專利名稱：鼻咽癌相關基因ubap1編碼蛋白的純化及其抗體的制備的制作方法
專利說明鼻咽癌相關基因UBAP1編碼蛋白的純化及其抗體的制備 本發(fā)明涉及鼻咽癌相關基因UBAP1編碼蛋白的純化及其抗體的制備，屬于蛋白質(zhì)工程領域。鼻咽癌是一種高發(fā)于我國南方的頭頸部惡性腫瘤，如廣東、廣西、湖南、江西、福建五省，其中又以廣東省最為常見，發(fā)病率高達15.85％。由于鼻咽癌的早期診斷目前尚無有效的方法，統(tǒng)計顯示，約70％的患者就醫(yī)時都已進入晚期(III～IV期)，鼻咽癌早期(I～II期)和晚期(III～IV期)患者的五年生存率相差非常大，分別為90％和20％，其中早期病人中有許多獲得了根治。但目前臨床上常用的鼻咽癌輔助診斷的檢測方法-ELISA法檢測EB病毒殼抗原抗體(VCA-IgA)和EB病毒早期抗原抗體(EA-IgA)尚不夠理想。因而急待開發(fā)用于鼻咽癌早期特異性診斷的新型手段。UBAP1是我室克隆的鼻咽癌相關新基因，研究表明UBAP1在鼻咽癌組織表達明顯下調(diào)和缺失。細胞增殖實驗、軟瓊脂集落形成實驗和裸鼠致瘤實驗初步證實UBAP1具有抑制惡性表型的作用。應用免疫組化法對129例鼻咽癌組織、50例鼻咽癌癌旁組織及76例鼻咽炎性粘膜上皮研究，結果表明，UBAP1蛋白與鼻咽癌存在負相關性，檢測UBAP1蛋白表達缺失在診斷鼻咽癌方面具有較好的臨床價值，其特異度達82.9％。本專利旨在應用對UBAP1基因的研究成果，通過純化鼻咽癌相關基因UBAP1編碼的蛋白及制備其抗體，以獲得用于鼻咽癌特異性診斷的試劑盒。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，UBAP1是鼻咽癌潛在的抑制基因，具備作為鼻咽癌診斷和治療的分子標志的特點。本發(fā)明采用多聚酶鏈式反應(PCR)方法克隆UBAP1基因蛋白編碼序列，構建該基因的融合表達質(zhì)粒，導入BL21的大腸桿菌中，IPTG誘導其在大腸桿菌中的表達，采用谷胱甘肽親和層析系統(tǒng)純化獲得UBAP1融合蛋白，進而制備兔多抗和小鼠單抗。在原有研究基礎上，結合大樣本量的正常與鼻咽癌組織中UBAP1蛋白的表達水平，建立檢測標準，從而制得用于鼻咽癌特異性診斷的UBAP1基因診斷試劑盒。
根據(jù)原核表達載體pGEX-4T-2的GST閱讀框架設計引物，使UBAP1基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致。以含UBAP1基因的質(zhì)粒為模板(0.1μg)，加入上述引物各10pmol進行擴增，回收PCR產(chǎn)物條帶。用BamH I、Xhol I分別雙酶切PCR回收產(chǎn)物及pGEX-4T-2載體，產(chǎn)生匹配的粘末端。小膠回收試劑回收線性的1.5kb的載體，UBAP1編碼區(qū)片段。將pGEX-4T-2載體與UBAP1基因連接，構建成符合讀框的GST-UBAP1融合基因。用含融合基因的pGEX-4T-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小量制備質(zhì)粒DNA，BamH I和Xhol I酶切鑒定是否含插入片段，含插入片段的陽性克隆質(zhì)粒DNA純化后用DNA自動測序儀測序。
單個陽性菌落接種入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培養(yǎng)液中，37℃，過夜培養(yǎng)。將400μl過夜培養(yǎng)物分別接種到40ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37。℃培養(yǎng)7h，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，培養(yǎng)2.5h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。室溫12000×g離心10min，去盡上清，置于冰上，重懸于預冷的600μl的PBS中。加入終濃度為100μg/ml的溶菌酶、10μg/ml DNase I，用液氮和溫水介導的反復凍融法破膜，11000rp離心10min，收集上清。重懸GSTMicroSpin純化柱中的樹脂，打開蓋及底蓋，置于一干凈的1.5ml的離心管中，735×g離心1min，棄液體，蓋上底蓋，柱中加入600μl的細菌裂解液。蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫5～10min后打開蓋及底蓋，置于一干凈的1.5ml的離心管中，735×g離心1min，再用400μl PBS用相同的方法洗滌2次。柱中加入200μl的谷胱苷肽洗脫液，蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫5～10min。735×g離心1min收集流出液。將收集的流出液用PBS透析，經(jīng)Bradford法進行蛋白質(zhì)定量后，備用。
將UBAP1蛋白質(zhì)溶液與等體積的福氏完全佐劑混勻，乳化后備用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗；兩周后，注射抗原，采取背部多點注射；一周后加強一次，重復2-3次后采血。用環(huán)狀沉淀實驗確定其效價，當效價達到要求后，即可處死動物，收集血清。免疫沉淀法或親和層析法分離獲得多抗。確定各批次抗體的質(zhì)量(效價、特異性)。
體外致敏法免疫B淋巴細胞(脾細胞懸液)，與骨髓瘤細胞融合，ELISA檢測、篩選陽性克隆，雜交瘤細胞克隆化、再檢測，腹腔注射BALB/c小鼠，收集動物血清或腹水，對單克隆抗體性質(zhì)進行鑒定，特異性免疫沉淀法或親和層析法分離純化單抗。確定各批次抗體的質(zhì)量(效價、特異性)。
收集正常與癌標本多例，利用制得的UBAP1抗體進行免疫組化檢測UBAP1的表達水平，確定UBAP1在正常鼻咽組織與鼻咽癌組織得表達差異，建立診斷標準，即制得用于鼻咽癌特異性診斷的UBAP1基因診斷試劑盒。可望用于鼻咽癌臨床常規(guī)檢測，尤其有利于其疑難病案的診斷。
作用和意義UBAP1是鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的重要的相關基因之一，可抑制鼻咽癌細胞的惡性表型。前期研究工作表明，UBAP1基因在在鼻咽癌中表達下調(diào)、缺失，UBAP1蛋白與鼻咽癌存在負相關性，檢測UBAP1蛋白表達缺失在診斷鼻咽癌方面具有較好的臨床價值，其特異度達82.9％。在此基礎上，研制出一個價廉物美的、能特異地診斷鼻咽癌的試劑盒。本試劑盒的研制將提高鼻咽癌的早期診斷、改善鼻咽癌的預后，提高鼻咽癌的生存率，這將是一個成本低，但具有潛伏巨大的市場的診斷試劑盒，將科研轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，從而帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。1.(1)據(jù)原核表達載體pGEX-4T-2的GST閱讀框架設計引物，使UBAP1基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致構建成符合閱讀框的GST-UBAP1融合基因。用含融合基因的pGEX-4T-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，鑒定含插入片段的陽性克隆質(zhì)粒。(2)單個陽性菌落接種入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培養(yǎng)液中，37℃，過夜培養(yǎng)。將400μl過夜培養(yǎng)物分別接種到40ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培養(yǎng)7h，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，培養(yǎng)2.5h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。室溫12000×g離心10min，去盡上清，置于冰上，重懸于預冷的600μl的PBS中。加入終濃度為100μg/ml的溶菌酶、10μg/mlDNase I，用液氮和溫水介導的反復凍融法破膜，11000rp離心10min，收集上清。(3)重懸GST MicroSpin純化柱中的樹脂，打開蓋及底蓋，置于一干凈的1.5ml的離心管中，735×g離心1min，棄液體，蓋上底蓋，柱中加入600μl的細菌裂解液。蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫5-10min后打開蓋及底蓋，置于一干凈的1.5ml的離心管中，735×g離心1min，再用400μl PBS用相同的方法洗滌2次。柱中加入200μl的谷胱苷肽洗脫液，蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫5～10min。735×g離心1min收集流出液。將收集的流出液用PBS透析，經(jīng)Bradford法進行蛋白質(zhì)定量后，備用。(4)抗UBAP1多抗的制備將UBAP1蛋白質(zhì)溶液與等體積的福氏完全佐劑混勻，乳化后備用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗；兩周后，注射抗原，采取背部多點注射；一周后加強一次，重復2-3次后采血。用環(huán)狀沉淀實驗確定其效價，當效價達到要求后，即可處死動物，收集血清。免疫沉淀法或親和層析法分離獲得多抗，確定各批次抗體的質(zhì)量(效價、及特異性)。(5)抗UBAP1單抗的制備體外致敏法免疫B淋巴細胞(脾細胞懸液)，與骨髓瘤細胞融合，ELISA檢測、篩選陽性克隆，雜交瘤細胞克隆化、再檢測，腹腔注射BALB/c小鼠，收集動物血清或腹水，對單克隆抗體性質(zhì)進行鑒定，特異性免疫沉淀法或親和層析法分離純化單抗，確定各批次抗體的質(zhì)量(效價、及特異性)。(6)鼻咽癌的診斷收集正常與癌標本多例，利用制得的UBAP1抗體進行免疫組化檢測UBAP1的表達水平，確定UBAP1在正常鼻咽組織與鼻咽癌組織得表達差異，建立診斷標準，即制得用于鼻咽癌特異性診斷的UBAP1基因診斷試劑盒。
權利要求
1.一種鼻咽癌相關基因UBAP1編碼的蛋白的純化，采用多聚酶鏈式反應方法克隆UBAP1基因蛋白編碼序列，構建該基因的融合表達質(zhì)粒，導入大腸桿菌JM109，IPTG誘導其在大腸桿菌中的表達，用GST融合蛋白純化試劑盒純化融合蛋白，本發(fā)明據(jù)原核表達載體pGEX-4T-2的GST閱讀框架設計引物，使UBAP1基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致；其特征在于以含UBAP1基因的質(zhì)粒為模板(0.1μg)，加入上述引物各10pmol進行擴增，回收PCR產(chǎn)物條帶；用BamH I、Xhol I分別雙酶切PCR回收產(chǎn)物及pGEX-4T-2載體，產(chǎn)生匹配的粘末端。小膠回收試劑回收線性的1.5kb的載體，UBAP1編碼區(qū)片段。將pGEX-4T-2載體與UBAP1基因連接，構建成符合讀框的GST-UBAP1融合基因。用含融合基因的pGEX-4T-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小量制備質(zhì)粒DNA，BamH I和Xhol I酶切鑒定是否含插入片段，含插入片段的陽性克隆質(zhì)粒DNA純化后用DNA自動測序儀測序。
2.根據(jù)權利要求1所述UBAP1編碼蛋白的多抗體的制備方法，其特征在于用谷胱甘肽親和層析系統(tǒng)純化獲得UBAP1融合蛋白；兔右足后趾注射30mg卡介苗；兩周后，注射抗原；采取背部多點注射；一周后加強一次，重復2上次后采血。確定其效價，當效價達到要求后，收集血清。
3.根據(jù)權利要求1所述UBAP1編碼蛋白的的單抗體的制備方法，其特征在于用谷胱甘肽親和層析系統(tǒng)純化獲得UBAP1融合蛋白，免疫小鼠后收集腹腔巨噬細胞及小鼠的脾細胞，與骨髓瘤細胞融合，篩選陽性克隆，大量培養(yǎng)，可收集抗體，也可按種小鼠后，收集其血清或腹水。
全文摘要
一種鼻咽癌相關基因UBAP1編碼蛋白的純化及其抗體的制備，以獲得用于鼻咽癌特異性診斷的UBAP1基因診斷試劑盒，屬于蛋白質(zhì)工程領域。本發(fā)明采用多聚酶鏈式反應(PCR)方法克隆UBAP1基因蛋白編碼序列，構建該基因的融合表達質(zhì)粒，導入BL21的大腸桿菌中，IPTG誘導其在大腸桿菌中的表達，采用谷胱甘肽親和層析系統(tǒng)純化融合蛋白，采用多點注射法制備兔多抗，骨髓瘤細胞融合法制備小鼠來源性的抗UBAP1單抗，進而建立檢測UBAP1表達水平的免疫組化法以特異地診斷鼻咽癌。
文檔編號C12N15/62GK1908004SQ20051003195
公開日2007年2月7日 申請日期2005年8月1日 優(yōu)先權日2005年8月1日
發(fā)明者李桂源, 肖炳燚, 曾朝陽, 范松青, 熊煒, 李小玲, 沈守榮, 周鳴, 李偉芳 申請人:中南大學腫瘤研究所