本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種篩選高二羥基兒茶素茶樹(shù)的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記及其應(yīng)用、應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：兒茶素類（catechins）是茶樹(shù)茶類黃酮（flavonoids）的主體成分，占綠茶干重的8-26%(Chen&Zhou,2005)，成茶的幾乎所有特性如滋味、湯色和香氣等都直接或間接與兒茶素有關(guān)（Wangetal.,2000）。兒茶素具有抗氧化、抗誘變、抗癌、抗心血管疾病、紫外線輻射保護(hù)作用、抗糖尿病、抗菌消炎、減肥和帕金森病的治療等作用（夏濤和高麗萍,2009），屬于黃烷-3-醇類化合。兒茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，根據(jù)兒茶素B環(huán)的羥基數(shù)目、C環(huán)上2,3位同分異構(gòu)體、C環(huán)上3位是否連接沒(méi)食子酸等可以劃分為若干種組分。根據(jù)兒茶素B環(huán)的羥基數(shù)目，兒茶素主要可以分為B環(huán)雙羥基和三羥基兒茶素，其中表兒茶素(EC)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)屬于B環(huán)二羥基兒茶素，而表沒(méi)食子兒茶素(EGC)和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)屬于B環(huán)三羥基兒茶素。類黃酮3′,5′-羥化酶(flavonoid3′,5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H)是茶樹(shù)黃烷-3-醇合成中的重要酶類。F3′5′H屬于CYP75A亞家族，可以分別催化黃酮、黃烷酮、二氫黃酮醇和黃酮醇轉(zhuǎn)化為3′,4′,5′三羥基化產(chǎn)物，是目前已知的細(xì)胞色素P450家族中催化B-環(huán)5′羥基化反應(yīng)的唯一酶系。在紅茶發(fā)酵過(guò)程中，每個(gè)茶黃素分子的形成需要1個(gè)二羥基兒茶素和1個(gè)三羥基兒茶素，因此含有等濃度的二羥基兒茶素和三羥基兒茶素的鮮葉原料最有利于形成高品質(zhì)紅茶。但專利申請(qǐng)人在2010年和2011年對(duì)403份茶樹(shù)資源兒茶素組分進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，發(fā)現(xiàn)與肯尼亞等主產(chǎn)紅茶國(guó)家相比，我國(guó)不乏高兒茶素資源，但EGCG占兒茶素總量的比例很高，平均為59.3–61.3%（Jinetal.,2014），遠(yuǎn)高于肯尼亞（所有品種都在32%以下）（Owuor&Obanda,2007），而二羥基兒茶素ECG和EC含量較低。因此，今后我國(guó)茶樹(shù)品種的改良，特別是紅茶的品種選育，需要篩選和利用高二羥基兒茶素的茶樹(shù)資源，進(jìn)而培育高品質(zhì)的紅茶品種。迄今為止，國(guó)內(nèi)外茶葉兒茶素含量鑒定大都采取生化測(cè)定方法。該方法需要一定數(shù)量茶樹(shù)葉片，鑒定的植株需要長(zhǎng)到3-4年后才能鑒定，耗費(fèi)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，效率低下。此外，鑒定植株的兒茶素含量受栽培環(huán)境和茶樹(shù)樹(shù)齡影響很大，需要多年、多點(diǎn)鑒定才能做到精準(zhǔn)評(píng)價(jià)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)被廣泛應(yīng)用于分子育種中，由于其不受環(huán)境和育種世代的影響，可以進(jìn)行早期選擇和預(yù)測(cè)，大大縮短了茶樹(shù)育種年限。功能標(biāo)記是一類基于基因特定序列開(kāi)發(fā)的標(biāo)記，與目標(biāo)基因共分離，大大提高了選擇的準(zhǔn)確性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種篩選高二羥基兒茶素茶樹(shù)的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記及其應(yīng)用、應(yīng)用方法的技術(shù)方案。所述的一種篩選高二羥基兒茶素茶樹(shù)的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記，其特征在于該功能標(biāo)記的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物如SEQIDNo.2所示。所述的一種篩選高二羥基兒茶素茶樹(shù)的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記在篩選具有高二羥基兒茶素茶樹(shù)中的應(yīng)用，其特征在于該功能標(biāo)記的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物如SEQIDNo.2所示。所述的一種篩選高二羥基兒茶素茶樹(shù)的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記在篩選具有高二羥基兒茶素茶樹(shù)中的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟：利用功能標(biāo)記對(duì)各茶樹(shù)材料中的F3′5′H基因起始密碼子ATG下游676bp至下游871bp的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和瓊脂糖凝膠分析，如擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后顯示為196bp的片段則該茶樹(shù)確定為低二羥基兒茶素茶樹(shù)，如擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后顯示為176bp的片段則該茶樹(shù)確定為高二羥基兒茶素茶樹(shù)。所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增的體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系：32μLddH2O，2μLDNA，5μL10×PCRBuffer，4μL25mMMgCl2，5μL2MmdNTP，1μLKOD-Plus-Neo酶，10μM的上、下游引物各3μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min，然后進(jìn)行以下循環(huán)，94℃15sec，58℃25sec，68℃5sec，共35個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸2min；所述的酶切和瓊脂糖凝膠條件為：PCR產(chǎn)物10μL，內(nèi)切酶EcoRI10U，內(nèi)切酶緩沖液2μL，用ddH2O補(bǔ)齊至20μL酶切體系；酶切反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)，溫度為37℃，擴(kuò)增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖膠電泳分離。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：將本發(fā)明中的功能標(biāo)記運(yùn)用于分子標(biāo)記輔助選擇，能快速篩選出具有高二羥基兒茶素的茶樹(shù)植物材料，從而加快優(yōu)質(zhì)紅茶茶樹(shù)品種的育成步伐。本發(fā)明對(duì)利用分子標(biāo)記輔助選擇高二羥基兒茶素茶樹(shù)品種具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1是龍井43和鳳凰大茶樹(shù)類黃酮3′,5′-羥化酶基因F3′5′H的比對(duì)譜圖；圖1中：LJ43為龍井43，F(xiàn)FDCS為鳳凰大茶樹(shù)。圖2是龍井43和鳳凰大茶樹(shù)酶切條帶差異的比對(duì)譜圖；圖2中：M為Marker；1和2分別為龍井43的DNA用引物對(duì)1和2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶EcoRI酶切前后的條帶，3和4分別為鳳凰大茶樹(shù)的DNA用引物對(duì)1和2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶EcoRI酶切前后的條帶。圖3是用功能標(biāo)記dCAPS-F3′5′H對(duì)28份茶樹(shù)資源SNP848的基因型檢測(cè)結(jié)果；圖3中：M為Marker；1-10依次為福鼎大白茶、藤茶、白石牙茶、銀筍、福安大白茶、寧州厚葉種、江華甜茶、大陽(yáng)茶、水古茶和木里4號(hào)，PCR產(chǎn)物酶切后條帶大小為196bp，SNP848的基因型為AA；11-20依次為樂(lè)昌郎田苦茶、乳源柳坑1號(hào)、臺(tái)山白云茶、英紅1號(hào)、五嶺紅、樂(lè)昌尖葉白毛、羅定紅芽種、錫茶10號(hào)、大葉茶群體和紅河浪堤茶，PCR產(chǎn)物酶切后條帶大小為196bp和176bp，SNP848的基因型為AG；21-28依次為鳳凰大茶樹(shù)、師宗5號(hào)、鎮(zhèn)沅2號(hào)、昌寧4號(hào)、景谷老倉(cāng)群體、麻栗坡8號(hào)、云茶普蕊和云縣1號(hào)，PCR產(chǎn)物酶切后條帶大小為176bp，SNP848基因型為AG。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。下述實(shí)施例中所用的試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，可以從常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1F3′5′H等位基因差異序列的發(fā)現(xiàn)、引物對(duì)及功能標(biāo)記dCAPS-F3′5′H的開(kāi)發(fā)1.供試材料選擇龍井43和鳳凰大茶樹(shù)為研究材料。2.兒茶素含量測(cè)定采摘茶樹(shù)春季新梢的一芽二葉，采用120℃熱風(fēng)干燥5min及時(shí)固樣，75℃烘至足干低溫保存。待測(cè)定時(shí)用機(jī)械磨碎，過(guò)40目篩后低溫保存，備用。稱取0.2g樣品（精確到0.0001g），置于10mL離心管中。加入70℃預(yù)熱的70%甲醇溶液5mL，混勻后70℃水浴。水浴10min，中間揺勻2-3次。3,500r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液。重復(fù)步驟2-4，合并兩次收集的上清液，定容至10mL。移取2ml提取液置于容量瓶中，用穩(wěn)定液（5%的10mg/mLEDTA溶液、5%的10mg/mL抗壞血酸溶液、10%的乙腈）定容至10ml，混勻后用0.45μm的濾膜過(guò)濾。采用高壓液相色譜法（HPLC）進(jìn)行檢測(cè)，以外標(biāo)法對(duì)生物堿和兒茶素進(jìn)行定性和定量分析。液相色譜測(cè)定條件：C12色譜柱4.6mm×250mm(4μm，廣州菲羅門(mén))；流動(dòng)相A為0.5％甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，進(jìn)樣量10μL，梯度洗脫：流動(dòng)相B在16min內(nèi)由6.5％線性梯度變化到16％，第16min到20min由16％線性梯度變化到25％，保持5min，回到初始狀態(tài)，再平衡5min。測(cè)定結(jié)果表明，鳳凰大茶樹(shù)的三羥基兒茶素含量與龍井43相當(dāng)，但二羥基兒茶素含量卻是龍井43的2.4倍。表12份茶樹(shù)材料春茶兒茶素含量的差異（mg/g）材料名稱EGCECEGCGECG三羥基兒茶素（EGC+EGCG）二羥基兒茶素（EC+ECG）兒茶素總量龍井438.25.469.232.577.437.9115.3鳳凰大茶樹(shù)16.322.765.968.382.291.0173.23.基因組DNA的提取取1g新鮮嫩梢，加液氮研磨至粉末狀。將0.2g粉末置入1.5mL離心管，加700μLCTAB提取液，充分混勻后65℃下水浴1h，每20min揺勻一次。加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻后靜置2min。室溫下14,000g離心10min，取上清。加入等體積預(yù)冷的異丙醇，-20℃靜置1h。14,000g離心10min，棄上清。加入300μL高鹽溶液，65℃溫育30min至沉淀溶解。室溫下10,000g離心10min，取上清。加入1/10體積預(yù)冷的NaAc（pH5.2），2/3體積預(yù)冷的異丙醇，充分混合，-20℃放置30min。14,000g離心5min，棄上清。70%乙醇洗滌沉淀1次，無(wú)水乙醇洗滌一次。放在超凈工作臺(tái)上吹干30min，溶于200μL滅菌水中，-20℃保存。4.PCR測(cè)序及測(cè)序分析設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增各茶樹(shù)材料中的F3′5′H起始密碼子ATG上游54bp至下游891bp的DNA片段，引物由軟件Primer5.0設(shè)計(jì)，序列如下：上游引物（如SEQIDNo.3所示）：5′－ACCAAAACACTCAACCAGGT－3′，下游引物（如SEQIDNo.4所示）：5′－TGCCTTGATGTTGGTCGTGT－3′；PCR反應(yīng)體系：32μLddH2O，2μLDNA，5μL10×PCRBuffer，4μL25mMMgCl2，5μL2MmdNTP，1μLKOD-Plus-Neo酶，10μM的正、反向引物各3μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min，然后進(jìn)行以下循環(huán)，94℃15sec，5325sec，68℃30sec，共35個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察并切膠回收，連入載體、轉(zhuǎn)化，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。分析發(fā)現(xiàn)兩份材料間第一外顯子中有3個(gè)單核苷酸突變（SNP），其中僅SNP848為非同義突變（圖1）。5.功能標(biāo)記dCAPS-F3′5′H的開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增各茶樹(shù)材料中的F3′5′H基因起始密碼子ATG下游676bp至下游871bp的DNA片段，引物由利用dCAPSFinder2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）設(shè)計(jì)。在下游引物3′端引入1bp的錯(cuò)配，序列如下：上游引物（如SEQIDNo.1所示）：5′－GATTTCATACCATCGATTGCGT－3′，下游引物（如SEQIDNo.2所示）：5′－TGAGCTTCTCTTCACCAGGAATT－3′；利用所述的引物序列分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和瓊脂糖凝膠分析。PCR反應(yīng)體系：32μLddH2O，2μLDNA，5μL10×PCRBuffer，4μL25mMMgCl2，5μL2MmdNTP，1μLKOD-Plus-Neo酶，10μM的正、反向引物各3μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min，然后進(jìn)行以下循環(huán)，94℃15sec，58℃25sec，68℃5sec，共35個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸2min。酶切體系、時(shí)間、溫度和瓊脂糖凝膠電泳為：PCR產(chǎn)物10μL，內(nèi)切酶EcoRI10U，內(nèi)切酶緩沖液2μL，用ddH2O補(bǔ)齊至20μL；酶切反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)，溫度為37℃，擴(kuò)增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖膠電泳分離。分析發(fā)現(xiàn)，龍井43的PCR產(chǎn)物酶切后仍條帶大小仍為196bp，表明SNP848的基因型為AA，而鳳凰大茶樹(shù)酶切后產(chǎn)生了1條176bp的條帶，表明SNP848的基因型為GG（圖2）。利用該分子標(biāo)記可以鑒定茶樹(shù)資源F3′5′H基因SNP848的基因型，并可把含高二羥基兒茶素的茶樹(shù)材料篩選出來(lái)。實(shí)施例2功能標(biāo)記dCAPS-F3′5′H對(duì)茶樹(shù)資源的基因型分析1.供試材料本實(shí)驗(yàn)所研究的材料列于表2中，包括28份茶樹(shù)資源。表2本實(shí)驗(yàn)所研究的28份茶樹(shù)資源及其二羥基兒茶素含量2.功能標(biāo)記對(duì)不同茶樹(shù)資源F3′5′H基因SNP848的基因型檢測(cè)利用分子標(biāo)記dCAPS-F3′5′H對(duì)28份材料的標(biāo)記基因型分析。DNA提取、PCR擴(kuò)增體系、程序、酶切和瓊脂糖凝膠條件同實(shí)施例1。結(jié)果如圖3所示，其中在材料1—10的基因型為AA，材料11—20的基因型為AG，材料21—28的基因型為GG。3.28份茶樹(shù)材料兒茶素含量鑒定兒茶素鑒定方法高效液相色譜法同實(shí)施例1所述。28份材料中，基因型為AA的10份材料二羥基兒茶素含量為32.6±4.6mg/g，基因型為AG的10份材料二羥基兒茶素含量為42.0±8.9mg/g，基因型為GG的8份材料二羥基兒茶素含量為84.1±22.2mg/g。統(tǒng)計(jì)分析表明，GG基因型的材料二羥基兒茶素含量極顯著高于其它2種基因型的材料，dCAPS-F3′5′H可以作為鑒定和篩選高二羥基兒茶素茶樹(shù)材料的功能標(biāo)記。本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍。SEQUENCELISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所<120>篩選高二羥基兒茶素茶樹(shù)的類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記及其應(yīng)用、應(yīng)用方法<130>11<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1gatttcataccatcgattgcgt22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>2tgagcttctcttcaccaggaatt23<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3accaaaacactcaaccaggt20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4tgccttgatgttggtcgtgt20當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3