本發(fā)明屬于遺傳檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)鼻咽癌易感性的試劑盒及其SNP標(biāo)志物。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(NPC)是一種特發(fā)性頭頸部的惡性腫瘤。統(tǒng)計(jì)學(xué)資料分析表明，鼻咽癌病人有種族性和家族集聚現(xiàn)象，高發(fā)區(qū)人群移居其它地區(qū)后，仍保持高發(fā)病率，并且10％的鼻咽癌患者有癌家族史等，提示遺傳易感性/遺傳傾向可能是鼻咽癌發(fā)病的一個(gè)重要因素。
采用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphsm，SNP)作為基因組標(biāo)志的關(guān)聯(lián)分析方法是目前最常用的疾病的遺傳易感基因檢測(cè)方法之一。SNP是指基因組水平上由單核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的發(fā)生頻率大于1％，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。SNP遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，易于檢測(cè)，位于基因內(nèi)部的SNP能直接影響到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平，進(jìn)而影響到組織、器官乃至生理功能。
對(duì)常見疾病相關(guān)多種遺傳標(biāo)識(shí)進(jìn)行早期檢測(cè)和系統(tǒng)評(píng)估將有助于對(duì)疾病的早期預(yù)防、診斷和治療。目前，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量與各種常見疾病相關(guān)的遺傳學(xué)標(biāo)識(shí)，然而，由于缺乏有足夠的靈敏度和可以對(duì)多種疾病相關(guān)標(biāo)識(shí)進(jìn)行廣泛(高通量檢測(cè)位點(diǎn)、高通量檢測(cè)樣本)篩查和檢驗(yàn)的方法，使得這些常見疾病的遺傳學(xué)標(biāo)識(shí)無法廣泛應(yīng)用。此外，目前常見疾病遺傳標(biāo)識(shí)缺乏系統(tǒng)、有效的整合，大大制約了常見疾病早期預(yù)防、診斷和治療方面的發(fā)展?，F(xiàn)有檢測(cè)只有單一種疾病或一類疾病的遺傳標(biāo)識(shí)檢測(cè)，檢測(cè)范圍有限，且某些常見疾病尚無早期檢測(cè)的方法。
目前，一些傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)手段，如組織細(xì)胞檢測(cè)存在著其固有的缺陷，取材位置不當(dāng)、組織細(xì)胞標(biāo)本材料不足或認(rèn)為經(jīng)驗(yàn)不足等都將導(dǎo)致鼻咽癌誤診。其他技術(shù)例如影像學(xué)雖然已被廣泛應(yīng)用于鼻咽癌的檢查和診斷，但其在疾病鼻咽癌程度的定性上仍存在著很大的局限性。
綜上所述，研發(fā)一種用于通過多個(gè)易感位點(diǎn)檢測(cè)鼻咽癌易感性的試劑盒對(duì)鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)、預(yù)防、診斷提供依據(jù)具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種用于檢測(cè)鼻咽癌易感性的SNP標(biāo)志物、SNP標(biāo)志物的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物及其試劑盒，本發(fā)明的21個(gè)SNP位點(diǎn)為鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、診斷提供重要依據(jù)。
本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：
一種用于檢測(cè)鼻咽癌易感性的SNP標(biāo)志物，所述標(biāo)志物包括21個(gè)SNP位點(diǎn)，所述21個(gè)SNP位點(diǎn)為rs9344、rs13347、rs1412829、rs9418990、rs915906、rs8192780、rs3827688、rs3813865、rs2249695、rs1536826、rs29232、rs2517713、rs2975042、rs3129055、rs3131866、rs11556218、rs10889677、rs6774494、rs243865、rs2285053和rs9510787。
上述的SNP標(biāo)志物的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，
所述檢測(cè)rs603965的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：3；
所述檢測(cè)rs13347的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：6；
所述檢測(cè)rs1412829的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：9；
所述檢測(cè)rs9418990的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：12；
所述檢測(cè)rs915906的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：15；
所述檢測(cè)rs8192780的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：18；
所述檢測(cè)rs3827688的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：21；
所述檢測(cè)rs3813865的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：24；
所述檢測(cè)rs2249695的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：27；
所述檢測(cè)rs1536826的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：30；
所述檢測(cè)rs29232的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：33；
所述檢測(cè)rs2517713的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：36；
所述檢測(cè)rs2975042的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：39；
所述檢測(cè)rs3129055的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：42；
所述檢測(cè)rs3131866的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：45；
所述檢測(cè)rs11556218的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：48；
所述檢測(cè)rs10889677的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：51；
所述檢測(cè)rs6774494的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：54；
所述檢測(cè)rs243865的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：57；
所述檢測(cè)rs2285053的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：60；
所述檢測(cè)rs9510787的PCR擴(kuò)增引物的序列分別為SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：63。
一種用于檢測(cè)鼻咽癌易感性的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求2所述SNP標(biāo)志物的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，用于檢測(cè)外周血DNA中21個(gè)SNP位點(diǎn)為rs603965、rs13347、rs1412829、rs9418990、rs915906、rs8192780、rs3827688、rs3813865、rs2249695、rs1536826、rs29232、rs2517713、rs2975042、rs3129055、rs3131866、rs11556218、rs10889677、rs6774494、rs243865、rs2285053和rs9510787。
一種用于檢測(cè)鼻咽癌易感性的試劑盒，所述試劑盒還包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、酶切反應(yīng)緩沖液、去離子水。
本發(fā)明所述的試劑盒是以本發(fā)明人基于多個(gè)國際和國內(nèi)大樣本量的鼻咽癌人群和正常人群鼻咽癌易感基因篩查結(jié)果的前期研究為基礎(chǔ)，通過本發(fā)明人自主設(shè)計(jì)的鼻咽癌SNP篩選流程，從NCBI-pubmed數(shù)據(jù)庫中篩選符合條件的SNP位點(diǎn)：1)查找與鼻咽癌相關(guān)的文獻(xiàn)，通過影響因子和發(fā)表年限進(jìn)行過濾；2)查看候選文獻(xiàn)的摘要，進(jìn)一步排除與鼻咽癌SNP研究無關(guān)的文獻(xiàn)；3)閱讀文獻(xiàn)，找到鼻咽癌對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)；4)以選取的SNP位點(diǎn)和鼻咽癌為關(guān)鍵詞再一次查閱文獻(xiàn)；5)判斷選取的SNP位點(diǎn)是否與鼻咽癌密切相關(guān)，選取與鼻咽癌最密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)、對(duì)應(yīng)OR值以及突變堿基；6)將上一步驟獲得的SNP位點(diǎn)，通過Sequenom公司軟件Typer 4.0進(jìn)行在線評(píng)估，獲得最終的21個(gè)SNP位點(diǎn)列表。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)鼻咽癌易感性的檢測(cè)方法與試劑盒，達(dá)到了以下效果：本發(fā)明的21個(gè)SNP位點(diǎn)經(jīng)過文獻(xiàn)論證，具有較高的實(shí)用性，可用于鼻咽癌的早期評(píng)估和大規(guī)模篩查，并且該21個(gè)位點(diǎn)檢出成功率高、技術(shù)重現(xiàn)性好、性價(jià)比高，為鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、診斷參考提供重要依據(jù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽癌疾病的早期評(píng)估。
以下便結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳述，以使技術(shù)方案更易于理解、掌握。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得，下面實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本專利保護(hù)范圍中。
實(shí)施例1 用于檢測(cè)鼻咽癌易感性相關(guān)的SNP位點(diǎn)
其中rs9344位于基因CCND1區(qū)域；rs13347位于基因CD44區(qū)域；rs1412829位于基因CDKN2A區(qū)域；rs9418990、rs915906、rs8192780、rs3827688、rs3813865、rs2249695和rs1536826位于基因CYP2E1區(qū)域；rs29232位于基因GABBR1區(qū)域；rs2517713和rs2975042位于基因HLA-A區(qū)域；rs3129055和rs3131866位于基因HLA-F區(qū)域；rs11556218位于基因IL16區(qū)域；rs10889677位于基因IL23R區(qū)域；rs6774494位于基因MDS1-EVI1區(qū)域；rs243865和rs2285053位于基因MMP2區(qū)域；rs9510787位于基因TNFRSF19區(qū)域。
實(shí)施例2 檢測(cè)鼻咽癌易感性的試劑盒
一、試劑盒的制備：
1、設(shè)計(jì)和合成所述21個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物。待測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物詳見表1
表1 待測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物
2、試劑盒還包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、酶切反應(yīng)緩沖液、去離子水。
二、試劑盒的檢測(cè)方法：
1、DNA的提取
1.1 口腔拭子DNA提取
1)將口腔拭子放在2ml離心管中，加入400μl PBS。
2)加入20μl QIAGEN Protease和400μlBuffer AL。立即渦旋15s混勻。為了保證有效的裂解，樣品和Buffer AL必須立即并充分混合。
3)56℃孵育10min。短暫離心。
4)加入400μl乙醇(96-100％)到樣品中，渦旋混勻。短暫離心以使管蓋上無液體。
5)將液體轉(zhuǎn)移至離心柱，8000rpm(6000×g)離心1min。
6)柱子放入新的2ml EP管，加500μl Buffer AW1，8000rpm離心1min，棄EP管和廢液。
7)柱子放入新的2mlEP管，加500μl Buffer AW2，14000rpm(20,000×g)離心3min，丟棄EP管和廢液。
8)將柱子放入新的2mlEP管，14000rpm空管離心1min，丟棄EP管。
9)將柱子放入新的1.5mlEP管，加120μl Buffer AE，室溫孵育5min，8000rpm離心1min，-20℃保存。
1.2 全血DNA提取
1)向1.5ml EP管中加入20μl QIAGEN Protease。
2)向管中加200μl全血樣品。注：先加入酶的目的是保證酶與血液的混勻。
3)加200μl Buffer AL，渦旋混勻15s。
4)56℃孵育10min，短暫離心。注：延長孵育時(shí)間不能增加產(chǎn)量或提高質(zhì)量。
5)加入200μl無水乙醇，渦旋15s后，短暫離心以使管蓋上無液體。
6)繼續(xù)口腔拭子5～10步驟。
2、PCR擴(kuò)增
2.1 在一個(gè)新的1.5mlEP管中配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，見表2
表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
以上試劑混勻后每孔各加2μl。
2.2 每孔依次加入DNA 10ng/ul 1μl，0.25uM Primer Mix 2μl，總體積5μl。
2.3 在兼容96孔板的PCR儀上設(shè)定PCR反應(yīng)條件為：94℃ 4min，94℃ 20s，56℃ 30min，72℃ 1min，45個(gè)循環(huán)；72℃ 3min；4℃保持。將96孔PCR反應(yīng)板放置于PCR儀上，啟動(dòng)PCR反應(yīng)。
3、PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理
3.1 在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。
3.2 配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)體系，見表3
表3 堿性磷酸酶處理反應(yīng)體系
以上試劑混勻后每孔加2μl。
3.3 在兼容96孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件：37℃ 40min；85℃ 5min；4℃保持，啟動(dòng)PCR儀進(jìn)行堿性磷酸酶處理。
4 單堿基延伸
4.1 在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。
4.2 配制單堿基延伸反應(yīng)體系，見表4
表4 單堿基延伸反應(yīng)體系
以上試劑混勻后每孔加1.06μl
4.3 每孔加入iPLEX Extend Primer Mix 0.94μl，總體積9μl。
4.4 在兼容96孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件：94℃ 30s，94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s；52℃ 5s，80℃ 5s 4個(gè)循環(huán)；94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s 39個(gè)循環(huán)；72℃ 3min；4℃維持。啟動(dòng)PCR儀進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。
5、樹脂純化
5.1 將Clean Resin樹脂平鋪到6mg的樹脂板中；
5.2 加16μl水到延伸產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)孔內(nèi)；
5.3 將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中，封膜，低速垂直旋轉(zhuǎn)15min，使樹脂與反應(yīng)物充分接觸；
5.4 3000rpm 5min離心使樹脂沉入孔底部。
6、芯片點(diǎn)樣
啟動(dòng)MassARRAY NanodispenserRS1000點(diǎn)樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至96孔固體支持物上，制作出芯片。
7、質(zhì)譜檢測(cè)
將芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization-time offlight)，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)分析，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER4.0軟件(Sequenom)分型并輸出結(jié)果，分析受試者鼻咽癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的早期評(píng)估。
實(shí)施例3 與鼻咽癌密切相關(guān)的21個(gè)SNP位點(diǎn)引用的文獻(xiàn)，見表5
表5 與鼻咽癌密切相關(guān)的21個(gè)SNP位點(diǎn)引用的文獻(xiàn)
實(shí)施例4根據(jù)實(shí)施例3中引用的文獻(xiàn)得出21個(gè)SNP位點(diǎn)與鼻咽癌的關(guān)聯(lián)，見表6
表6 21個(gè)SNP位點(diǎn)與鼻咽癌的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
實(shí)施例5 21個(gè)SNP位點(diǎn)的驗(yàn)證
采用上述實(shí)施例2中試劑盒的質(zhì)譜檢測(cè)方法分析21個(gè)SNP位點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER4.0軟件(Sequenom)分型并輸出結(jié)果，其OR值與實(shí)施例4中表6的21個(gè)SNP位點(diǎn)與鼻咽癌的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果相同，說明該21個(gè)位點(diǎn)具有較高的實(shí)用性，可用于鼻咽癌的早期評(píng)估和大規(guī)模篩查，由于質(zhì)譜分析技術(shù)具有檢出成功率高、技術(shù)重現(xiàn)性好、性價(jià)比高，因此本發(fā)明采用的是質(zhì)譜檢測(cè)分析該21個(gè)位點(diǎn)檢出成功率高、技術(shù)重現(xiàn)性好、性價(jià)比高，為鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、診斷參考提供重要依據(jù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽癌疾病的早期評(píng)估。
上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市核子基因科技有限公司
<120> 一種用于檢測(cè)鼻咽癌易感性的試劑盒及其SNP標(biāo)志物
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<170> PatentIn version 3.5
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<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acgttggatg gcaaagttga cagctttccc 30
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acgttggatg gaaagaggaa gtttgaacat c 31
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agctttccca aaacggt 17
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acgttggatg ttcctcaaac agctgcctgc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg acagtgtaag atgtggaggg 30
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<213> 人工序列
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accactccct cctc 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
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<213> 人工序列
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acgttggatg cttctagtgc ttgagagcag 30
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acgttggatg ctgttaacag tgagactagg 30
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<213> 人工序列
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acgttggatg ccttcgggac cttaattctc 30
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ggtgcaaaca actgct 16