一種用于檢測鼻咽癌的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測鼻咽癌的試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體，與人NASG蛋白具有較好的親和能力。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲鼻咽中的NASG蛋白，通過其含量的變化來檢測鼻咽癌，將其制備成為相應(yīng)的試劑盒，將用于鼻咽癌的篩查。利用本發(fā)明的試劑盒，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種用于檢測鼻咽癌的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測鼻咽癌的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼻咽癌(NPC)是我國南方常見的惡性腫瘤，廣東為高發(fā)區(qū)。鼻咽癌是指鼻咽粘膜上 皮發(fā)生的癌腫，大多為低分化鱗癌，其惡性度高，發(fā)病部位隱蔽，特別是在咽隱窩和鼻咽頂 部者，早期癥狀不明顯，因而難以早期發(fā)現(xiàn)，誤診誤治率較高，可達(dá)12.2%，因而在確診的鼻 咽癌中，其5年生存率長期徘徊在50%~60%左右。對鼻咽癌進(jìn)行早期診斷以便早期治療， 提高患者的生存率一直是NPC臨床研究的重要課題之一。
[0003] 目前對鼻咽癌早期的檢測方法有多種，包括有:EB病毒血清學(xué)標(biāo)記物如病毒殼抗 原一免疫球蛋白A(EBVCA 21gA)、EB病毒潛伏膜蛋白、EB病毒早期復(fù)合抗原(EBV 2-EA)IgG 的抗體檢測，鼻咽癌相關(guān)腫瘤標(biāo)記物如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、細(xì)胞間黏附分子、 CYFRA2121以及端粒酶等的檢測。雖然這些指標(biāo)的單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用為鼻咽癌的診斷提供了 有用的信息，然而它們均缺乏足夠的靈敏度與特異性。
[0004] NASG蛋白是一種分泌性蛋白（基因序列登錄號:AF439448.1)，在正常人及鼻咽部 慢性炎癥患者的鼻咽組織中表達(dá)豐富，而在鼻咽癌患者的鼻咽組織中表達(dá)顯著下調(diào)。因而 如何通過檢測NASG蛋白的含量以及如何無創(chuàng)傷地獲取NASG蛋白則是建立早期、無創(chuàng)傷檢測 鼻咽癌的有效方法。
[0005] 核酸適體(Aptamer,又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生 物革E1標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)從人工合成的 DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適體 的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功 能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有很多優(yōu) 良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透 組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物 檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種特異結(jié)合NASG的核酸適體及其試劑盒。
[0007] 本發(fā)明提供的核酸適體，是序列表的序列1 -15任一項所示的單鏈DNA。
[0008]所述核酸適體與NASG蛋白具有較好的親和能力。
[0009] 還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0010] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：
[0011] a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具 有相同功能的核酸適體的衍生物；
[0012] b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同 功能的核酸適體的衍生物；
[0013] c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物；
[0014] d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的 衍生物；
[0015] e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體 具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0016] 所述核酸適體可用于制備檢測NASG的試劑盒。
[0017] 利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲中鼻咽組織中的中的NASG，從而用于相關(guān)鼻咽 癌篩查。利用本發(fā)明的核酸適體，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明具有 很高的應(yīng)用價值。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019]實(shí)施例1NASG蛋白的獲得
[0020] 將AF439448.1所示的NASG基因通過本領(lǐng)域常規(guī)的真核表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)，獲得了 相應(yīng)的目的多肽蛋白。
[0021] 實(shí)施例2核酸適體的篩選和制備
[0022]設(shè)計兩端包含大約20個核苷酸、中間包括40個核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下：
[0023] 5 '-TAGCATGCAATGCCAGTATAG(N40)AACGTGCATGAACTATGAGT-3 ' ；N40代表40個隨機(jī) 核苷酸。
[0024] 將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回 收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75yg RNA文庫經(jīng) 硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ugNASG蛋白，37 °C孵育30min，反應(yīng)液 經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜;然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/ L醋酸銨，1.5mmo 1 /L EDTA，0.15 % SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重 新溶解于20ylDEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪 篩選;每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子 庫，篩選共進(jìn)行10輪。得到了 15個適配子，其序列分別為SEQ ID N0:1-15所示。具體序列如 下所示：
[0025] NASG-1 ：
[0026] TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATATTCAAGATTTCTATAACACATTCAGATTCCAACATTAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID N0:1)
[0027] NASG-2：
[0028] TAGCATGCAATGCCAGTATAGATCGCAACTCCATCACGCATCCCTACTCTTATAGATCACCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:2)
[0029] NASG-3：
[0030] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCTCGAACGCACATTACATACATCTTAGTAATTATCTTTAAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:3)
[0031] NASG-4：
[0032] TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTTCTTTCACATATTCGCAATACAACAAACCTCTGCCACAAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:4)
[0033] NASG-5：
[0034] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCATTATATTCTTATCCACGCCTCTATCTACACTCAAAGAAAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:5)
[0035] NASG-6：
[0036] TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATCCTTACGCTCGCTCATTAATCACCACCTATAAATTCCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:6)
[0037] NASG-7 ：
[0038] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAAACAACTCAAGATAATCACTATTACAGAACAACAACTAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:7)
[0039] NASG-8：
[0040] TAGCATGCAATGCCAGTATAGATATAGATCATACAAATATATTATTCCGCCTACAATTCCAAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:8)
[0041 ] NASG-9：
[0042] TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTTAATCAACGCATTACAAGACCTATAATTAACATACAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:9)
[0043] NASG-10：
[0044] TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTACTCATCGCCTCTCCACCTACCGCCTATACTCTACTACAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:10)
[0045] NASG-11：
[0046] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAATTTTCACTATTAACACCAATAATTAAGATAACGAACAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:11)
[0047] NASG-12：
[0048] TAGCATGCAATGCCAGTATAGAGACTCTATACATATATTCACTCTCCTTAATCAACAATTCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:12)
[0049] NASG-13：
[0050] TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTATAGACACTCTCAATTCCAGAATTAACCTCGCCTCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:13)
[0051] NASG-14：
[0052] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCACTTAATAATATTTCTCTTACGCTAATATATCCAACCCAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:14)
[0053] NASG-15：
[0054] TAGCATGCAATGCCAGTATAGCTATATACACTATCACATTCCAGAATTAACCTCACCTCACAACGTGCATGAACTAT GAGT(SEQ ID NO:15)
[0055] 實(shí)施例3蛋白結(jié)合適配子的性能測定
[0056] 將適配子分別取2.0yg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，純化回收去磷酸 化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放射性 標(biāo)記的適配子分別與不同濃度（1-200ηΜ)的NASG37°C孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素 膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次 測定。計算各個適配子與leptin的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
[0057]
_8]~實(shí)施例4所述適配子特異性分析k及穩(wěn)定性分析 '
[0059]分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍亂弧菌VgrG3C蛋白，大腸桿菌外膜蛋白 A，⑶CH蛋白，NASG蛋白，與15條適配子進(jìn)行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，這些適配子都 不與這些蛋白相結(jié)合，而只與NASG蛋白結(jié)合保持較高的特異性。
[0060] 將所述的適配子，取〇.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置三周。通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)三周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。
[0061] 實(shí)施例5所述適配子疾病的診斷
[0062]取10個患者和2個正常人的鼻咽分泌物。生理鹽水沖洗鼻腔，用細(xì)棉簽在鼻視鏡下 插到鼻咽部，放置5-8分鐘，取出棉簽，將棉球放入底部空心，外套有離心收集管的小離心管 中，在4攝氏度下7500g離心獲取分泌物，使用生理鹽水稀釋，獲得目標(biāo)樣本。
[0063] 將15個適配子分別與10個患者以及2個正常人的分泌物混合30min，通過生物素分 離，定量分析其中的NASG蛋白的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，10個鼻咽癌患者中NASG蛋白的含量顯 著增加3倍以上。
[0064]以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于鼻咽癌檢測的試劑盒，其含有特異結(jié)合NASG蛋白的核酸適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體序列為SEQ ID N〇:6所述。3. -種檢測鼻咽癌的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1-2任一項所述的試劑盒。
【文檔編號】G01N33/574GK105974133SQ201610608880
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年11月7日
【發(fā)明人】張玲
【申請人】張玲