專利名稱：類黃酮的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從含有類黃酮苷和/或其接合物的原料中提取類黃酮苷元的方法。更具體地說，本發(fā)明提供了一種使用含水溶劑由植物物質(zhì)生產(chǎn)富集的類黃酮苷元的提取物的有效方法。
背景技術(shù)：
類黃酮是一類具有包括將其用作治療劑、抗菌劑和抗氧化劑在內(nèi)的廣泛應(yīng)用的植物化學(xué)物質(zhì)。它們能夠治療和/或預(yù)防一定范圍內(nèi)的醫(yī)學(xué)上的病癥和疾病，舉例來說包括諸如心臟病、阿爾茨海默病、癡呆和癌癥這樣的變性疾病。類黃酮的特征和特性充分公開在科學(xué)文獻(xiàn)中。
對’天然’植物化學(xué)藥物的需求正在逐漸增加且這種需求在世界人口的平均年齡穩(wěn)步增加的同時也在進(jìn)一步增加。此外，占這些人口中年齡較輕的部分為治療或預(yù)防醫(yī)學(xué)上的疾病而正在轉(zhuǎn)向選擇天然藥物。此外，對不含有機(jī)溶劑殘余物、特別是那些以工業(yè)化方式合成的殘余物這樣的物質(zhì)和對使用以對環(huán)境影響最低的方式生產(chǎn)的產(chǎn)品存在強(qiáng)烈的需求。整個社會也認(rèn)為使用對環(huán)境影響最低的可生物降解的物質(zhì)和方法具有很高的價值。
類黃酮是一小組植物多酚類、即由15個碳原子基礎(chǔ)骨架組成的三環(huán)結(jié)構(gòu)。植物類黃酮苷元(即不含連接的糖的類黃酮)以不同結(jié)構(gòu)形式出現(xiàn)。然而，所有結(jié)構(gòu)形式均在其母核上含有15個碳原子且它們按照C6-C3-C6構(gòu)象、即通過可以或不可以形成第三個環(huán)的3個碳單位連接的兩個芳香環(huán)排列。
類黃酮在飲食和藥物中的重要作用正在越來越得到重視。正是紅葡萄酒、綠茶、特級初榨橄欖油、大豆產(chǎn)品、水果和蔬菜、各種傳統(tǒng)的草藥藥茶和藥酒中的類黃酮至少部分導(dǎo)致因消耗它們而產(chǎn)生的有益作用。
價值得到充分確立的一組類黃酮是異黃酮類。異黃酮類具有一定的特征結(jié)構(gòu)并可形成特定的異構(gòu)型類黃酮。異黃酮類的有益作用是廣泛的，包括提示它們是導(dǎo)致東亞區(qū)一定人群中乳腺癌和前列腺(prostrate)癌發(fā)生率降低的傳統(tǒng)東方飲食中的要素。
盡管異黃酮類出現(xiàn)在其它科的植物中，但是它們絕大部分與豆科植物、特別是與豆科的蝶形花亞科極為相關(guān)，所述的蝶形花亞科包括許多眾所周知的諸如三葉草、豆類植物(pulses-beans)、大豆和豌豆這樣的飼料作物和諸如荊豆和染料木這樣的灌木。
異黃酮類除對人和動物健康有益外，近來已經(jīng)證實它們在動物飼料工業(yè)上的應(yīng)用，其中給予補(bǔ)充了異黃酮類的飼料的豬表現(xiàn)出每日平均體重獲得增加、但攝入的飼料并沒有增加。豬的屠體肌肉的百分比也得到提高且每日估計的肌肉產(chǎn)生量較高。
盡管在一個完美的世界中我們都希望從精細(xì)選擇的食品、膳食和飲料中獲得足夠的這些化合物，但實際上尤其是對城市的勞動者來說，這通常恰恰是不可能的。因此，對可以便利和有效地用作飲食補(bǔ)充劑或治療劑的富含類黃酮的制品存在需要和需求。
用于提取類黃酮的現(xiàn)有技術(shù)一般存在下列缺點中的一個或多個(i)它們涉及使用毒性試劑；(ii)它們需要過度的多次提?。?iii)它們涉及以糖基化形式(類黃酮苷)提取類黃酮；(iv)它們過度消耗時間；和(v)它們涉及使用大量可燃性的溶劑。
本發(fā)明尋求克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷并提供一種與現(xiàn)有技術(shù)方法相比以相對高的產(chǎn)率分離類黃酮的簡單而便利的方法。
本發(fā)明的公開內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種由含有合適的類黃酮苷和/或其接合物的原料生產(chǎn)富集的類黃酮苷元的提取物的方法，該方法包括下列步驟
(i)以酶促方式將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使可溶性類黃酮苷元變得相對不溶并形成含有它們的提取物。
就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語″類黃酮″是具有下列一般通式的任意植物多酚或其二聚體、三聚體或聚合物
用于本發(fā)明目的的特定類黃酮包括查耳酮類(chacones)；二氫查耳酮類(dihydrochalones)；噢哢類；黃烷酮類；黃酮類；新類黃酮；兒茶素類；黃酮醇類；二氫黃酮醇類；原花色素類；黃烷類；黃烷-3-醇類和雙類黃酮；它們的各種甲氧基化和其它修飾形式，諸如接合物、諸如酰基接合物，而更具體地說，用于本發(fā)明目的的特定類黃酮包括金合歡素、芹菜配基、貝加因、柯因、金圣草黃素、橡精、dihydrobinetin、二氫莰非醇、地奧亭、兒茶酸、表兒茶酸、圣草酚、非瑟酮、黃顏木素、高良姜精、橙皮素、異鼠季亭、莰非醇、藤黃菌素/木犀草素、桑色素、楊梅黃酮、柚配基、木蝴蝶素A、ponciretin、六羥黃酮、五羥黃酮、刺槐亭、黃芩配基、水飛薊素部分、水飛薊素、異水飛薊素、次水飛薊素、黃芩新素II、福桔黃素、沃貢寧；以及異黃酮類，諸如染料木堿、黃豆苷原、7-羥-4’-甲氧異黃酮、鷹嘴豆素A、baptenin和紅車軸草素，它們具有下列一般結(jié)構(gòu)通式
這些原料可以改變且優(yōu)選包括諸如含有類黃酮苷和/或其接合物的植物或植物部位或其制備物這樣的植物原料。植物原料特別包括葉；花瓣；萼片；花；葉柄；枝條；根；莖；種子；豆莢；塊莖；樹皮；形成層；木材；倍子；果實；蔬菜；草藥；細(xì)菌；藻類；蕨類植物；樹汁；樹脂；外皮，諸如葡萄、蘋果、洋蔥和鱷梨的外皮；皮，包括柑桔屬的皮；果實外皮；諸如蘋果的蘋果醬；果酒的果渣；谷物外皮；稻草；干草；來自橄欖、油菜籽或canola的含油種子餅；或其它含油作物的提取物。原料還可以是諸如修飾的細(xì)菌、藻類或真菌和GM作物這樣的遺傳修飾(遺傳工程)的生物體及其部位和產(chǎn)物。
將一類特定的原料浸泡并使諸如豆科植物種子這樣發(fā)芽的種子萌發(fā)。在豆科植物種子中，除大豆外，在干燥的種子中基本上不含異黃酮，但是發(fā)現(xiàn)當(dāng)它們從浸泡的狀態(tài)發(fā)育成籽苗時，出現(xiàn)一定含量的的異黃酮類且該提取物中異黃酮的含量和基于干燥種子重量的產(chǎn)率均顯著提高。這種情況可以持續(xù)至葉的籽苗出現(xiàn)和首批葉發(fā)生為止。
此外，種子的發(fā)育和類黃酮的合成可能受到溫度的影響且優(yōu)選使種子的發(fā)育和由此異黃酮類的產(chǎn)生在約23-28℃下發(fā)生。可以理解的是一般來說，就種子的幼苗而言，產(chǎn)率在較高的溫度(達(dá)上限)下則較高，而就同齡種子而言，產(chǎn)率在較低的溫度下則較低，這是基于對發(fā)芽時溫度作用的充分認(rèn)識的結(jié)果。
申請人還發(fā)現(xiàn)可以將預(yù)萌發(fā)的大豆用作原料以生產(chǎn)充分富集的類黃酮的產(chǎn)物。在這方面，大豆在干燥種子中含有大量的異黃酮苷類。然而，可以進(jìn)行浸泡和發(fā)芽以便產(chǎn)生將所述苷類轉(zhuǎn)化成苷元類的酶。在這方面，優(yōu)選約在室溫(25℃)下將大豆浸泡至少1天(onday)以便活化內(nèi)源性酶且由此提高按照本發(fā)明獲得的提取物中異黃酮的含量。產(chǎn)生苷元類必不可少的較高含量的酶可以滿足種皮下根的發(fā)育。此外，提取物中開始出現(xiàn)較佳含量的異黃酮類和每粒種子的產(chǎn)量均依賴于溫度。
提取這類種子和籽苗可以產(chǎn)生可以描述為50-60％或50-60％以上蛋白質(zhì)含量的富集(異)黃酮類化合物的蛋白質(zhì)提取物?？梢酝ㄟ^洗滌掉水溶性碳水化合物等以提高蛋白質(zhì)的含量而將這些富集的蛋白質(zhì)濃縮物轉(zhuǎn)化成(異)黃酮蛋白質(zhì)分離物?？梢酝ㄟ^增加破碎的發(fā)芽種子和籽苗的細(xì)度來進(jìn)一步提高產(chǎn)量，這種情況在原料特別堅固時尤其如此。
用于本發(fā)明目的的植物包括含有類黃酮苷和/或其接合物的任意植物，不過，特別優(yōu)選的植物是豆科植物，諸如大豆、鷹嘴豆(鷹嘴豆屬，諸如鷹嘴豆)、白草香木犀(白草香木樨)、紫花苜?；蜍俎?紫苜蓿)或車軸草屬的種類。可以理解的是來自不同植物的物質(zhì)的組合可以構(gòu)成所述的原料。
優(yōu)選類黃酮苷和/或其接合物的轉(zhuǎn)化是完全的。然而，更為可能且更為實際的是原料中部分類黃酮苷和/或其接合物沒有被轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元類。顯然轉(zhuǎn)化程度越高，則從該提取方法中回收的類黃酮苷元類越多。在任何情況下，用包括該方法所需產(chǎn)出量在內(nèi)的操作參數(shù)來測定本發(fā)明方法中獲得的轉(zhuǎn)化率。
可以改變用于轉(zhuǎn)化類黃酮苷的酶且這些酶包括具有水解苷鍵的能力的酶，諸如來自包括糖苷酶、β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、果膠酶、桔皮苷酶、花色素酶、鼠李淀粉酶(rhamnodiastase)、柚苷酶或高峰淀粉酶的組。
其它酶包括那些諸如異黃酮7-O-苷-6″丙二酸丙二酰酯酶這樣適合于水解葡萄糖(糖)部分與接合部分(例如?；?之間的類黃酮苷接合物上的鍵的酶或可能在合適的植物中發(fā)現(xiàn)的等同的酶。
這類酶可以通過商購獲得或來自本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的來源，包括動物，諸如來自豬的肝臟；植物，諸如車軸草屬的種類、鷹嘴豆屬的種類、向日葵屬的種類、草木樨屬的種類、苜蓿屬的種類、茶的種類、李屬的種類(例如苦味扁桃、扁桃、歐洲甜櫻桃、杏)、歐鼠李和凍綠；真菌，諸如曲霉屬的種類，包括黑色曲霉或米曲酶、紅色糖多孢菌、刺槐和根瘤菌屬的種類；諸如酒明串珠菌、啤酒片球菌和植物乳芽孢桿菌這樣的細(xì)菌或諸如類細(xì)菌種類這樣的腸內(nèi)細(xì)菌；以及酵母，諸如啤酒糖酵母、異常漢遜氏酵母、細(xì)尖克勒克氏酵母和鐵紅假絲酵母(Candidapulcherimma)。
本發(fā)明還擴(kuò)展至諸如那些獲自遺傳修飾(遺傳工程)生物體的遺傳工程的酶的用途。在這方面，應(yīng)用遺傳操作，可以使用可另外產(chǎn)生不足量的酶或具有不充分活性的酶的植物或微生物。此外，還可以將遺傳工程用于改進(jìn)酶的特征、諸如其活性。所有這類遺傳工程產(chǎn)物能夠用于本發(fā)明的方法。
隨著具體情況的不同，將類黃酮苷或其接合物以酶促方式轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元這一過程可能涉及使用多種酶，可以將這些酶同時或依次使用以便獲得必需的轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定至少基于對方法和原料的需要的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的性質(zhì)。
在某些情況中，將類黃酮苷和/或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元這一過程可能需要用順序或同時使用的多種酶進(jìn)行處理。在這方面，類黃酮苷和/或其接合物可能需要在轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元前轉(zhuǎn)化一種中間體形式的化合物或多種化合物。對轉(zhuǎn)化成中間體和所用特定酶的需求對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如，首先必須使用α鼠李糖苷酶(alpha-rhamnosidase)將narangin(一種苷)轉(zhuǎn)化成江戶櫻花苷(中間體苷)且然后通過使用β糖苷酶水解葡萄糖部分而轉(zhuǎn)化成其類黃酮苷元形式柚配基(naringinin)。
在酶轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元前，還可以預(yù)處理類黃酮苷以便除去一個或多個糖殘基或其部分。在這方面，可以處理類黃酮苷以便水解某些糖殘基或諸如糖單位這樣的其部分，從而產(chǎn)生部分轉(zhuǎn)化的類黃酮苷。在這種選擇中，可以通過使用強(qiáng)酸水解而從在類黃酮苷上至少保留一個糖殘基的類黃酮苷上除去一個或多個糖殘基。
可能需要調(diào)節(jié)其它變化因素以便從給出的提取方法且更具體地說是酶轉(zhuǎn)化法中獲得最佳性能?？刂七@些變化因素和產(chǎn)生最佳轉(zhuǎn)化的特定組合條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這類變化因素包括溫度、含濕量和添加其它溶質(zhì)或酶穩(wěn)定劑。
當(dāng)原料是具有相對完整的含有類黃酮苷和/或其接合物和酶的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的植物物質(zhì)時，一般將類黃酮苷和/或其接合物由適合于將其轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元的酶進(jìn)行胞內(nèi)分離。在這種情況中，可以通過至少破壞植物物質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)而使所述酶與類黃酮苷和/或其接合物接觸。
因此，本發(fā)明還提供了一種由含有類黃酮苷和/或其接合物的植物物質(zhì)生產(chǎn)富集的類黃酮苷元的提取物的方法，該方法包括下列步驟
(i)破壞植物物質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以便使其中含有的類黃酮苷或其接合物與其中適合于將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元的至少一種酶接觸且由此將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并分離出不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元相對不溶并分離類黃酮苷元。
至少破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的處理方法包括使細(xì)胞破碎的處理方法且是可變和對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。它們包括諸如研磨、壓碎、搗擊或滾壓、冷凍和融化這樣的處理方法；諸如半纖維素酶或纖維素酶這樣的酶處理方法；超聲處理方法；干燥法；接觸紫外線；使用包括擠壓和密封分批施壓在內(nèi)的減壓或升壓的處理方法；微生物消化或青貯；接觸氧化性和其它化學(xué)物質(zhì)；洗滌劑處理或上述方法的任意組合。
可以理解的是在進(jìn)一步加工前應(yīng)將破壞方法中使用的防礙其它處理步驟的任何成分從反應(yīng)混合物中除去。
另外可以理解的是可以將按照本發(fā)明方法生產(chǎn)的提取物進(jìn)行進(jìn)一步處理以便進(jìn)一步提高所關(guān)注的類黃酮的濃度。在這方面，可以實施諸如醇浸提這樣的其它純化方案。在這方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過對本發(fā)明的提取物進(jìn)行醇(例如甲醇、乙醇或含水醇)浸提并蒸發(fā)溶劑可以獲得約2-6倍顯著富集濃度的類黃酮苷元類。
如上所述，原料中可以包含酶和類黃酮苷和/或其接合物。然而，該原料可以包括類黃酮苷和/或其接合物以及不足量酶乃至不含酶以便進(jìn)行必要的轉(zhuǎn)化。在這類情況中，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括添加適合于將類黃酮苷和/或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元的酶的步驟。
因此，本發(fā)明還提供了一種從含有類黃酮和/或其接合物的原料中提取類黃酮苷元的方法，該方法包括下列步驟
(i)通過向原料中添加適合于將類黃酮苷和/或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元的酶而將類黃酮苷和/或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并分離出不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元相對不溶并從溶液中分離類黃酮苷元。
一旦產(chǎn)生了類黃酮苷元，就必須防止它發(fā)生聚合或其它不需要的修飾。例如可能需要限制或除去多酚氧化酶的活性以便防止類黃酮苷元的聚合。這一結(jié)果可以通過例如加熱這樣的物理方式或例如二氧化硫、焦亞硫酸鈉、氫氰酸、一氧化碳、蛋白質(zhì)消化酶或酶類這樣的化學(xué)方式和/或通過使用例如通過提供二氧化碳?xì)怏w或氮氣這樣的缺氧方法或通過真空抽吸而實現(xiàn)。在后一種手段中，將缺氧維持至通?？梢詫⒍喾友趸富钚猿志孟蛄硪环矫嬷钡綇暮卸喾友趸傅囊后w或固體中分離出類黃酮苷元為止。
調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶。因此，可以將pH調(diào)節(jié)到至少約為8.5且更優(yōu)選至少為9.6、11或12或另一方面調(diào)節(jié)至約為9.6-12。然而，所需特定水平的pH調(diào)節(jié)至少隨所提取的特定類黃酮苷元的不同而改變。
本發(fā)明方法中堿提取結(jié)果的效率是令人意外的，正如提取產(chǎn)率隨pH的升高超過異黃酮類實際上100％(99.9％)電離的pH值(當(dāng)pH＝pKa+3個pH單位或約為10.2時)而增加一樣，在該pH值下，異黃酮苷元類完全是水溶性的。提取持續(xù)增加，甚至預(yù)計在pH12-12.5下導(dǎo)致異黃酮類分解的pH’s下。
此外，預(yù)計產(chǎn)率在pH升至得到完全電離的pH以上(pKa+3)時不會提高，反而會因堿催化氧化的增加率而導(dǎo)致降低。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)染料木黃酮和鷹嘴豆素A具有約7.2的pKa’s。這一結(jié)果與改變酸沉淀的pH所觀察到的作用相似，一旦染料木黃酮和鷹嘴豆素A異黃酮苷元類完全有效地(99+％)不帶電荷，則在按質(zhì)子離子濃度計的1000倍變化中也沒有觀察到一次產(chǎn)率的改變。
可以使用對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的大量方式中的任意一種來調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶，包括添加諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣這樣的堿、可以是液體或固體形式的其它堿金屬和堿土金屬氫氧化物或乙酸鈉或氨氣。改變pH以確保足夠比例的類黃酮苷元溶解?？梢赃M(jìn)一步處理剩余的不溶性植物物質(zhì)以便將類黃酮苷元更完全地提取入液相。這類進(jìn)一步的處理方法包括洗滌、沖洗和滲濾不溶性植物物質(zhì)。
一旦類黃酮苷元充分溶解，則可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員用于分離可溶性和不溶性部分顯而易見的常規(guī)方法中的任意一種或它們的組合來除去不溶性部分。這類方法包括沉降、過濾和離心。可以理解的是為了本發(fā)明的目的，術(shù)語″分離出不溶性部分″及其顯而易見的變化形式包括除去部分不溶性部分且更具體地說包括除去絕大部分可以通過離心或其它顯而易見的方式獲得的不溶性部分。
優(yōu)選通過通入最小反應(yīng)體積的氣體來進(jìn)行堿提取以避免類黃酮分解。在這方面，已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)在堿提取過程中通入最小反應(yīng)體積的氣體顯著提高了產(chǎn)率。在堿提取過程中可以以不同方式將通入的氣體減小到最低限度，包括但不限于避免攪拌樣品、噴射、劇烈攪拌、其它形式的氣體與液體樣品的混合。另一方面，為防止通氣，堿提取可以在氧減少或無氧環(huán)境中進(jìn)行、諸如在氮氣或氬氣環(huán)境中或在將吸附氧氣的化合物導(dǎo)入堿溶液的條件下進(jìn)行。
然后調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶。因此，可以將pH調(diào)節(jié)至約為2或3或2-6或更優(yōu)選約為3-5.6，諸如3.5、3.6、5.3或5.6。然而，所需特定水平的pH調(diào)節(jié)至少隨所提取的特定類黃酮苷元的不同而改變?？梢砸罁?jù)經(jīng)驗從事測定指定類黃酮苷元的最佳pH的試驗的本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？梢源_定用于本方法該階段的最佳pH。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的許多方式中的任意一種來調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元不溶，包括添加諸如可以是液體、固體或氣體形式的鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、乳酸、酒石酸、檸檬酸、乙酸或丙酸這樣的酸。改變pH以確保足夠比例的類黃酮苷元不溶。如果需要，可以通過攪拌來進(jìn)行pH調(diào)節(jié)以便確保反應(yīng)物充分混合且絕大部分類黃酮苷元類實際上能夠完全酸化?？梢蕴幚砜扇苄圆糠忠员氵M(jìn)一步使類黃酮苷元更完全地轉(zhuǎn)入不溶性相。
一旦將類黃酮苷元充分分離為混懸液或沉淀，則可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員用于分離可溶性和不溶性部分的常規(guī)方法中的任意一種或它們的組合來除去不溶性部分，這類方法包括沉降、過濾、結(jié)晶、共結(jié)晶和離心。還可以加入鹽以便輔助分離并可以根據(jù)需要通過蒸發(fā)或部分冷凍來濃縮該反應(yīng)混合物。還可以輔助分離以便降低溫度或冷凍反應(yīng)體積。
還可以通過其它常規(guī)技術(shù)進(jìn)行分離，諸如使用有機(jī)溶劑、選擇性膜過濾和包括薄層層析、液相層析或高效液相層析在內(nèi)的層析法。還可以通過將反應(yīng)混合物酸化的含水制備物或含水有機(jī)制備物吸附在活性碳上來純化或濃縮它們。
用于純化的其它手段在于將來自酸提取步驟的沉淀溶于適宜溶劑且然后改變該溶液而使一種或多種非類黃酮成分變得不溶并沉淀出來，用于該方法的合適的步驟是將所述沉淀溶于乙醇且然后通過添加丙酮來改變，接著預(yù)計任意共溶的糖類、皂草苷類和蛋白質(zhì)會或多或少沉淀至一定程度。可以蒸發(fā)剩余的溶液并回收濃縮的提取物或可以進(jìn)一步處理該溶液。
將植物物質(zhì)用作提取原料的一種可能出現(xiàn)的復(fù)雜情況是在提取過程中不需要的植物蛋白共沉淀。在這方面，在提取過程中為分離類黃酮苷元而控制的各種條件可能不足以使類黃酮苷元與其它植物蛋白分離。這一問題可以通過用于原料或提取工藝過程中的其它處理步驟來解決以便至少減少與共沉淀相關(guān)的難題。
因此，本發(fā)明可以進(jìn)一步包括一種處理方法，其中對不需要的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾以便它們不會過度干擾對本發(fā)明方法中類黃酮苷元的提取。這類處理方法包括可實現(xiàn)下列目的的那些方法(i)在堿化步驟后可溶性相中不需要的蛋白質(zhì)的濃度降低和(ii)酸化步驟后可溶性相中不需要蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)物質(zhì)的濃度增加。
所述的處理方法可以改變且包括那些對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言屬于顯而易見的方法。本發(fā)明包括的處理方法包括加熱處理、例如使用單寧或膨潤土進(jìn)行的化學(xué)處理、酶處理或由堿性pH調(diào)節(jié)或由確保不需要的蛋白質(zhì)是可以從有意義的可溶性類黃酮苷元中分離出的不溶性形式的堿提取步驟而獲得反應(yīng)混合物前使植物物質(zhì)放電。其它手段是使由堿提取步驟產(chǎn)生的反應(yīng)混合物通過裝填了吸附蛋白質(zhì)的物質(zhì)的柱。
另一方面，可以用諸如可使不需要的蛋白質(zhì)在酸性介質(zhì)中轉(zhuǎn)化成可溶形式的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶這樣的蛋白酶處理由酸提取步驟產(chǎn)生的反應(yīng)混合物。還可以使用大小排阻層析，包括可以使用凝膠過濾或大小排阻濾膜，這種濾膜帶有足夠小以使類黃酮分子通過而不允許較大的蛋白質(zhì)分子通過的孔。還可以使用其它生物方式，包括用消化或吸附微生物的蛋白質(zhì)發(fā)酵。青貯粉碎的原料也可能有助于該提取方案。
如上所述，本發(fā)明的方法提供了相對高產(chǎn)率的諸如異黃酮類這樣的類黃酮。例如，產(chǎn)率可能至少高于25％使用相同工藝但使用有機(jī)溶劑提取的方法所得到的產(chǎn)率，更優(yōu)選至少高于50％且甚至更優(yōu)選至少高于67％的公開產(chǎn)率。
實施例
除非另有說明(i)使用與用于提取的溶液相同pH的溶液將來自下文實施例中堿提取的布濾液沖洗2次；(ii)通過通入最小量的氣體并按照下列一般方法進(jìn)行下文實施例中的全部堿提取(a)用較大量的水使植物原料分散、通常至少2次-4次以上；(b)開始向溶液-混懸液中加入少量體積的濃氫氧化鈉溶液(約5M)；(c)隨后當(dāng)接近所選擇的pH值時，逐滴加入氫氧化鈉溶液；(d)使氫氧化鈉與所述的溶液-混懸液高效混合(通入最少量的氣體)且時間允許該混合物達(dá)到穩(wěn)定的pH值；(d)在達(dá)到最終所需的pH后，再經(jīng)過2-5分鐘后檢驗數(shù)值并在所述數(shù)值已經(jīng)發(fā)生偏移的情況下調(diào)節(jié)pH；和(iii)使用薄層層析或通過UV光譜法來測定實施例中所涉及的所有類黃酮的產(chǎn)量。
實施例1A
在10月上旬采集在1999年冬季生長在西澳洲西南的地下三葉草(TrifoliumsubterraneumL.)(長)莖上的約1kg葉樣品，將其儲存在約20℃下1天并在5℃儲存10天。將這種儲存的約0.5kg葉材料切碎并保存在塑料袋中。
將25g三葉草葉與50g酸洗滌的濕白沙混合并用研缽和研杵研磨3.5分鐘。將研磨的葉和沙物質(zhì)轉(zhuǎn)入密封的塑料袋中10分鐘并在約62℃下進(jìn)行熱處理20分鐘。
第2天將該熱處理的物質(zhì)轉(zhuǎn)入燒杯并加入200mL去離子水，在攪拌的同時從滴管中加入5M氫氧化鈉以便使該混懸液的pH升至pH9.6。通過使該混懸液過3層細(xì)紗布除去粗纖維物質(zhì)，通過以2,000rpm離心2分鐘而除去通過紗布的淤渣樣物質(zhì)。
然后將所分離溶液的pH調(diào)節(jié)至5.3。將pH5.3的該混合物保持在約1℃下48小時且然后通過部分冷凍該溶液并分離形成的冰而濃縮且由此的最終體積約為100mL，將剩余的溶液和沉淀通過濾紙過濾。
在40℃下干燥濾紙和保留的沉淀物并按照非研磨形式的C方法的改進(jìn)方法來測定異黃酮的含量。M.Francis和A.J.Millington，(“地下三葉草異黃酮含量的變種差異其估計值的測定通過一種顯微技術(shù)來進(jìn)行”(’Varietalvariationintheisoflavonecontentofsubterraneancloveritsestimationbyamicrotechnique’)，C.M.Francis和A.J.Millington，《澳大利亞農(nóng)業(yè)研究雜志》(AustralianJournalofAgriculturalResearch)，第16卷，第557-64頁，1965)。
通過測定4張濾紙的重量以便計算出平均重量并從測定的實驗用濾紙及其保留的物質(zhì)的重量中扣除該平均重量來計算濾紙上保留的該物質(zhì)的重量。
結(jié)果
濾紙上保留的物質(zhì)的重量為0.35g。干燥過濾的沉淀物中異黃酮類的含量為染料木黃酮26.1g/100g、鷹嘴豆素A8.5g/100g、7-羥基-4’-甲氧異黃酮2.1g/100g；未檢測到黃豆苷元。經(jīng)計算，從25g三葉草葉中提取的異黃酮類為0.128g。
實施例1B
在10月上旬采集在1999年冬季生長在西澳洲西南cultivarTrikkala的地下三葉草(TrifoliumsubterraneumL.)(長)莖上的約1kg葉樣品，將其儲存在約20℃下1天并在5℃儲存10天。
將這種儲存的約0.5kg葉材料切碎并保存在塑料袋中。將25g三葉草葉與50g酸洗滌的濕白沙混合并用研缽和研杵研磨3.5分鐘。將研磨的葉和沙物質(zhì)轉(zhuǎn)入密封的塑料袋中10分鐘并且然后在約62℃下進(jìn)行熱處理20分鐘。
第2天將該熱處理的物質(zhì)轉(zhuǎn)入燒杯并加入200mL去離子水，在攪拌的同時從滴管中加入5M氫氧化鈉以便使該混懸液的pH升至pH12.0。通過使該混懸液過3層細(xì)紗布除去粗纖維物質(zhì)。
然后將所分離溶液和混懸液的pH調(diào)節(jié)至5.6。將pH5.6的該混合物保持在約1℃下48小時且然后通過部分冷凍該溶液并分離形成的冰而濃縮且由此的最終體積約為100mL，將剩余的溶液和沉淀通過濾紙過濾。在40℃下干燥濾紙和保留的沉淀物并如實施例1A中所述測定異黃酮含量。
通過測定4張濾紙的重量以便計算出平均重量并從測定的實驗用濾紙及其保留的物質(zhì)的重量中扣除該平均重量來計算濾紙上保留的該物質(zhì)的重量。
結(jié)果
濾紙上保留的物質(zhì)的重量為1.1g。干燥過濾的沉淀物中異黃酮類的含量為染料木黃酮7.3g/100g、鷹嘴豆素A2.4g/100g、7-羥基-4’-甲氧異黃酮0.55g/100g；未檢測到黃豆苷元。經(jīng)計算，從25g三葉草葉中提取的異黃酮類為0.113g。
實施例1C
在10月上旬采集在1999年冬季生長在西澳洲西南cultivarTrikkala的地下三葉草(TrifoliumsubterraneumL.)(長)莖上的約1kg葉樣品，將其儲存在約20℃下1天并在5℃儲存10天。將這種儲存的約0.5kg葉材料切碎并保存在塑料袋中。
將26g三葉草葉與52g酸洗滌的濕白沙混合并用研缽和研杵研磨3.5分鐘。將研磨的葉和沙物質(zhì)轉(zhuǎn)入密封的塑料袋中10分鐘且然后在約62℃下進(jìn)行熱處理20分鐘。
第2天將該熱處理的物質(zhì)轉(zhuǎn)入燒杯并加入200mL去離子水，在攪拌的同時從滴管中加入5M氫氧化鈉以便使該混懸液的pH升至pH12.0。通過使該混懸液過3層細(xì)紗布除去粗纖維物質(zhì)。然后將所分離溶液和混懸液的pH調(diào)節(jié)至3.5。將pH3.5的該混合物保持在約1℃下48小時且然后通過部分冷凍該溶液并分離形成的冰而濃縮且由此的最終體積約為100mL，將剩余的溶液和沉淀通過濾紙過濾。在40℃下干燥濾紙和保留的沉淀物并如實施例1A中所述測定異黃酮含量。
通過測定4張濾紙的重量以便計算出平均重量并從測定的實驗用濾紙及其保留的物質(zhì)的重量中扣除該平均重量來計算濾紙上保留的該物質(zhì)的重量。
結(jié)果
濾紙上保留的物質(zhì)的重量為1.09g。干燥過濾的沉淀物中異黃酮類的含量為染料木黃酮11.1g/100g、鷹嘴豆素A3.8g/100g、7-羥基-4’-甲氧異黃酮0.85g/100g；未檢測到黃豆苷元。經(jīng)計算，從26g三葉草葉中提取的異黃酮類為0.171g。
相反，使用相同方案和等量原料，但使堿提取產(chǎn)物再進(jìn)行通過燒結(jié)玻璃的過濾步驟而得到濾紙上保留的物質(zhì)的重量為0.415g、染料木黃酮6.3g/100g、鷹嘴豆素A1.25g/100g、7-羥基-4’-甲氧異黃酮0.40g/100g。經(jīng)計算，從26g三葉草葉中提取的異黃酮類為0.033g。
實施例1D
在10月上旬采集在1999年冬季生長在西澳洲西南cultivarTrikkala的地下三葉草(TrifoliumsubterraneumL.)(長)莖上的約1kg葉樣品，將其儲存在約20℃下1天并在5℃儲存10天。將這種儲存的約0.5kg葉材料切碎并保存在塑料袋中。
將26g三葉草葉與52g酸洗滌的濕白沙混合并用研缽和研杵研磨3.5分鐘。將研磨的葉和沙物質(zhì)轉(zhuǎn)入密封的塑料袋中10分鐘且然后在約62℃下進(jìn)行熱處理20分鐘。
第2天將該熱處理的物質(zhì)轉(zhuǎn)入燒杯并加入150mL去離子水，在攪拌的同時從滴管中加入5M氫氧化鈉以便使該混懸液的pH升至pH11.0。通過使該混懸液過3層細(xì)紗布除去粗纖維物質(zhì)。使在堿性三葉草混懸液中沉淀的部分淤渣沉降并通過將該液體與剩余沉降出的物質(zhì)一起傾入另一燒杯而分離。
然后將該溶液和混懸液的pH調(diào)節(jié)至3.6。將pH3.6的該混合物保持在約1℃下48小時且然后通過部分冷凍該溶液并分離形成的冰而濃縮且由此的最終體積約為100mL，將剩余的溶液和沉淀通過濾紙過濾。在40℃下干燥濾紙和保留的沉淀物并如實施例1A中所述測定異黃酮含量。
通過測定4張濾紙的重量以便計算出平均重量并從測定的實驗用濾紙及其保留的物質(zhì)的重量中扣除該平均重量來計算濾紙上保留的該物質(zhì)的重量。
結(jié)果
濾紙上保留的物質(zhì)的重量為1.25g。干燥過濾的沉淀物中異黃酮類的含量為染料木黃酮15.5g/100g、鷹嘴豆素A5.2g/100g、7-羥基-4’-甲氧異黃酮1.30g/100g；未檢測到黃豆苷元。經(jīng)計算，從26g三葉草葉中提取的異黃酮類為0.125g。
實施例1A-1D沉淀物中異黃酮類的比例分別為染料木黃酮10、10、10、10鷹嘴豆素A3.2、3.3、3.4、3.4
7-羥基-4’-甲氧異黃酮0.8、0.8、0.8、0.8，由此表明電離平衡可能極為相似且可能涉及全部三種產(chǎn)物共有的7位置上的酚OH。
實施例1E
從已經(jīng)在約5℃下儲存1個月的與混有Trikkala和Larisa地下三葉草植物一起生長的最近(開始開花后)田地上切下地下三葉草葉。連接的葉柄的長度為1-1.5cm長。
將10g部分研磨約70秒并在5分鐘后加入偏亞硫酸氫鈉溶液以便對終濃度為1.2％葉重的該物質(zhì)防腐。將植物物質(zhì)冷凍儲存至提取為止，此時將各樣品與水混合并將pH調(diào)節(jié)至所選擇的值，2小時后，將它們通過布過濾，將過濾的固體物質(zhì)沖洗2次，將過濾的溶液調(diào)節(jié)至pH2并在用濾紙過濾和將過濾的物質(zhì)溫?zé)岣稍锴霸?0℃下儲存過夜。
結(jié)果
將結(jié)果列在下面的表1中。
表1
A-每100g葉物質(zhì)中異黃酮類的量
B-沉淀物中異黃酮類的含量g/100g
實施例1F
按照實施例1E中所述、再使用在pH10或pH12下提取前于58-64℃下加熱40分鐘的步驟來處理與實施例1E中相同的葉物質(zhì)。
結(jié)果將結(jié)果列在下面的表2中。
表2
A-每100g葉物質(zhì)中異黃酮類的量
B-沉淀物中異黃酮類的含量g/100g
實施例1G
從恰好開始開花的生長有晚季Trikkala地下三葉草植物的淺溝中切下地下三葉草葉。小葉與葉柄的比例為77.5％22.5％。
制備4批的11g葉，用研缽和研杵將每批樣品與約4g硅沙一起研磨90秒，接著在約3.5分鐘的期限后加入偏亞硫酸氫鈉溶液(終濃度為0.2％的三葉草重量)以便對該物質(zhì)防腐，將各批樣品置于單獨的塑料袋中并通過熱水浴加熱至58-63℃下40分鐘。
第2天將各批樣品合并、加入去離子水(約300mls)并在通過布過濾粗物質(zhì)前在pH12下提取約20分鐘，將過濾的固體物質(zhì)沖洗2次并將堿性溶液分成等份的77.5mls且將每份離心3.5分鐘。在儲存過夜并在第2天通過濾紙過濾前將各離心的溶液調(diào)節(jié)至pH2.0、3.0、4.0和5.0。將過濾的物質(zhì)溫?zé)岣稍铩?br> 結(jié)果
將結(jié)果列在下面的表3中。
表3
A-每100g葉物質(zhì)中異黃酮類的量
B-沉淀物中異黃酮類的含量g/100g
實施例1H
從已經(jīng)在約5℃下儲存3天的與混有Trikkala和Larisa地下三葉草植物一起生長的最近(開始開花后)田地上切下地下三葉草葉。
將11g部分研磨約90秒并在5分鐘后與水混合并將該混合物的pH調(diào)節(jié)至pH10，在不同的時間期限后，將它們通過布過濾，將過濾的固體物質(zhì)沖洗2次，將過濾的溶液調(diào)節(jié)至pH2并在用濾紙過濾和將過濾的物質(zhì)溫?zé)岣稍锴霸?0℃下儲存過夜。
結(jié)果
將結(jié)果列在下面的表4中。
表4
A-每100g葉物質(zhì)中異黃酮類的量
B-沉淀物中異黃酮類的含量g/100g
實施例1I
從已經(jīng)在約5℃儲存下16天的與混有Trikkala和Larisa地下三葉草植物一起生長的最近(開始開花后)田地上切下地下三葉草葉。
將10g部分研磨約70秒并在5分鐘后加入偏亞硫酸氫鈉溶液以便對終濃度為0-2.0％葉重的該物質(zhì)防腐。在提取前將該植物物質(zhì)儲存在室溫下5天，此時將各樣品與水混合并將pH調(diào)節(jié)至pH10下1.5小時，然后將它們通過布過濾，將過濾的固體物質(zhì)沖洗2次，將過濾的溶液調(diào)節(jié)至pH2并在用濾紙過濾和將過濾的物質(zhì)溫?zé)岣稍锴霸?0℃下儲存過夜。
結(jié)果
將結(jié)果列在下面的表5中。
表5
A-每100g葉物質(zhì)中異黃酮類的量
B-沉淀物中異黃酮類的含量g/100g
實施例1J
從已經(jīng)在約5℃儲存下25天的與混有Trikkala和Larisa地下三葉草植物一起生長的最近(開始開花后)田地上切下地下三葉草葉。
將16g部分研磨約90秒并在5分鐘后加入偏亞硫酸氫鈉溶液以便對終濃度為0或1.2％葉重的該物質(zhì)防腐。將該物質(zhì)在59-64℃下加熱40分鐘。將樣品與水混合并將pH調(diào)節(jié)至pH12下1.5小時，然后將它們通過布過濾，將過濾的固體物質(zhì)沖洗2次，將過濾的溶液調(diào)節(jié)至pH2并在用濾紙過濾和將過濾的物質(zhì)溫?zé)岣稍锴霸?0℃下儲存過夜。
結(jié)果
從用0.2％偏亞硫酸氫鈉防腐的16g小葉中獲得0.502g干燥的沉淀物，其中異黃酮的含量約為24.3g/100g或約0.76g/100g葉物質(zhì)或以干重計為4.1％。
從用1.2％偏亞硫酸氫鈉防腐的16g小葉中獲得0.710干燥的沉淀物，其中異黃酮的含量約為24.0g/100g或約1.07g/100g葉物質(zhì)或以干重計為5.66％。
實施例1K
從已經(jīng)在約5℃儲存下25天的與混有Trikkala和Larisa地下三葉草植物一起生長的最近(開始開花后)田地上切下地下三葉草葉。
將16g部分研磨約90秒并在5分鐘后加入偏亞硫酸氫鈉溶液以便對終濃度為1.2％葉重的該物質(zhì)防腐。將樣品與水混合并將pH調(diào)節(jié)至pH10下1.5小時，然后將它們通過布過濾，將過濾的固體物質(zhì)沖洗2次，將過濾的溶液調(diào)節(jié)至pH2并在用濾紙過濾和將過濾的物質(zhì)溫?zé)岣稍锴霸?0℃下儲存過夜。
結(jié)果
從pH10下提取的16g小葉中獲得1.10g干燥的沉淀物，其中異黃酮的含量約為12.6g/100g或約0.86g/100g葉物質(zhì)或以干重計為4.57％。
實施例2A
(1)將苦白意大利羽扇豆(白羽扇豆)浸入自來水中1天，期間更換2次水。使羽扇豆在約25℃的室溫下萌發(fā)且在第10天當(dāng)根充分發(fā)育且在該階段首批葉在開放的兩半子葉之間形成時，用研缽和研杵將56g批量的萌發(fā)的羽扇豆與沙一起研磨；
(2)將來自(1)中的研磨物質(zhì)保留不同的時間期限(16分鐘-5小時，參見下文)以便使存在的染料木黃酮苷水解；
(3)將水解的研磨物質(zhì)與約300mL水一起制成混合的溶液-混懸液并將pH調(diào)節(jié)至pH12.0，且在30℃下將pH11.9-12.0維持給定的時間(參見下文)；
(4)將來自(3)的混合物通過布過濾并在柔和B型通用離心機(jī)中以約600-100rpm離心5分鐘；
(5)將來自(4)的過濾溶液調(diào)節(jié)至pH2.0并將酸化的溶液保留過夜以使形成的沉淀沉降且然后過濾并干燥。
結(jié)果
將結(jié)果列在下面的表6中。
表6
A-甲醇浸出的染料木黃酮的含量
以干重計，將合并的干燥沉淀物測定為含有約6％水分以及59％蛋白質(zhì)、4.2％灰分和17.8％可提取的己烷。
實施例2B
將羽扇豆種子浸濕24小時且然后在需要研磨1-1.5前保留不同的時間期限(23小時、4天和5天)，接著在pH10.5下將粗膏狀物提取1.25小時。將所得混合物通過布過濾以便除去沉淀且然后酸化至pH3.5并保存，此后通過濾紙過濾以便分離酸性沉淀物。
結(jié)果
將提取結(jié)果列在在下面的表7中
表7
A-染料木黃酮的量/干燥種子原料的量
B-沉淀物中的含量g/100g
C-計算為6.4g/100g的甲醇浸出中染料木黃酮的濃度
實施例2C
在2次密閉1小時(在約8小時和20小時時)條件下將白意大利羽扇豆?jié)窠?4小時且然后每隔12小時濕浸約1小時，此后濕浸不同的時間期限(12小時-9天)。接著用研缽和研杵將濕浸的種子與少量沙一起研磨約10分鐘并保存在密閉燒杯中不同的時間期限(65分鐘-145分鐘)，此后在pH10-12下提取、通過雙層布粗濾、酸化(pH2-3.5)并在通過濾紙過濾前保存過夜。
結(jié)果
將結(jié)果列在下面的表8中。
表8
A-每100g干燥種子中的染料木黃酮
B-沉淀物中的含量g/100g
實施例2D
將平均重量為0.15g的cultivarGungurru的狹葉羽扇豆(狹葉羽扇豆)浸入自來水中1天，期間換幾次水且然后使其在約25℃D的室溫下萌發(fā)不同的時間期限(4-8天)。
用研缽和研杵將全部種子與少量沙一起研磨約5分鐘并在pH12下提取60-90分鐘前在密封燒杯中保存不同的時間期限(65-88分鐘)、通過雙層布粗濾、在pH3.5下酸化并在通過濾紙過濾前保存過夜。
結(jié)果
將結(jié)果列在下面的表9中。
表9
A-每100g干燥種子中的染料木黃酮
B-沉淀物中的含量g/100g
實施例3A
將平均重量為0.16g(烘箱干燥的0.15g)大豆種子濕浸11小時，但在前7小時后不進(jìn)行氣密1小時的步驟。排空水并保存45分鐘后，將種子粉碎并使用研缽和研杵將其與加入的沙一起充分搗擊約5分鐘且然后在約25℃的室溫下保存在不含水分的密閉燒杯中。
80分鐘后，用調(diào)節(jié)至pH12的堿性溶液將該粗膏狀物浸提2.5小時，此后過濾，隨后將過濾的溶液調(diào)節(jié)至pH2.0。使酸化的溶液在約20℃下沉降過夜，此后通過濾紙過濾并干燥，然后用醇浸提稱重的部分并檢測異黃酮溶液的濃度。
結(jié)果
從100粒種子中獲得7.27g干燥的沉淀物，每100g甲醇浸出約0.15g異黃酮類，近似為70mg異黃酮類/100g干燥種子。
實施例3B
在2次密閉1小時(在約8小時和20小時時)條件下將大豆種子濕浸24小時且此后每隔12小時濕浸約1小時。用研缽和研杵將種子與少量沙一起研磨約5-10分鐘并保存在密閉燒杯中不同的時間期限，此后用堿性溶液提取、通過雙層布粗濾、酸化并在通過濾紙過濾前保存過夜。
結(jié)果
在研磨并持續(xù)80分鐘前濕浸24小時并維持5小時、在pH12下用堿提取2小時、然后酸化至pH3.5的種子具有下列產(chǎn)量
從100粒種子中獲得7.387g干燥的沉淀物，其中每100g中約含0.15g異黃酮類，近似為73mg異黃酮類/100g干燥種子。
濕浸24小時且此后維持1.5天的種子處于幾mm長種皮下可見的第一個階段。在研磨并持續(xù)110分鐘后，在pH12下將粗膏狀物提取140分鐘，在通過布過濾后將濾液分開并分成兩個相等的部分且分別酸化至pH3.5和4.5。產(chǎn)量如下
pH3.5時獲得4.30g干燥的沉淀物，其中每100g中約有0.20g的異黃酮類，近似為118mg/100g干燥種子。
pH4.5時獲得4.84g干燥的沉淀物，其中每100g中約有0.23g的異黃酮類，近似為144mg/100g干燥種子。
濕浸24小時且此后維持4天的種子處于恰從種皮到子葉相對于根而言向下彎曲且輕度開放的點出現(xiàn)的子葉的階段。將種子粉碎并用研缽和研杵將其與加入的沙一起充分搗擊約5分鐘，然后在約25℃的室溫下將它們保存在防止水分損耗的密封燒杯中，140分鐘期限后，用調(diào)節(jié)至pH12的堿性溶液將粗膏狀物浸提150分鐘，此后過濾，隨后將過濾溶液調(diào)節(jié)至pH3.5。使該酸化的溶液在約20℃下沉降過夜，此后將其通過濾紙過濾并干燥，然后將稱重的部分用醇浸提并將異黃酮的產(chǎn)量列在下面。
從60粒種子中獲得6.17g干燥的沉淀物，其中每100g中約含有0.336g異黃酮類或近似為223mg/100g干燥種子。甲醇浸提物中的濃度為1.25g/100g。
將另一批大豆種子濕浸2小時且然后保持1.5小時，此后用研缽和研杵將其與少量沙一起研磨10分鐘并在加蓋的燒杯中保存至2小時、在pH12下用堿性溶液提取2小時、然后用布過濾并沖洗、酸化至pH3.5并在通過濾紙過濾和干燥前保存過夜。
從100粒種子中獲得5.88g干燥的沉淀物，其中每100g中約含0.20g的異黃酮類或近似為80mg/100g干燥種子。
實施例4
用研缽和研杵將8g來自薄荷(椒樣薄荷)植物的葉與沙一起搗擊并加入少量水、持續(xù)1.5分鐘并使如此產(chǎn)生的葉的膏狀物保持穩(wěn)定13分鐘以使其中含有的圣草枸櫞甙(圣草酚-7-鼠李科甙(rhaminoside)苷)水解。
然后將葉膏狀物制成約150mL混合的溶液-混懸液并將pH調(diào)節(jié)至pH12.0且將pH維持在pH11.8-12.0下90分鐘。將該混合物通過布過濾后，將pH調(diào)節(jié)至pH2.0。將酸化的溶液保留過夜以使形成的沉淀沉降，此后將其在第2天在濾紙上過濾并干燥。
結(jié)果
干燥的沉淀物重0.372g。將乙醇浸提的圣草酚測定約為2.5g/100g干燥沉淀物。將該結(jié)果計算為約118mg/100g薄荷葉物質(zhì)。
實施例5
具有約2.5cm長的根而沒有可見的上述葉芽的以商品方式提供的浸提Kabuli亞型鷹嘴豆商購自市場并將其保存在約5℃下的冰箱中且在不同的時間浸提各批產(chǎn)品并使其進(jìn)一步發(fā)育至包括適當(dāng)萌發(fā)播種在內(nèi)的階段。通過取這些種子、粉碎并用研缽和研杵將它們與加入的沙一起充分搗擊約10分鐘且然后在約25-28℃的室溫下保存在防水分的密閉燒杯中來測試這些種子，在至少1.25-3小時后，用調(diào)節(jié)至pH12的堿性溶液將粗膏狀物浸提至少1小時，此后過濾，隨后將過濾溶液調(diào)節(jié)至pH3.5。
使酸化的溶液在約20℃下沉降過夜，此后通過濾紙過濾并干燥、然后用醇浸提稱重的部分并檢測異黃酮溶液的濃度。
結(jié)果
冰箱中保存的是正如從作為種子形成的根的彎曲部分測定的購買后不進(jìn)行額外浸提的樣品、即在沒有可見葉芽而根達(dá)2.6cm的階段的種子，從60粒種子中獲得9.15g干燥的沉淀物，其中每100g中約含0.08g異黃酮類。甲醇浸提物中的濃度為0.6g/100g。
從60粒處于沒有可見葉芽而根達(dá)4.4cm的階段的種子中獲得8.94g干燥的沉淀物，其中每100g中約含0.39g的異黃酮類。甲醇浸提物中的濃度為3.0g/100g。
從處于形成至完全出葉芽階段的40粒種子中獲得6.17g干燥的沉淀物，其中每100g約含0.36g異黃酮類。甲醇浸提物中的濃度為2.2g/100g。
芽的子葉在達(dá)1.2cm長的萌芽與達(dá)5cm或5cm以上但在鷹嘴豆籽苗根上沒有側(cè)根的根之間的大缺口處被分離出來，從處于該階段的67粒種子中獲得8.08g干燥的沉淀物，其中每100g約含0.41g異黃酮類。甲醇浸提物中的濃度為2.4g/100g。
子葉通過達(dá)2.5cm長的萌芽與達(dá)6.7cm長且具有達(dá)1.4cm長的側(cè)根完全開放，從處于該階段的61粒種子中獲得8.41g干燥的沉淀物，其中每100g約含0.67g異黃酮類。
當(dāng)在粉碎并持續(xù)一定間隔后用額外步驟加工來自已經(jīng)達(dá)到葉芽完全形成階段的種子批量的種子時，將它們加熱至60℃下40分鐘并在過濾后離心，此后酸化至pH2.0，從50粒種子中獲得2.61g干燥的沉淀物，其中每100g約含0.75g異黃酮類。
在所述的實施例中，重要的是需注意堿性pH提取作用可能并非是僅增加植物物質(zhì)上的負(fù)電荷的氫氧離子和由此促使帶負(fù)電荷的離子化的類異黃酮苷元類因負(fù)離子-負(fù)離子排斥而進(jìn)入溶液所導(dǎo)致的結(jié)果。在這種情況中，僅在升高的pH下將該植物物質(zhì)保留較長時間會導(dǎo)致增加量的類異黃酮擴(kuò)散入溶液。而浸提的量實際上依賴于時間，當(dāng)浸提時間從5分鐘增加至1小時時，產(chǎn)量幾乎不變，而當(dāng)在pH10下浸提時，確實對pH的改變反應(yīng)很快，在pH9.5下提取三葉草葉物質(zhì)并通過布過濾，當(dāng)用pH12的溶液而非pH9.5的溶液沖洗布過濾的固體時，進(jìn)行2分鐘操作的提取產(chǎn)量增加了27％。
據(jù)推定升高pH不僅可以使苷元變成水溶性的，而且能夠通過改變植物物質(zhì)的物理性質(zhì)-通過使存在的結(jié)構(gòu)開放而減少物理截留或通過改變一定的化學(xué)環(huán)境、可能是通過改變保持一定結(jié)合方式的類黃酮的平衡來使它們擴(kuò)散入溶液。后者的機(jī)理可能是對發(fā)現(xiàn)使用堿提取而非常規(guī)有機(jī)溶劑提取而可導(dǎo)致產(chǎn)量較高的一種解釋。
在本說明書的上下文中，除非另有說明，將術(shù)語″包括″或其變化形式理解為包含所述的整體或整體組，但不排除任何其它的整體或整體組。
權(quán)利要求
1.一種由含有合適的類黃酮苷和/或其接合物的原料生產(chǎn)富集的類黃酮苷元的提取物的方法，該方法包括下列步驟
(i)以酶促方式將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使可溶性類黃酮苷元變得相對不溶并形成含有它們的提取物。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至約8.5-12.5而使所述的類黃酮苷元可溶。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至約9-12而使所述的類黃酮苷元可溶。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至約11-12而使所述的類黃酮苷元可溶。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至至少約8.5而使所述的類黃酮苷元可溶。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至至少約為9而使所述的類黃酮苷元可溶。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至至少約為9.6而使所述的類黃酮苷元可溶。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至約11或12而使所述的類黃酮苷元可溶。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項的方法，其中通過通入最低量的反應(yīng)體積的氣體來調(diào)節(jié)pH，由此使類黃酮的分解減少到最低限度。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項的方法，其中通過添加堿來調(diào)節(jié)pH。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的堿是氫氧化鈉、乙酸鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或氨氣。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項的方法，其中通過沉降、過濾和離心中的任意一種或它們的組合來除去步驟(ii)中的不溶性部分。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至約為2-6而使所述的類黃酮苷元變得不溶。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至約為2-5.6而使所述的類黃酮苷元變得不溶。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至約為2-3.5而使所述的類黃酮苷元變得不溶。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至約為2、3.5、3.6、5.3或5.6而使所述的類黃酮苷元變得不溶。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求1-16中任意一項的方法，其中通過添加酸來添加步驟(iii)中的pH。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的酸是鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、硝酸、乳酸、酒石酸、檸檬酸或丙酸。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求1-18中任意一項的方法，其中通過沉降、過濾、結(jié)晶、共結(jié)晶和離心中的任意一種或多種方法來除去步驟(iii)中的不溶性部分。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求1-19中任意一項的方法，其中步驟(iii)進(jìn)一步包括至少下面之一添加一種鹽以便輔助分離；通過蒸發(fā)或部分冷凍而濃縮該反應(yīng)混合物；和/或降低該反應(yīng)混合物的溫度以便改善輔助的分離。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的類黃酮選自包括下列物質(zhì)的組查耳酮類(chacones)；二氫查耳酮類(dihydrochalones)；噢哢類；黃烷酮類；黃酮類；新類黃酮；黃酮醇類；二氫黃酮醇類；原花色素類；黃烷類；黃烷-3-醇類和雙類黃酮；它們的各種甲氧基化和其它修飾形式；金合歡素；芹菜配基；貝加因；兒茶酸；柯因；金圣草黃素；橡精；dihydrobinetin；二氫莰非醇；地奧亭；兒茶酸；表兒茶酸；圣草酚；非瑟酮；黃顏木素；高良姜精；橙皮素；異鼠季亭；莰非醇；藤黃菌素/木犀草素；桑色素；楊梅黃酮；柚配基；木蝴蝶素A；ponciretin；六羥黃酮；五羥黃酮；刺槐亭；黃芩配基；水飛薊素部分；水飛薊素；異水飛薊素；次水飛薊素；黃芩新素II；福桔黃素；沃貢寧；以及異黃酮類。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的類黃酮是染料木黃酮、黃豆苷原、7-羥基-4’-甲氧異黃酮、鷹嘴豆素A、baptenin或紅車軸草素。
23.一種由含有合適的類黃酮苷和/或其接合物的植物或植物物質(zhì)生產(chǎn)富集的類黃酮苷元的提取物的方法，該方法包括下列步驟
(i)以酶促方式將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使可溶性類黃酮苷元變得相對不溶并形成含有它們的提取物。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中將所述的植物進(jìn)行了遺傳修飾。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其中所述的植物部位選自包括下列植物部位的組葉；花瓣；萼片；花；葉柄；枝條；根；莖；種子；豆莢；塊莖；樹皮；形成層；木材；倍子；果實；蔬菜；草藥；蕨類植物；樹汁；樹脂；外皮，諸如葡萄、蘋果、洋蔥和鱷梨的外皮；皮，包括柑桔屬的皮；果實外皮；諸如蘋果的蘋果醬；果酒的果渣；谷物外皮；稻草；干草；來自橄欖、油菜籽或canola的含油種子餅；及其它含油作物的提取物。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求23-25中任意一項的方法，其中所述的植物是豆科植物，諸如大豆、鷹嘴豆(鷹嘴豆屬，諸如鷹嘴豆)、白草香木犀(白草香木樨)、紫花苜蓿或苜蓿(紫苜蓿)或車軸草屬的種類。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求23-26中任意一項的方法，其中所述的酶是一種或多種選自包括下列酶在內(nèi)的組的酶糖苷酶類、β-糖苷酶類、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、果膠酶類、桔皮苷酶、花色素酶、鼠李淀粉酶(rhamnodiastase)、柚苷酶或高峰淀粉酶。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求23-27中任意一項的方法，其中所述的酶是外源性的并將其加入到類黃酮苷和/或其接合物中。
29.一種根據(jù)權(quán)利要求23-28中任意一項的方法，其中以依次方式使用大多數(shù)酶。
30.一種由含有類黃酮苷和/或其接合物的植物物質(zhì)生產(chǎn)富集的類黃酮苷元的提取物的方法，該方法包括下列步驟
(i)破壞植物物質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以便使其中含有的類黃酮苷或其接合物與其中適合于將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元的至少一種酶接觸且由此將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并分離出不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元相對不溶并分離類黃酮苷元。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中通過下列方法破壞所述的細(xì)胞結(jié)構(gòu)研磨、粉碎、搗擊或滾壓；冷凍和融化；用諸如半纖維素酶類或纖維素酶類這樣的酶處理；超聲處理；干燥法；接觸紫外線；使用包括擠壓和密封分批施壓在內(nèi)的減壓或升壓的處理方法；微生物消化或青貯；接觸氧化性和其它化學(xué)物質(zhì)；洗滌劑處理；或上述方法的任意組合。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中所述的植物物質(zhì)是種子且將其預(yù)處理以便促使其中產(chǎn)生將類黃酮苷及其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元必不可少的酶。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述的預(yù)處理步驟包括將種子濕浸足夠的時間期限以便促使所述酶產(chǎn)生。
34.一種根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中將所述的種子濕浸約10天或10天以下。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中將所述的種子濕浸約0.5-10天。
36.一種通過一種方法生產(chǎn)的富集的類黃酮苷元的提取物，在該方法中如下處理含有合適的類黃酮苷和/或其接合物的原料
(i)以酶促方式將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使可溶性類黃酮苷元變得相對不溶并形成所述的提取物。
37.一種通過一種方法生產(chǎn)的富集的類黃酮苷元的提取物，在該方法中如下處理含有合適的類黃酮苷和/或其接合物的植物物質(zhì)
(i)以酶促方式將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使可溶性類黃酮苷元變得相對不溶并形成所述的提取物。
38.一種通過一種方法生產(chǎn)的富集的類黃酮苷元的提取物，在該方法中如下處理含有合適的類黃酮苷和/或其接合物的植物物質(zhì)
(i)破壞植物物質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以便使其中含有的類黃酮苷或其接合物與其中適合于將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元的至少一種酶接觸且由此將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；
(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并分離出不溶性部分；和
(iii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元相對不溶并形成所述的提取物。
39.一種根據(jù)權(quán)利要求37或38的富集的類黃酮苷元的提取物，其中所述的植物物質(zhì)選自諸如大豆、羽扇豆或三葉草這樣的豆科植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由含有合適的類黃酮苷和/或其接合物的原料生產(chǎn)富集的類黃酮苷元的提取物的方法，該方法包括下列步驟(i)以酶促方式將類黃酮苷或其接合物轉(zhuǎn)化成類黃酮苷元；(ii)調(diào)節(jié)pH以使類黃酮苷元可溶并除去不溶性部分；和(iii)調(diào)節(jié)pH以使可溶性類黃酮苷元變得相對不溶并形成含有它們的提取物。
文檔編號A61P31/04GK1395573SQ0180360
公開日2003年2月5日 申請日期2001年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月11日
發(fā)明者R·G·沃萊斯, W·G·布隆 申請人:比奧雷克斯健康有限公司