調整取3～15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；

(4)結果判定：待測樣本的所述野生型反應體系和所述突變型反應體系的熒光信號達到設定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值的差值△Ct值來確定樣本DNA的基因型。

將OPRM1基因A118G位點的野生型陽性對照物和突變型陽性對照物進行上述實時熒光PCR擴增反應，結果顯示，所設計的檢測引物及反應體系可有效擴增出OPRM1基因A118G位點的野生型和突變型。

對樣本進行檢測時，為避免漏檢，如避免有的反應孔中未加檢測樣本的情況出現(xiàn)，在每個反應孔中設置有內部質控，其質控引物對和質控探針如實施例1中所述。應當注意的是公用檢測探針與質控探針熒光基團標記為不同檢測模式的熒光基團。具體的實時熒光PCR擴增反應體系組成按上述PCR反應液組分配置。對于人血液樣本或咽拭子樣本的DNA檢測時，質控探針的信號應有明顯的擴增曲線。

在探針合成時，探針與熒光和淬滅基團相連，公用檢測探針的熒光-淬滅基團為優(yōu)選為FAM-MGB，質控探針的熒光-淬滅基團優(yōu)選為JOE-BHQ1，當然，其它熒光-淬滅基團組合也同樣適用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，經(jīng)實驗驗證，均可檢測人類ADRB1基因G1165C位點的基因型。

為了避免假陰性及漏檢，檢測方法中還設有野生型反應體系、突變性反應體系和內部質控的陽性對照(STD)，以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列為模板，進行所述野生型體系和突變型體系的實時熒光PCR擴增；其陽性對照檢測呈陽性結果，檢測熒光信號均有明顯的擴增曲線(均起線)，擴增圖如圖1所示，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陰性結果及漏檢；

為了避免假陽性及漏檢，設有檢測引物和內部質控的陰性對照(NTC)，以無核酸酶水為模板，進行所述野生型體系和突變型體系的實時熒光PCR擴增；其陰性對照檢測呈陰性結果，檢測熒光信號均無明顯的擴增曲線(均不起線)，擴增圖如圖2所示，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陽性結果及漏檢；否則，應重新進行反應體系的配置及檢測。陽性對照(STD)FAM信號Ct值作為實驗數(shù)據(jù)是否有效的判定標準。

作為試劑盒特異性驗證進行PCR擴增時，對含質粒序列如SEQ ID No.11所示，進行上述檢測時，檢測結果為陰性，說明所涉及的引物探針與其他基因無交叉反應，特異性強。

上述實時熒光PCR反應可使用的儀器包括ABI實時PCR系統(tǒng)(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad實時PCR檢測系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應儀(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

實施例3用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的試劑盒

用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的實時熒光PCR試劑盒包括以下成分：

野生型上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

突變型上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

公用下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

公用檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用檢測探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團；

野生型陽性對照物：含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

突變型陽性對照物：含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

為了避免漏檢，錯檢，還包括：作為內部質控的質控引物對、質控探針和質控陽性對照物，

其中，質控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，質控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，該質控探針的5＇端連接有不同于所述公用檢測探針的熒光基團，3＇端連接有不同于所述公用檢測探針的淬滅基團，質控陽性對照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

為了防止反應體系在PCR擴增過程中揮發(fā)，影響檢測效果，試劑盒還包括有礦物油。

為了便于反應體系的配置，試劑盒還包括10×PCR緩沖液；Fast Advanced Master Mix，陰性對照物：無核酸酶水。其中Fast Advanced Master Mix，可采用ABI(美國應用生物系統(tǒng)公司)；10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，也可應用市場上其他公司的PCR緩沖液與DNA聚合酶。

實施例4快速檢測試劑盒的制備

本實施例的試劑盒是在實施例3的基礎上，制備成可以直接加入檢測樣本后，進行檢測的試劑盒。該試劑盒有檢測OPRM1的8聯(lián)PCR反應條以及驗證試劑盒性能分析時所需的野生型質粒、突變型質粒、內控質粒，也就是OPRM1A118G野生型、突變型陽性對照物及質控陽性對照物組成，各成分如表1所示，具體反應體系的配置見表2。每條OPRM1 8聯(lián)PCR反應條的奇數(shù)管(1/3/5/7或A/C/E/G)對應檢測體系為野生型反應體系A1反應液，檢測OPRM1A118G野生型；偶數(shù)管(2/4/6/8或B/D/F/H)對應的檢測體系為突變型反應體系A2反應液，檢測OPRM1A118G突變型。每管主要成分為特異性引物、熒光探針和PCR反應液等，其中公共檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，則檢測樣本信號類型為FAM信號；內部質控的質控探針5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1，內部質控信號類型為JOE信號(內控作為對試劑盒、DNA質量以及操作本身的質控)；檢測的引物、探針委托上海英駿生物技術有限公司合成。

表1試劑盒組成

表2反應體系的配置

其中，AB premix的全稱 Fast Advanced Master Mix，購自ABI(美國應用生物系統(tǒng)公司)；10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，經(jīng)過大量試驗、驗證該試劑盒為一種高靈敏、高特異性、高效的檢測OPRM1基因多態(tài)性的檢測試劑盒。

實施例5：對實施例4中制備的試劑盒進行性能分析實驗

OPRM1重組質粒購自南京金斯瑞生物科技有限公司，以現(xiàn)有基因工程技術人工合成的OPRM1基因A118G多態(tài)性位點含有SEQ ID NO:8所示序列為野生型質粒，含有SEQ ID NO:9所示序列為突變型質粒，人工合成含有SEQ ID NO:10所示序列為內控質粒。各質粒干粉用TE(10mmol/L，PH8.0)復溶，定量后稀釋。

(1)靈敏度

取2×10¹copies/μL的野生型質粒和內控質粒1:1混合，配置成終濃度為10copies/μL的OPW-1參考品；取2×10¹copies/μL的突變型質粒和內控質粒1:1混合，配置成終濃度為10copies/μL的OPM-1參考品；取2×10¹copies/μL的野生型質粒、突變型質粒、內控質粒1:1:2體積比混合，配置成終濃度為10copies/μL的OPWM-1雜合參考品，以這三種參考品為模板，在實施例4中制備A1(OPW)和A2(OPM)體系中分別進行實時熒光PCR擴增反應。擴增反應的程序采用實施例2中方法，具體結果見圖3、4。檢測結果表明，本發(fā)明的熒光PCR方法特異性強，靈敏度高，10copies/μL濃度的DNA在兩種體系中均可檢出三種基因型。

(2)精密度

取6×10³copies/μL的OPRM1基因野生型質粒、突變型質粒、GAPDH內控質粒1:1:2體積比混合，配置成終濃度為3×10³copies/μL的雜合參考品OPWM-2為模板，在A1和A2體系中分別進行如上實時熒光PCR擴增反應。檢測結果見圖5、6，結果表明本發(fā)明的實時熒光PCR擴增反應重復性好(20次重復實驗結果穩(wěn)定，CV<5％)。

(3)特異性

ABCB1質粒人工合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。以現(xiàn)有基因工程技術人工合成的ABCB1基因含有SEQ ID NO:11所示序列，分別取6×10⁴copies/μL的OPRM1和ABCB1基因的野生型質粒和內控質粒1:1混合，配置成終濃度為3×10⁴copies/μL的OPW-3和ABW-3參考品；取上述兩個基因的6×10⁴copies/μL突變型質粒和內控質粒1:1混合，配置成終濃度為3×10⁴copies/μL的OPM-3和ABM-3參考品；在A1體系中分別以3×10⁴copies/μL的OPW-3和ABW-3參考品為模板，在A2體系中分別以3×10⁴copies/μL的OPM-3和ABM-3參考品為模板，后進行如上實時熒光PCR擴增反應，具體結果見圖7、8。結果表明，本發(fā)明的熒光PCR方法特異性強，ABCB1基因和OPRM1基因之間無交叉反應，3×10⁴copies/μL濃度的ABCB1基因組DNA在A1和A2體系中均不能檢出，表明體系的特異性好。

實施例6：臨床樣本DNA的提取

一、EDTA抗凝血樣本

本實施例是從EDTA抗凝血樣本(由武大人民醫(yī)院提供)中提取基因組DNA，并對其進行定量，作為PCR檢測的模板。采用天根的血液基因組DNA提取試劑盒，具體操作見該DNA提取試劑盒說明書，最后將提取的EDTA抗凝血樣本DNA用紫外分光光度計進行定量，稀釋DNA濃度到1ng/μL。

二、口腔拭子樣本

本實施例是從口腔拭子(由同濟醫(yī)院提供)中提取基因組DNA，并對其進行定量，作為PCR檢測的模板。采用康為世紀的口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，具體操作詳該DNA提取試劑盒說明書，最后，將提取的口腔拭子DNA用紫外分光光度計進行定量，稀釋DNA濃度到1ng/μL。實施例7：實時熒光PCR法擴增臨床樣本DNA

本實施例為采用實施例4制備的試劑盒、實施例6提取的DNA樣本，進行實時熒光PCR擴增。

檢測方法如下：

1)每次PCR反應中，同時進行非模板對照(No Template Control；NTC)、陽性對照和待測樣本的檢測。

2)將陽性對照物取出解凍后震蕩混勻，并離心30s。

3)將8聯(lián)PCR反應條取出解凍后離心30s，防止反應液在開蓋時濺出。

4)將ddH₂O(NTC)、實施例6中提取的DNA樣本、陽性對照物分別加入8聯(lián)PCR反應條，每孔10μL。

5)將以上8聯(lián)PCR反應條蓋好管蓋于離心機上離心30S，確保管壁上不沾有液滴。

6)將8聯(lián)PCR反應條放于實時熒光PCR儀器中。

按照實施例2中的優(yōu)選反應程序進行熒光PCR反應，利用ARMS引物區(qū)分野生型和突變型基因序列，通過反應體系的突變型和野生型FAM信號的熒光強度差異來判斷檢測結果；JOE是內控信號，用于檢測體系是否正常，樣本是否漏加及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內，JOE信號應達到設定閾值(Ct值小于25)；FAM是檢測信號，用于檢測樣本的基因多態(tài)性；在內控信號達到要求后，以SNP位點的突變型和野生型FAM信號達到設定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值的差值作為判斷標準。其中，NTC檢測結果，F(xiàn)AM信號都應無曲線升起，內控JOE信號可偶爾起線，符合要求；陽性對照STD檢測結果，F(xiàn)AM信號均起線且Ct≤25，符合要求；根據(jù)野生型和突變型的Ct值的差值做如下判斷：

△Ct＝|野生型Ct值-突變型Ct值|≤2.5為雜合型樣本；

△Ct＝野生型Ct值-突變型Ct值>2.5為突變型樣本；

△Ct＝突變型Ct值-野生型Ct值>2.5為野生型樣本。

樣本結果判定具體見表3。

利用本發(fā)明方法對84例樣本提取的DNA進行檢測，其檢測結果如下表4，W為野生型反應體系，M為突變型反應體系，樣本的擴增曲線圖此處不再全部例出，僅例出具有代表性的兩個樣本的擴增曲線圖，具體如圖9、圖10所示。同時將84例樣本DNA采用Sanger金標準(武漢艾康健公司測序)進行測序檢測，將兩者的檢測能力進行比較，結果見表5。

本檢測方法檢測出的與“金標準”Sanger測序法的結果完全相符，說明本發(fā)明指標的試劑盒及方法檢測OPRM1基因多態(tài)性準確、可靠。

表3OPRM1基因多態(tài)性檢測結果判定

表4 84例樣本的DNA OPRM1A118G多態(tài)性檢測結果

表5本發(fā)明檢測結果和sanger測序金標準比較

以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發(fā)明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海吉力生物科技有限公司

<120> 用于檢測人類OPRM1基因A118G位點多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caacttgtcc cacttagaag gca 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtcaacttgt cccacttaga tggtg 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gctttcctta cctgacaatc acatac 26

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cctgtccgac ccatg 15

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

catcaagaag gtggtgaagc ag 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgtcgctgtt gaagtcagag ga 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tggtgctcag tgtagcccag gatgc 25

<210> 8

<211> 206

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

caacttgtcc cacttagatg gcaacctgtc cgacccatgc ggtccgaacc gcaccgacct 60

gggcgggaga gacagcctgt gccctccgac cggcagtccc tccatgatca cggccatcac 120

gatcatggcc ctctactcca tcgtgtgcgt ggtggggctc ttcggaaact tcctggtcat 180

gtatgtgatt gtcaggtaag gaaagc 206

<210> 9

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gtcaacttgt cccacttaga tggcgacctg tccgacccat gcggtccgaa ccgcaccgac 60

ctgggcggga gagacagcct gtgccctccg accggcagtc cctccatgat cacggccatc 120

acgatcatgg ccctctactc catcgtgtgc gtggtggggc tcttcggaaa cttcctggtc 180

atgtatgtga ttgtcaggta aggaaagc 208

<210> 10

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

catcaagaag gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc aagggcatcc tgggctacac 60

tgagcaccag gtggtctcct ctgacttcaa cagcgaca 98

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tggagacaac agccgggtgg tgtcacagga agagatcgtg agggcagcaa aggaggccaa 60

catacatgcc ttcatcgagt cactgcctaa tgtaagtctc 100