專利名稱：重組eb病毒潛伏膜蛋白2a在鼻咽癌檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鼻咽癌的檢測(cè)，具體是重組EB病毒潛伏膜蛋白2A(LMP2A)在鼻咽癌檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(NPC)是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤，在世界各地廣泛存在，也是我國(guó)南方如廣東、廣西、香港福建等地區(qū)高發(fā)腫瘤，在東南亞華人中和北非也有較高的發(fā)病率，每年均有80,000以上的新發(fā)病例。放療、化療是目前對(duì)NPC病人治療的主要手段，通常不能采用手術(shù)治療，而放療對(duì)于晚期患者的治療效果很差，存活率僅14％，因此，患者的早期診斷對(duì)于提高NPC病人的存活率極為重要。
Epstein-Barr病毒(EBV)與NPC的發(fā)生密切相關(guān)，通過檢測(cè)EBV的抗體早期診斷NPC是提高NPC患者存活率的一個(gè)重要的手段。絕大多數(shù)患者血清中存在著高滴度的抗LMP2A的抗體。國(guó)外多采用間接免疫熒光法檢測(cè)血清EB病毒抗體，而國(guó)內(nèi)多采用免疫酶染色法。目前檢測(cè)血清中EB病毒VCA-IgA和EA-IgA抗體已成為臨床上常規(guī)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手段，也用于高發(fā)地區(qū)鼻咽癌病人的篩查。絕大多數(shù)鼻咽癌患者的血清呈VCA-IgA陽(yáng)性，但90％以上的VCA-IgA陽(yáng)性的人群卻不患鼻咽癌；采用免疫酶法檢測(cè)EA-IgA時(shí)，特異性雖然高，但靈敏度低，當(dāng)鼻咽癌患者血清中抗體的滴度在1∶5一下時(shí)，常規(guī)的免疫酶法難以顯示陽(yáng)性結(jié)果。傳統(tǒng)的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)患者血清中EBV的鞘抗原(VCA)和早期抗原(EA)的IgA抗體，雖然特異性和敏感性較高，但方法較為繁瑣，且結(jié)果不穩(wěn)定，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，重復(fù)性差，不是早期診斷鼻咽癌的最佳的檢測(cè)方法。因此，探討NPC的早期診斷顯得更為重要。隨著對(duì)EBV的血清流行病學(xué)的研究和分子生物學(xué)的發(fā)展，克隆、表達(dá)、純化EBV的蛋白或多肽，并以此為抗原建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏和特異的檢測(cè)EBV抗體的方法是目前研究NPC診斷的主要發(fā)展方向。
NPC腫瘤細(xì)胞中病毒蛋白呈潛伏II型表達(dá)，即僅表達(dá)低免疫原性抗原EBNA1、LPM1、LMP2。LMP2包括LMP2A、LMP2B，LMP2A本身不是轉(zhuǎn)化基因，在體內(nèi)外EB病毒潛伏感染的所有B細(xì)胞中都能檢測(cè)出LMP2A，在NPC病人中可以檢測(cè)出針對(duì)LMP2A和LMP2B的高滴度抗體，可以作為NPC病人特異性診斷的指標(biāo)。國(guó)外有報(bào)道以細(xì)胞表面表達(dá)的LMP2A為抗原，用免疫瑩光法檢測(cè)NPC病人血清LMP2A抗體，此方法仍然存在繁瑣、結(jié)果不穩(wěn)定、重復(fù)性差的問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有檢測(cè)鼻咽癌方法的不足，本發(fā)明應(yīng)用重組EB病毒LMP2A為蛋白抗原檢測(cè)鼻咽癌，簡(jiǎn)便、快速、靈敏和特異，有效地解決了問題。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是重組EB病毒潛伏膜蛋白2A在鼻咽癌檢測(cè)中的應(yīng)用。具體地，是用重組LMP2A作為抗原，用ELISA法對(duì)血清樣本進(jìn)行抗LMP2A抗體檢測(cè)，結(jié)果大于臨界分光光密度值的為陽(yáng)性。
本發(fā)明中所說的重組LMP2A，可以參照《含EB病毒LMP2A畢氏酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)LMP2A蛋白的檢測(cè)》(南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(3))一文中的基因工程方法得到。
本研究利用純化的LMP2A蛋白作為抗原，用ELISA的方法檢測(cè)EB病毒相關(guān)腫瘤病人和正常人的血清，結(jié)果顯示在NPC病人血清中存在著高滴度的抗LMP2A抗體。Western-blotting試驗(yàn)也證明了NPC患者中有抗LMP2A抗體的存在。應(yīng)用本發(fā)明與免疫酶染色法聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果有部分樣品抗VCA IgA陰性而抗LMP2A IgA檢測(cè)陽(yáng)性，用Westernblots檢測(cè)證明這部分樣品血清中抗LMP2A抗體的存在。因此，本發(fā)明用于鼻咽癌的早期檢測(cè)，簡(jiǎn)便、快速、靈敏，具有很高的臨床診斷價(jià)值。


圖1是EB病毒相關(guān)病人血清中抗LMP2A抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果示意2是VCA IgA陰性而LMP2A IgA陽(yáng)性的NPC病人血清的Westernblots檢測(cè)示意圖；其中HNEBV陰性的健康人，HIEBV陽(yáng)性的健康人，NPCEBV相關(guān)的NPC病人，HDEBV相關(guān)的何杰金氏病人，GC胃癌病人。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1重組LMP2A的制備重組LMP2A的制備參照《含EB病毒LMP2A畢氏酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)LMP2A蛋白的檢測(cè)》(南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(3))一文中的基因工程方法。
實(shí)施例2EB病毒相關(guān)疾病病人血清中抗LMP2A抗體的檢測(cè)ELISA法檢測(cè)血清EBV陰性的健康人23份(HN)，EBV陽(yáng)性的健康人18份(HI)，EBV相關(guān)的NPC病人76份(NPC)，EBV相關(guān)的何杰金氏病人(HD)8份，胃癌病人(GC)15份及其他與EB病毒無(wú)關(guān)的腫瘤病人24份。
操作步驟(1)抗原包板純化的重組LMP2A抗原用0.01M/L的PBS稀釋至2.5ug/ml濃度包板。每孔加入100ul/ml抗原稀釋液，4℃過夜。
(2)洗板用PBST(含0.05％吐溫的PBS)沖洗酶標(biāo)板3次，每次3分鐘。
(3)封閉用含5％脫脂奶粉的PBS封閉，37℃，1小時(shí)。
(4)洗板同上。
(5)一抗反應(yīng)EB病毒相關(guān)病人的血清以及正常人血清1∶10稀釋后，37℃孵育1小時(shí)。
(6)洗板同上。
(7)二抗反應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)的羊抗人二抗1∶10000稀釋后于37℃孵育40分鐘。
(8)洗板同上。
(9)顯色2mg/ml的TMB以1∶10稀釋于磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，0.1％的H2O2以1∶1000稀釋于磷酸鹽-檸檬酸緩沖液。每孔分別加入50ul TMB和H2O2，顯色。顯色后用硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。
將樣本血清按不同稀釋度重復(fù)上述操作，結(jié)果如圖1所示，不同稀釋度下NPC病人分光光密度(OD)平均值在每個(gè)稀釋度都較HD，HI，GC和其他與EBV無(wú)關(guān)的腫瘤高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著。
計(jì)算不同病人組的LMP2A-IgG水平(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。在正態(tài)分布曲線中，臨界OD值應(yīng)設(shè)為陰性血清的OD值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差。此實(shí)驗(yàn)中，臨界OD值＞0.198判定為陽(yáng)性。結(jié)果如表1所示。
表1.血清中抗LMP2A IgG檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，2/3以上的來自NPC病人血清中抗LMP2A-IgG抗體陽(yáng)性且OD值較其他血清更高，*P＜0.05。也說明了各血清樣本抗LMP2A-IgG抗體的陽(yáng)性率。
實(shí)施例3NPC病人血清中抗VCA IgA和抗LMP2A IgA抗體檢測(cè)取76份NPC病人血清，分別進(jìn)行抗VCA IgA和抗LMP2A IgA抗體檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。
表2.NPC病人血清中抗VCA IgA和抗LMP2A IgA抗體檢測(cè)比較

兩者結(jié)果比較，P＞0.05。更重要的是有3份樣品抗VCA IgA陰性而抗LMP2A IgA檢測(cè)陽(yáng)性。這表明鼻咽癌病人體內(nèi)存在著針對(duì)這兩種病毒抗原的體液免疫應(yīng)答，提示對(duì)這兩種抗原所產(chǎn)生的抗體聯(lián)合檢測(cè)有助于提高對(duì)鼻咽癌患者的診斷。
將上述3例抗VCA IgA陰性而抗LMP2A IgA陽(yáng)性的NPC病人血清的Western blots檢測(cè)，如圖2所示，圖中1、2、3是3例抗VCA IgA陰性而抗LMP2A IgA檢測(cè)陽(yáng)性的NPC血清標(biāo)本，4、5是EBV陰性的健康人。結(jié)果證明這3份血清中抗LMP2A抗體的存在。
權(quán)利要求
1.重組EB病毒潛伏膜蛋白2A在鼻咽癌檢測(cè)中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的重組EB病毒潛伏膜蛋白2A在鼻咽癌檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征是，以重組EB病毒潛伏膜蛋白2A為抗原，用ELISA法對(duì)血清樣本進(jìn)行抗LMP2A抗體檢測(cè)，結(jié)果大于臨界分光光密度值的為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明涉及鼻咽癌的檢測(cè)，具體是重組EB病毒潛伏膜蛋白2A在鼻咽癌檢測(cè)中的應(yīng)用。重組EB病毒潛伏膜蛋白2A在鼻咽癌檢測(cè)中的應(yīng)用，具體地，是用重組LMP2A作為抗原，用ELISA法對(duì)血清樣本進(jìn)行抗LMP2A抗體檢測(cè)，結(jié)果大于臨界分光光密度值的為陽(yáng)性。本發(fā)明用于鼻咽癌的早期檢測(cè)，簡(jiǎn)便、快速、靈敏，具有很高的臨床診斷價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1687779SQ200510038868
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者姚堃, 陳云, 彭光勇, 孫華, 謝芳藝, 丁傳林, 周峰, 吳文翰 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)