一步均相h-fabp檢測試劑盒及其制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種一步均相H?FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，主要組成包括：抗H?FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球、抗H?FABP抗體偶聯(lián)的感光微球、分析緩沖液、反應(yīng)孔；本發(fā)明還公開了所述一步均相H?FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制備方法，該方法包括：抗H?FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備；抗H?FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制備，以及分析緩沖液的制備；最后本發(fā)明公開了該試劑盒的使用方法；本發(fā)明的試劑盒具有靈敏度高、特異性好、檢測范圍寬、重復(fù)性好、操作簡單、免清洗等特點，便于臨床檢測使用，其應(yīng)用于心臟病的監(jiān)測，可以提高心肌梗塞診斷的準確率，具有極大的市場價值。
【專利說明】
一步均相H-FABP檢測試劑盒及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及H-FABP含量檢測領(lǐng)域，具體涉及一種一步均相H-FABP檢測試劑盒及其 制備和使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是世界上發(fā)病率和死亡率較 高的疾病之一。據(jù)最近美國心臟病協(xié)會數(shù)據(jù)顯示，2003年美國有720萬AMI患者。但同時AMI 又是高誤診率的疾病之一，一些確實患有AMI的患者沒有得到恰當?shù)奶幚?，?dǎo)致較高的死亡 率;而另一些非AMI患者又接受了不必要的治療，引起不必要的花費。世界衛(wèi)生組織推薦:典 型的胸痛、心電圖改變和心肌酶異常三項指標中有兩項符合，即可診斷AMI。但許多AMI患者 早期沒有典型的臨床癥狀和心電圖的異常改變，因此心肌損傷標志物的檢測就顯得尤為重 要。近年來心肌標志物在臨床中的應(yīng)用得到了越來越廣泛的重視，其發(fā)展也相當迅速，在臨 床中出現(xiàn)了很多心肌標志物。
[0003]脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP)是一族小分子質(zhì)量的蛋白 質(zhì)，廣泛存在于哺乳動物的心、腦肝和骨骼肌的多種細胞內(nèi)，含量豐富，占細胞內(nèi)可溶性蛋 白總量的3%~8%。國外研究發(fā)現(xiàn)，有幾種不同結(jié)構(gòu)FABP存在，其中的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋 白（H-FABP)在急性心肌梗死的早期出現(xiàn)，在胸痛就診的患者中測定這種蛋白質(zhì)的濃度，對 早期診斷和臨床處理AMI有重要意義。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白是一種含有132個氨基酸的可 溶性蛋白質(zhì)，其性能類似于肌紅蛋白（myoglobin)，但是分子量較低，只有15kD，存在細胞質(zhì) 中，在心肌損害時容易釋放進入血循環(huán)，成為心肌受損的標志物。多數(shù)的研究顯示在心肌梗 死患者胸痛發(fā)生3~6h內(nèi)測定H-FABP的敏感性要高于肌紅蛋白，溶栓治療后24小時H-FABP 恢復(fù)到正常值，治療后測定H-FABP可作為再灌注依據(jù)，也可以判斷再梗死。
[0004] 歐洲新近發(fā)表的一個為期3年的對664例胸痛癥狀入院患者前瞻性的研究報告，對 這些患者進行了多項目的監(jiān)測，包括心肌鈣蛋白T(cTnT)和心肌脂肪酸結(jié)合蛋白的比較研 究，心肌鈣蛋白T( cTnT)對急性心肌梗死的確認值等于或大于0.03yg/L?；颊咴谛募」Ｋ腊Y 狀出現(xiàn)4h之內(nèi)接受檢查，其H-FABP對心肌梗死的敏感性要遠高于cTnT(73%比55%，P = 0.043)，特異性為71 %，其它標志物都沒能超過cTnT。如將H-FABP和cTnT聯(lián)合使用（不管哪 一項先升高），則可以明顯地改善兩者的敏感性(達到85%，P<0.004)。這種聯(lián)合檢測的方 法也可以改進陰性預(yù)測值，陰性似然比(negative likelihood ratio)和危險性比率。在癥 狀出現(xiàn)4h之內(nèi)用H-FABP來評估的心肌梗死要優(yōu)于cTnT，故認為H-FABP是一種有用的心肌梗 死標志物。
[0005] 常用的H-FABP檢測方法有金標定性試驗、焚光免疫法、聯(lián)免疫吸附試驗(EL ISA)、 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法(CMIA)和乳膠比濁法。金標定性實驗快速，但該方法靈敏度低、無法動態(tài) 監(jiān)測H-FABP含量的變化。熒光免疫法操作復(fù)雜，對操作環(huán)境和操作人員有較高的要求。 ELISA法的檢測靈敏度較低，目前主要應(yīng)用于傳染性疾病篩查等對檢測靈敏度要求較低的 項目，并且反應(yīng)時間較長。CMIA法是從ELISA法改進而來，與ELISA法相比具有操作簡單，檢 測速度快等特點，但是CMIA法是非均相反應(yīng)，操作過程需要清洗，降低了檢測的可重復(fù)性。 乳膠比濁法是利用抗原抗體反應(yīng)原理測定血清中H-FABP的含量，此方法無法兼顧靈敏度和 線性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有H-FABP免疫檢測方法存在的問題，本發(fā)明提供一種可用于定 量檢測的一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒;本發(fā)明還提供一種一步均相H-FABP 氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制備方法和使用方法。
[0007] 技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述一種一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā) 光檢測試劑盒，主要組成包括:抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球、抗H-FABP抗體偶聯(lián)的感光微 球、分析緩沖液、反應(yīng)孔。
[0008] 所述發(fā)光微球表面活性基團為醛基、羧基、氨基等，發(fā)光微球帶有發(fā)光化合物和鑭 系元素化合物的高分子，發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己稀)或Thioxene(二甲基噻 吩）的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA) 3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen等，發(fā)光微球大小 為100-300nm，該發(fā)光微球可由鉑金埃爾默公司購得。
[0009] 所述感光微球表面活性基團為醛基、羧基、氨基等，感光微球帶有光激發(fā)產(chǎn)生單線 態(tài)氧的染料，如酞箐染料、葉綠素等，感光微球大小為100_300nm，該感光微球可由鉑金埃爾 默公司購得。
[0010] 進一步地，所述抗H-FABP抗體(通過常規(guī)免疫學(xué)方法制備)為針對H-FABP不同表位 的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0011 ]進一步地，所述反應(yīng)孔為微孔板、微流控試劑盤、反應(yīng)杯或反應(yīng)管。
[0012] 本發(fā)明所述的一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制備方法，，包括如 下步驟：
[0013] (1)抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備；
[0014] (2)抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制備；
[0015] ⑶分析緩沖液的制備。
[0016] 進一步地，所述抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備，包括如下步驟：
[0017] (1)將抗H-FABP抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將發(fā)光微 球，用HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清；
[0018] (2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；
[0019] (3)加入2·0-3·0μ1 10%質(zhì)量分數(shù)Tween 20,8-12μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES 緩沖液將體積補足到200μ1，震蕩反應(yīng)24-48小時；
[0020] (4)加8-12以16511^/1111010溶液到反應(yīng)體系中；震蕩反應(yīng)0.5-1.5小時，離心，去除 上清；
[0021] (5)加入150-250μ1 Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0022] (6)最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至 所需濃度。
[0023]進一步地，所述抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制備，包括如下步驟：
[0024] (1)將抗H-FABP抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將感光微 球，用HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清；
[0025] (2)將抗體溶液加入感光微球中，重懸；
[0026] (3)加入2·0-3·0μ1 10%質(zhì)量分數(shù)Tween 20,8-12μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES 緩沖液將體積補足到200μ1，震蕩反應(yīng)24-48小時；
[0027] (4)加8-12以16511^/1111010溶液到反應(yīng)體系中；震蕩反應(yīng)0.5-1.5小時，離心，去除 上清；
[0028] (5)加入150-250μ1 Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0029] (6)最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至 所需濃度。
[0030] 進一步地，所述分析緩沖液的制備，包括如下步驟:將HEPES 0. l-2g、BSA0. l-5g、 Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-lml加入蒸餾水溶解后，制成分析緩沖 液。
[0031 ]進一步地，步驟(1)中所述抗H-FABP抗體與發(fā)光微球與的質(zhì)量比為1: (1-100)。 [0032]進一步地，步驟(1)所述抗H-FABP抗體與感光微球的質(zhì)量比為1: (1-100)。
[0033]進一步地，使用分析緩沖液稀釋抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200yg/ ml;稀釋抗H-FABP抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。
[0034]本發(fā)明所述的一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的使用方法，包括如下 步驟：
[0035] (1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球和抗H-FABP抗 體偶聯(lián)的感光微球，混合反應(yīng)5-60分鐘；
[0036] (2)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號值；
[0037] (3)繪制H-FABP濃度與光信號值的標準曲線，利用步驟(2)測得的光信號值，通過 標準曲線計算H-FABP含量。
[0038]有益效果：由現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑 盒具有如下優(yōu)點:本發(fā)明所得試劑盒能利用H-FABP的抗體，以氧通道化學(xué)發(fā)光技術(shù)為平臺， 針對心肌梗塞診斷的H-FABP快速檢測，本發(fā)明的試劑盒檢測快速準確、范圍寬、靈敏度高、 特異性好、重復(fù)性好、免清洗；同時本發(fā)明的試劑盒的制備方法簡單，無污染，并且試劑盒使 用方法操作簡單，將其應(yīng)用于心臟病的監(jiān)測，可以提高心肌梗塞診斷的準確率，便于臨床檢 測使用，具有極大的市場價值。
【附圖說明】
[0039]圖1是本發(fā)明實施例3提供的H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒原理示意圖；
[0040] 圖2是本發(fā)明實施例3提供的H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測線性范圍圖；
[0041] 圖3是本發(fā)明實施例3試劑盒與朗道H-FABP乳膠比濁試劑盒的檢測結(jié)果相關(guān)性比 較圖。
【具體實施方式】
[0042] 以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0043] 實施例1
[0044]抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備：
[0045] (1)將0. lmg抗H-FABP單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。將O.lmg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；
[0046] (2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；
[0047] (3)加入2·0μ1 10%Tween 20,8μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補足 到200μ1，37Γ震蕩反應(yīng)24小時；
[0048] (4)用800mM NaOH配制65mg/ml CM0,加8μ1溶液到反應(yīng)體系中；37°C震蕩反應(yīng)0.5 小時，離心，去除上清；
[0049] (5)加入150μ1 Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0050] (6)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0051 ]抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制備：
[0052] (1)將0. lmg抗H-FABP單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。將O.lmg感光微球，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；
[0053] (2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；
[0054] (3)加入2·0μ1 10%Tween 20,8μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補足 到200μ1，37Γ震蕩反應(yīng)24小時；
[0055] (4)用800mM NaOH配制65mg/ml CM0,加8μ1溶液到反應(yīng)體系中；37°C震蕩反應(yīng)0.5 小時，離心，去除上清；
[0056] (5)加入150μ1 Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0057] (6)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7_8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0058]分析緩沖液的制備：將HEPES 0.1g、BSA 0.1g、Casein 0.1g、NaCl 0.5g、Triton X-100 0.01ml加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補足到100ml，制成分析緩沖液。 [0059]使用分析緩沖液稀釋抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml;稀釋抗 H-FABP抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。
[0060]上述抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球、抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球、分析緩沖液再加 入微孔板組成本發(fā)明所述的試劑盒。
[0061 ] 實施例2
[0062]抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備：
[0063] (1)將0. lmg抗H-FABP多克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。將10mg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4) 重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；
[0064] (2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；
[0065] (3)加入3μ1 10%Tween 20，12μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補足 到200μ1，37Γ震蕩反應(yīng)48小時；
[0066] (4)用800mM NaOH配制65mg/ml CM0,加12μ1溶液到反應(yīng)體系中；37°C震蕩反應(yīng)1.5 小時，離心，去除上清；
[0067] (5)加入250μ1 Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0068] (6)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7_8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0069]抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制備：
[0070] (1)將0. lmg抗H-FABP多克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。將10mg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4) 重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；
[0071 ] (2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；
[0072] (3)加入3μ1 10%Tween 20，12μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補足 到200μ1，37Γ震蕩反應(yīng)48小時；
[0073] (4)用800mM NaOH配制65mg/ml CM0,加12μ1溶液到反應(yīng)體系中；37°C震蕩反應(yīng)1.5 小時，離心，去除上清；
[0074] (5)加入250μ1 Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0075] (6)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7_8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0076]分析緩沖液的制備：將HEPES 2g、BSA 5g、Casein 5g、NaCl 3g、Triton X-100 1ml 加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補足到100ml，制成分析緩沖液。
[0077]使用分析緩沖液稀釋抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml;稀釋抗 H-FABP抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。
[0078]上述抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球、抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球、分析緩沖液再加 入微流控試劑盤組成本發(fā)明所述的試劑盒。
[0079] 實施例3
[0080] (1)將0. lmg抗H-FABP單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。將lmg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4) 重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；
[0081 ] (2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；
[0082] (3)加入2·5μ1 10%Tween 20，10μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補 足到200μ1，37Γ震蕩反應(yīng)36小時；
[0083] (4)用800mM NaOH配制65mg/ml CM0,加10μ1溶液到反應(yīng)體系中；37°C震蕩反應(yīng)1小 時，離心，去除上清；
[0084] (5)加入200μ1 Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0085] (6)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7_8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0086]抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制備：
[0087] (1)將0. lmg抗H-FABP單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。將lmg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4) 重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；
[0088] (2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；
[0089] (3)加入2·5μ1 10%Tween 20，10μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補 足到200μ1，37Γ震蕩反應(yīng)36小時；
[0090] (4)用800mM NaOH配制65mg/ml CM0,加 ?ομL溶液到反應(yīng)體系中；37°C震蕩反應(yīng)1小 時，離心，去除上清；
[0091] (5)加入200μ1 Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0092] (6)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7_8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0093]分析緩沖液的制備：將HEPES 1.0g、BSA 2.5g、Casein 2.5g、NaCl 1.75g、Triton X-100 0.5ml加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補足到100ml，制成分析緩沖液。
[0094]使用分析緩沖液稀釋抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml;稀釋抗 H-FABP抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。
[0095]上述抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球、抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球、分析緩沖液再加 入反應(yīng)杯組成本發(fā)明所述的試劑盒。
[0096] 實施例4
[0097]抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備：
[0098] (1)將0. lmg抗H-FABP單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。將5mg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4) 重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；
[0099] (2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸；
[0100] (3)加入2·5μ1 10%Tween 20，10μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補 足到200μ1，37Γ震蕩反應(yīng)36小時；
[0101] (4)用800mM NaOH配制65mg/ml CM0,加10μ1溶液到反應(yīng)體系中；37°C震蕩反應(yīng)1小 時，離心，去除上清；
[0102] (5)加入200μ1 Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0103] (6)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0104] 抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制備：
[0105] (1)將0.1 mg抗H-FABP單克隆抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液 (PH7.4)重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。將5mg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4) 重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清；
[0106] (2)將抗體溶液加入到感光微球中，重懸；
[0107] (3)加入2·5μ1 10%Tween 20，10μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補 足到200μ1，37Γ震蕩反應(yīng)36小時；
[0108] (4)用800mM NaOH配制65mg/ml CM0,加10μ1溶液到反應(yīng)體系中；37°C震蕩反應(yīng)1小 時，離心，去除上清；
[0109] (5)加入200μ1 Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0110] (6)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0111]分析緩沖液的制備：將HEPES 1.0g、BSA 2.5g、Casein 2.5g、NaCl 1.75g、Triton x-100 0.5ml加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補足到100ml，制成分析緩沖液。
[0112]使用分析緩沖液稀釋抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml;稀釋抗 H-FABP抗體偶聯(lián)的感光微球濃度為10-200μg/ml。
[0113] 上述抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球、抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球、分析緩沖液再加 入反應(yīng)管組成本發(fā)明所述的試劑盒。
[0114] 實施例5
[0115] 試劑盒的使用方法：
[0116] (1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球和抗H-FABP抗 體偶聯(lián)的感光微球，混合反應(yīng)5-60分鐘；
[0117] (2)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號值；
[0118] (3)繪制H-FABP濃度與光信號值的標準曲線，利用步驟(2)測得的光信號值，通過 標準曲線計算H-FABP含量。
[0119] 試驗例6
[0120] 發(fā)明試劑盒方法學(xué)評價：
[0121] 1、線性
[0122] 配制濃度為Ong/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml， 200ng/ml，的H-FABP標準品溶液。在反應(yīng)孔中分別加入5μ1標準品、加入20μ1偶聯(lián)H-FABP抗 體的發(fā)光微球(終濃度1 〇μg/ml)，加入20μ1偶聯(lián)H-FABP抗體的感光微球(終濃度1 Oμg/ml)， 室溫暗處溫育15分鐘。溫育后，激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號值。
[0123] 如上用本發(fā)明實施3所制備的H-FABP檢測試劑盒對其進行檢測，繪制各檢測試劑 盒標準工作曲線(見附圖2)。從附圖2可以看出本發(fā)明所制備的檢測試劑盒能保持良好的線 性，H-FABP濃度為200ng/ml時方法無 Hook效應(yīng)。
[0124] 2、準確度
[0125] 準確性測量是指用已知量H-FABP標準品加入到正常人的血清標本中，測量加入后 濃度值與加入的理論值進行比較，計算H-FABP的回收率。檢測結(jié)果如下：
[0126]
[0127] 3、精密度
[0128] 選取3份不同濃度的標本，分別按照本發(fā)明所述的方法重復(fù)測量20次。根據(jù)20次的 測量結(jié)果，計算平均偏差C.V. %值。
[0129]
[0130] 4、分析靈敏度
[0131] 分析靈敏度的定義為:是指在統(tǒng)計學(xué)意義上能與零劑量區(qū)別的量。重復(fù)20次測量 零劑量點，計算其平均值(X)和標準差(SD)，以X+2SD的計算的濃度值即為該試劑盒的分析 靈敏度。本發(fā)明試劑盒的分析靈敏度為〇. 1 ng/m 1。
[0132] 5、特異性
[0133] 檢測本發(fā)明的氧通道化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑在干擾性物質(zhì)(溶血、高血脂、高膽紅 素)存在的情況下檢測標本的準確性。將血紅蛋白溶液(5mg/ml)分別取適量加入到lml的H-FABP陽性血清標本中，使血清中血紅蛋白的含量分別為lmg/ml、0.5mg/ml。將甘油三酯溶液 (5mg/ml)分別取適量加入到lml的H-FABP陽性血清標本中，使血清中甘油三酯的含量分別 為lmg/mL、0.5mg/ml。將膽紅素溶液(5mg/ml)分別取適量加入到lml的H-FABP陽性血清標本 中，使血清中膽紅素的含量分別為50μg/ml、25μg/ml。對加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅 素的H-FABP陽性標本進行測定，在反應(yīng)孔中每孔分別加入5μ1含加入了血紅蛋白、甘油三酯 和膽紅素的H-FABP陽性標本，加入20μ 1偶聯(lián)抗H-FABP抗體的發(fā)光微球(終濃度1 Oμg/ml)，加 入20μ1偶聯(lián)H-FABP抗體的感光微球(終濃度10μg/ml)，室溫暗處溫育15分鐘。溫育后，激發(fā) 光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號值。將理論濃度與實測濃度的比值作為 回收率，回收率在95.62 % -105.36 %之間。表明H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光試劑在檢測血清樣 本時不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。
[0134]
[0135] 6、相關(guān)性
[0136] 如圖3所示，與朗道H-FABP乳膠比濁試劑盒的相關(guān)性為：
[0137] y = 0.9963x+0.1633,R2 = 0.996
[0138] 本發(fā)明與現(xiàn)有方法和產(chǎn)品相比，具有檢測靈敏度高、特異性好、成本較低，對檢測 儀器要求低的優(yōu)點。
[0139] 本發(fā)明的原理(見附圖1)是通過在均相條件下將偶聯(lián)了抗H-FABP抗體的帶有酞菁 染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且?guī)в袖B螯合物、偶聯(lián)了抗H-FABP抗 體的發(fā)光微球2混合。此時偶聯(lián)了抗H-FABP抗體感光微球1和偶聯(lián)了抗H-FABP抗體的發(fā)光微 球2迅速有效地識別檢測樣本3的目標分子而形成免疫夾心復(fù)合物。在激光(波長為680nm) 的照射下，感光微球上的光敏劑將周圍環(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單線態(tài)氧。單線態(tài) 氧擴散至發(fā)光微球，與其上的化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，進一步激活了同樣在發(fā)光微球上的熒光基 團，使之發(fā)出熒光，波長為615nm。單線態(tài)氧的半衰期為4ys，在溶液中的擴散距離為200nm左 右。如果生物分子不存在相互作用，單線態(tài)氧無法擴散到發(fā)光微球，則不會有熒光信號產(chǎn) 生。
[0140] 以上實施例僅用以說明本材料的技術(shù)實施方案而非限制，盡管參照較佳實施例對 本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行 修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利 要求范圍當中。
【主權(quán)項】
1. 一種一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，主要組成包括:抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球、抗H-FABP抗體偶聯(lián)的感光微球、分析緩沖液、反應(yīng)孔。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，所 述抗H-FABP抗體為針對H-FABP不同表位的單克隆抗體或多克隆抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，所 述反應(yīng)孔為微孔板、微流控試劑盤、反應(yīng)杯或反應(yīng)管。4. 權(quán)利要求1-3任一所述的一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制備方法， 其特征在于，包括如下步驟： (1) 抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制備； (2) 抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制備； (3) 分析緩沖液的制備。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述抗H-FABP抗體偶聯(lián)發(fā)光微球的制 備，包括如下步驟： ⑴將抗H-FABP抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將發(fā)光微球，用 HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清； (2) 將抗體溶液加入到發(fā)光微球中，重懸； (3) 加入2·0-3·0μll0%質(zhì)量分數(shù)Tween20,8-12μl 400mMNaCNBH3，加入HEPES緩沖液 將體積補足到200μ1，震蕩反應(yīng)24-48小時； (4) 加8-12μ1 65mg/ml CMO溶液到反應(yīng)體系中；震蕩反應(yīng)0.5-1.5小時，離心，去除上 清； (5) 加入150-250μ1 Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次； (6) 最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至所需 濃度。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述抗H-FABP抗體偶聯(lián)感光微球的制 備，包括如下步驟： ⑴將抗H-FABP抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液洗滌，備用；將感光微球，用 HEPES緩沖液清洗，離心，去除上清； (2) 將抗體溶液加入到感光微球中，重懸； (3) 加入2·0-3·0μll0%質(zhì)量分數(shù)Tween20,8-12μl 400mMNaCNBH3，加入HEPES緩沖液 將體積補足到200μ1，震蕩反應(yīng)24-48小時； (4) 加8-12μ1 65mg/ml CMO溶液到反應(yīng)體系中；震蕩反應(yīng)0.5-1.5小時，離心，去除上 清； (5) 加入150-250μ1 Tris-HCl緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次； (6) 最后一次離心后用PBS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，使用前稀釋至所需 濃度。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述分析緩沖液的制備，包括如下步 驟：將HEPES 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-lml 加入蒸餾水溶解后，制成分析緩沖液。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述抗H-FABP抗體與發(fā)光 微球與的質(zhì)量比為1: (1-100)。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)所述抗H-FABP抗體與感光微 球的質(zhì)量比為1:(1-100)。10. 權(quán)利要求1-3任一所述的一步均相H-FABP氧通道化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的使用方法， 包括如下步驟： (1) 在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗H-FABP抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球和抗H-FABP抗體偶 聯(lián)的感光微球，混合反應(yīng)5-60分鐘； (2) 激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號值； (3) 繪制H-FABP濃度與光信號值的標準曲線，利用步驟(2)測得的光信號值，通過標準 曲線計算H-FABP含量。
【文檔編號】G01N33/543GK105974129SQ201610414809
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】李明明, 黃寶福, 淳林
【申請人】南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司