專利名稱：：豬仔笠類黃酮提取物及其提取方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及豬仔笠類黃酮提取物及其制備方法和應用，屬于醫(yī)藥領域。
背景技術：
：豬仔笠屬名五n》se7wacto7eraeFog，為豆科毛瓣花屬植物，約100種，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。據(jù)《中藥大詞典》記載豬仔笠塊根入藥，具有清熱解毒、生熱煩渴、化痰潤肺、止咳之功效，而且是治療傷風咳嗽、止呼吸道感染、發(fā)熱煩渴、痢疾、跌打損傷等疾病的珍稀名貴中草藥。豬仔笠主要用于治療咳嗽、哮喘，療效顯著，安全可靠，價廉而方便，是一種良好的中草藥資源，值得開發(fā)研究和推廣運用。豬仔笠雖然已在民間應用較廣，但對豬仔笠的有效成分以及生物活性的研究未見有關文獻報道，豬仔笠的臨床用藥機理尚不明確，僅憑經(jīng)驗，這就限制了其在臨床上的應用范圍而沒有得到充分有效的開發(fā)利用。同時，由于其主要活性成分不明，就無法對豬仔笠的有效成分進行檢測、對藥材質量進行有效控制和道地藥材進行權威鑒定。在中藥的諸多研究中，對活性成分、藥理作用和藥效與成分關系的研究較少，所以無法闡明中藥治療疾病的藥效物質基礎和作用機理等重要科學問題，也無法為尋找新藥物或合成新藥提供先導物或結構母核，無法提升中藥新藥研究方法和技術水平。因此深入、系統(tǒng)和有效地分離、純化、結構鑒定以及活性的追蹤驗證是開展和加強中藥藥效物質基礎和作用機理系統(tǒng)研究的必然。而在傳統(tǒng)的分離技術基礎之上，積極探索和應用新的分離方法和技術是加速中藥藥效物質基礎和作用機理系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢。開展對豬仔笠藥理活性成分的研究，掌握豬仔笠被廣泛用于治療咳鰍、化痰的藥效物質基礎，可為豬仔笠治療咳嗽、化痰的藥理研究和臨床應用提供參考，為探索該屬植物的活性成分及其化學分類學方面提供借鑒。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種豬仔笠類黃酮提取物及其提取方法和應用。本發(fā)明所述的豬仔笠類黃酮提取物，其分子量為436，分子式為C26H2806，具有下述結構的類黃酮化合物，本發(fā)明以化合物l表述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>本發(fā)明所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法為包括如下步驟1)將豬仔笠塊根粉碎，用乙醇回流提取獲得乙醇提取液，將乙醇提取液減壓濃縮得浸膏，浸膏加入水混懸，用石油醚萃取，減壓濃縮得石油醚浸膏；2)石油醚浸膏在溶劑體系為正己烷、醋酸乙酯、甲醇、水構成的色譜條件下經(jīng)過制備型HSCCC分離，形成色譜峰形，有組分1和組分2的色譜峰，組分1經(jīng)手工收集后，本發(fā)明一般于室溫自然揮發(fā)有黃色油狀物析出；3)黃色油狀物采用展開劑為石油醚和醋酸乙酯的薄層制備，得到黃色方晶的類黃酮化合物。上述的減壓濃縮可以采用本領域通用的旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮。上述步驟2)的HSCCC分離的溶劑體系(以體積比計量范圍)為正己烷醋酸乙酯甲醇水=36:36:58:24;固定相為上相；流動相為下相；HSCCC分離流速0.54.0mLmin";轉速6001200rmin-1;固定相的保留值不低于50%。步驟l)粉碎的豬仔笠塊根，可以用50100。/。乙醇浸沒藥材且液面高出藥材約0.5lcm,在8095。C和常壓力回流提取24次，合并乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入2i5倍量的水混懸，用0.52倍水的石油醚萃取8i2次，合并上述萃取的所有石油醚萃取液后用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏。當然優(yōu)選用95%乙醇在優(yōu)選8285t:和常壓力下回流提取三次，合并三次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入35倍的水混懸，用0.51倍水的石油醚萃取10次，合并上述萃取的所有石油醚萃取液后，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏。步驟3)的展開劑為石油醚和醋酸乙酯其優(yōu)選石油醚醋酸乙酯(以體積比計量)=4:1。步驟2)所述的HSCCC分離的最佳的HSCCC溶劑體系(以體積比計量)為正己烷-醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3;固定相為上相；流動相為下相；HSCCC分離流速2.0mL.min—1;轉速700r'min";面定相的保留值不低于50%。經(jīng)測定本發(fā)明溶劑體系正己烷醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3的固定相的保留率為63.96%。本發(fā)明所述的豬仔笠類黃酮提取物，能作為防治抑菌、抗炎、止咳和化痰的藥物，以及作為制備防治金黃葡萄球菌的藥物的應用本發(fā)明的優(yōu)點是本實驗用傳統(tǒng)的溶劑回流提取方法，通過HSCCC與傳統(tǒng)的薄層層析制備相結合進行分離純化，首次從豬仔笠藥材石油醚部位分離得到新的化合物l。本發(fā)明和傳統(tǒng)的通過溶劑萃取、反復層析的方法相比，HSCCC不僅可以大大簡化諸多步驟、節(jié)約時間，且不會造成溶劑和樣品的損失，目標產(chǎn)物能達到較高的純度。且在HSCCC操作過程中，只要調試好儀器，進樣完畢后，后續(xù)分離過程則完全可以實現(xiàn)自動化，且分離過程可以結合紫外進行檢測。上述特點顯示了HSCCC在分離、提純化合物方面的明顯優(yōu)勢。本發(fā)明還研究探索出分離石油醚部位的最佳溶劑配比系統(tǒng)以體積比計量為正己垸醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3，這些溶劑體系不僅有合適的上、下相之比，合適的固定相保留值，而且對目標成分有比較理想的分配。本發(fā)明通過對豬仔笠的提取物——化合物l研究發(fā)現(xiàn)，1)豬仔笠的提取物——化合物1對金黃葡萄球菌有較好的抑菌活性，豬仔笠的提取物——化合物1對某些菌也具有一定的抑制效果，可能含有量比較少但是活性很高的物質。2)本發(fā)明的豬仔笠的提取物——化合物1能抑制二甲苯所致的小白鼠耳腫脹作用，具有良好的抗炎效果。3)本發(fā)明的豬仔笠的提取物——化合物l能延長咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，具有良好的鎮(zhèn)咳作用。4)本發(fā)明的豬仔笠的提取物——化合物1明顯增加小鼠氣管酚紅排泌量，表明可促進腺體分泌，使痰液黏度下降而易于咳出，從而起到祛痰作用。具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細說明第一部分豬仔笠石油醚萃取物的化學成分研究1實驗儀器及材料1.1藥材豬仔笠購自地點福建龍巖；鑒定福建省中醫(yī)藥研究院王振登研究員鑒定。1.2儀器微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；恒溫水浴鍋；部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(VARIAN,Cary50);AVATAR360紅外光譜儀<美國ThermoNicoier);GS20分析型高速逆流色譜儀(北京天寶物華生物技術有限公司)；GS10制備型高速逆流色譜儀(北京天寶物華生物技術有限公司)；高效液相色譜儀(美國Agilent1100series);元素分析儀(德國VarioELIII);質譜儀(美國LCQDecaXPMax);核磁共振儀(美國Unity500)。1.3試劑正己烷、醋酸乙酯、甲醇、雙蒸水、石油醚(60-90°C)均為AR級；色譜甲醇；無特別標明均為分析純試劑。2實驗方法2.1樣品制備將豬仔笠塊根粉碎ikg,用95%乙醇浸沒藥材且液面高出藥材約1cm,在8285。C和常壓力回流提取三次(2h，2h，2h)，合并乙醇提取液。將乙醇提取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏140g，加入約7001000mL的水混懸，用300500mL石油醚萃取810次，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏30g。本發(fā)明優(yōu)選實例將豬仔笠塊根粉碎1kg，用95%乙醇浸沒藥材且液面高出藥材約lcm，在優(yōu)選84。C溫度和常壓力下回流提取三次(2h，2h,2h),合并三次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏140g,浸膏加入850毫升水混懸，用0.8倍上述水量的石油醚萃取10次，合并石油醚萃取液，旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏30g。2.2HSCCC溶劑體系的選擇及樣品溶液的制備高速逆流色譜法〈High-speedCcmnterciiiTentChro-matography,簡稱"HSCCC"，下同)是兩個互不混溶的溶劑逆向流動，樣品在兩相之間分配，不用固態(tài)吸附劑的全液態(tài)色譜方法；HSCCC溶劑體系的選擇按照被分離物質的粗略極性選擇分離體系類別，在該實驗中，選擇弱極性的正己烷體系，同時采用薄層色譜法選擇溶劑體系的配比，首先按選定的溶劑系統(tǒng)配制一定量的兩相溶劑，各取2mL于小試管中，加入數(shù)毫克樣品，劇烈振蕩lmin后，靜置分層，用毛細管取近似等量的上下兩層溶液于TLC板上，待溶劑揮發(fā)完后用溶劑系統(tǒng)中的有機層展開，用碘缸顯色，根據(jù)斑點色度和面積可以觀察樣品中各組分在兩相溶劑中的分配情況，即估算分配系數(shù)的大小和差異，由此判斷溶劑系統(tǒng)的適用性，再通過分析型高速逆流確定溶劑系統(tǒng)。樣品溶液的制備將200mg石油醚粗提物溶解在2mL體積比為i/i的上下相溶劑系統(tǒng)中，用4.5ym有機系的濾膜過濾，本發(fā)明的實例中濾膜采用尼龍的濾膜，以備HSCCC進樣。2.3HSCCC分離步驟每次分離之前，首先配制已選擇好的兩相溶劑系統(tǒng)，將其充分混合后靜置分層。在使用前將兩相分離，先用恒流泵將上述選定溶劑體系的上相打入HSCCC的柱內(總體積為V)，直至注滿整個管子。然后開啟HSCCC，轉速為700r'min'1，同時流動相以2.0mLmin—1的流速打入HSCCC，等到聚四氟乙烯管尾端流出流動相后，表明HSCCC中兩相已達到平衡，收集柱尾端流出的固定相體積V!,通過六通閥將樣品注入HSCCC，流動相流出端紫外檢測器波長為254nm。根據(jù)色譜圖手工收集各色譜峰組分。分離結束后，用氮氣將兩相溶劑從聚四氟乙烯螺旋管中沖出，測定固定相的保留值(SF)SF-V-V,/VX1000/。。2.4各個組分的純度分析豬仔笠石油醚粗提物經(jīng)HSCCC分離得到的各組分通過HPLC進行純度分析。2.5各個組分的結構鑒定分離得到的化合物通過元素分析、MS、IR、UV、NMR等波譜學方法進行分子結構鑒定。3結果與分析3.1HSCCC溶劑體系按"2.2"項下方法篩選，最后得到較佳的溶劑體系(以體積比計量)正己垸醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3。在下述最佳實驗條件下進行實驗溶劑體系正己烷醋酸乙酯甲醇水(5:5:7:3);固定相上相；流動相下相；流速1.0mLHlin";轉速1200r'min'1，獲得石油醚萃取物的分離，從實驗結果可以看出有4個峰，其中后面2個峰分離度比較好，達到基線分離。3.2HSCCC分離結果實驗條件為溶劑體系(以體積比計量)正己烷醋酸乙酯甲醇水(5:5:7:3);固定相上相；流動相下相；流速2.0mL.min";轉速700rmin"，200mg石油醚萃取物在一定色譜條件(溶劑體系正己烷醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3)下經(jīng)過制備型HSCCC分離，形成色譜峰形，有組分1和組分2的色譜峰，組分i經(jīng)手工收集后，于室溫自然揮發(fā)有黃色油狀物析出，黃色油狀物經(jīng)薄層制備，展開劑為石油醚醋酸乙酯(以體積比計量)=4:1，得到黃色方晶(乙醇液中)，得到29mg化合物l;組分2經(jīng)手工收集后，于室溫自然揮發(fā)有淡黃色針狀結晶析出，得到4mg化合物2。33固定相保留值固定相保留值對分離效果影響很大，保留值越大，分離效果越好。影響固定相保留值的因素很多，包括溶劑系統(tǒng)本身的特點、流動相流速、HSCCC儀器的工作性能等。為保證分離效果，固定相的保留值不能低于50%。本實驗測定溶劑體系(以體積比計量)正己烷醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3的固定相的保留率為63.96%。3.4HSCCC逆流分離組分的純度在3.2中HSCCC分離所得化合物1在HPLC色譜測定條件:水/乙腈以起始比例85:15，75min后為80:20，10min后為60:40,20min后為50:50，30min為40:60，40min后為20:80，45min后為10:90，柱溫30°C，流速1mLmin-1，檢測波長254歸的條件下分析顯示HPLC圖譜為單一峰，且峰形對稱，表明為純一組分，可進行結構分析；化合物2在HPLC色譜測定條件水/乙腈以起始比例80:20,25min后為60:40，30min后為50:50，33min為40:60，35min后為20:80，40min后為10:90，柱溫30°C，流速1mLmin-1，檢測波長254nm的條件下分析顯示HPLC圖譜為單一峰，且峰形對稱，也表明為純一組分，可進行結構分析。3.5化合物l的結構3.5.1化合物l的紫外吸收光譜根據(jù)化合物1的紫外光譜判斷，屬于類黃酮化合物，因分子中存在桂皮?；氨郊柞；M成的交叉共軛體系，故其在200400nm的區(qū)域內存在兩個主要的紫外吸收帶，稱為峰帶I(300400nm)及峰帶II(220280nm)。根據(jù)化合物1的紫外光譜，有2個主要的吸收帶，出現(xiàn)在帶I(300400nm)及帶H(220280證)之間，說明化合物1可能是類黃酮化合物。3.5.2化合物1的紅外吸收光譜根據(jù)化合物l的紅外光譜將主要峰歸屬如下3466cm"附近的強寬吸收峰，表明有多個羥基所形成的相互結合的氫鍵所致，1659cm"為黃酮的羰基吸收峰，1630cm—、1588cm"的吸收峰顯示有苯環(huán)存在，833cm"為苯中C-H面內彎曲振動吸收峰，2961cm"吸收峰表明有甲基存在，2923cm"吸收峰表明有亞甲基存在，2840cnT1吸收峰表明苯環(huán)上有甲氧基，1255cm"吸收峰顯示有醚結構存在?？梢猿醪脚袛嗷衔飈為類黃酮化合物。3.5.3化合物1的元素組成和質譜分析結果元素分析測定值N:<0.30%，C:71.29%，H:6.61%;由化合物1的質譜圖顯示結果推斷化合物1的分子量為436，結合元素分析，推斷化合物l的分子式為C26H2806。3.5.4化合物1的核磁共振氫譜和碳譜化合物l的1H-NMR(400MHZ,CDCB)和13C-NMR(100MHZ,CDCi3)的數(shù)據(jù)如下^-NMR(400MHZ,CDCl3)5ppm:3.85(3H，s，5-OCH3)，1.45-1.64(12H，s，4CH3)，3.17(2H,d,r'腳2H),5.13(lH,t,2"'-lH),4.49(lH，d，3-H),5.01(lH,d，2-H),5.53(lH,d,3"-H),6.63(lH，d，4"-H),U.40(lH，s,4'陽OH),7.47(2H,d，2'，6'-H),6.98(2H，d,3',5'-H)。13C-NMR(100MHZ，CDC13)Sppm:196.26(C隱4),160.69(C-9),160.16(C-7),159.35(C-5),155.94(C-4')，131.37(C-2"),128.73(C-3'")，126.43(C-2',6')，126.18(C國1'),122.12(C-2'"),H5.43(C-3'，5'),114.15(C-4")，113.84(C-3")，109.25(C-10)，103.12(C-8),100.27(C-6),82.82(C-3),72.53(C-2)，55.35(-OCH3)，17.88(C-l'"),21.28(C隱4'"),25.82(C-5"')，28.39(C-2"-Me2)。從氫譜和碳譜可知，所有的氫信號和碳信號都有合理的歸宿，再結合紫外圖譜、紅外圖譜、質譜和元素分析，可知化合物1的結構式如下所示，是首次從該豬仔笠植物分離出的一種新的類黃酮化合物。本發(fā)明采用分離、純化的新手段HSCCC分離來分離純化豬仔笠石油醚部位的化學成分。HSCCC利用多層螺旋管行星式運動形成特殊的離心力矢量場，來實現(xiàn)兩溶劑相在管柱里的單向性流體動力學分布狀態(tài)，在這種情況下，可以保證流動相高速穿過管柱時固定相在管柱里的保留百分率達50%以上，同時大大促進了兩相間的充分混合和逆流傳遞。這種體系由于能夠采用多樣的體系條件和操作方式，對從天然產(chǎn)物粗提物中分離提取不同特性的有效成分提供了良好的條件，因而，更符合分離分析和制備純化工作的需要。HSCCC溶劑體系的選擇對于HSCCC十分關鍵，同對也是最難解決的問題，溶劑選擇的困難制約了逆流色譜的應用。通常，兩相溶劑體系應滿足以下要求(1)不造成樣品的分解或變性；(2)足夠高的樣品溶解度；(3)上-下兩相的體積大致相等，以免浪費溶劑；〈4)樣品在溶劑系統(tǒng)中合適的分配系數(shù)值；〈5)溶劑體系的分層對間小于30s，使固定相能實現(xiàn)足夠高的保留。一般來說，前三點可以較簡便地進行判斷，后兩點對高速逆流色譜儀顯得特別重要，需要經(jīng)過測定或實驗判斷。測定方法包括TLC、HPLC和分析型HSCCC法等。TLC法的準確度較低，但方便、快速，可以對溶劑系統(tǒng)的適用性作出便捷的初步判斷。根據(jù)斑點色度可以觀察樣品中各組分的相對含量及其在兩相溶劑中的分配情況，即估計分配系數(shù)的大小及差異，由此可以確定溶劑系統(tǒng)的適用性及各組分的流出順序。因此本實驗采用TLC法，但TLC法只能對溶劑系統(tǒng)的適用性作出初步的判斷，對分配系數(shù)作大致的估算，在缺乏經(jīng)驗的情況下，很難據(jù)此把握溶劑系統(tǒng)用于逆流色譜分離的可行性。因此本實驗通過TLC法檢測到溶劑的上、下相均有目標產(chǎn)物后，再通過分析型HSCCC法篩選最佳的溶劑系統(tǒng)。結果表明1.溶劑體系的選擇是HSCXX分離中最為關鍵的環(huán)節(jié)，溶劑體系選擇的合適與否，直接關系到分離結果得好壞。石油醚部位的極性較弱，因此應選用弱極性體系。正己垸/醋酸乙酯/甲醇/水是已被廣泛應用的溶劑分離系統(tǒng)之一，主要應用于弱極性物質的分離。在溶劑體系中，正己烷和水分別成為兩相，再根據(jù)需要加入甲醇、醋酸乙酯來調節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達到好的分離效果。對于正己烷/醋酸乙酯/甲醇/水的體系，若目標組分易溶于該體系的上相，增加甲醇水的含量，可將目標組分拉向下相。反之，則可降低甲醇的比例。原因在于當甲醇的量增加時，其一方面可以減小水相的極性，同時又可增加有機相的l及性,可以9達到改變待分離成分在兩相中的分配系數(shù)的目的。本發(fā)明研究探索出分離石油醚部位的最佳溶劑系統(tǒng)(以體積比計量)為正己烷醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3，這些溶劑體系不僅有合適的上、下相之比，合適的固定相保留值，而且對目標成分有比較理想的分配。2.和傳統(tǒng)的通過溶劑萃取、反復層析的方法相比，HSCCC不僅可以大大簡化諸多步驟、節(jié)約時間，且不會造成溶劑和樣品的損失，目標產(chǎn)物能達到較高的純度。且在HSCCC操作過程中，只要調試好儀器，進樣完畢后，后續(xù)分離過程則完全可以實現(xiàn)自動化，且分離過程可以結合紫外進行檢測。上述特點顯示了HSCCC在分離、提純化合物方面的明顯優(yōu)勢。當然，HSCCC在分離、提純化合物方面也不會是萬能的。有的化合物由于難于選擇合適的溶劑系統(tǒng)，則不能借助HSCCC的手段分離。另有，用來進行HSCCC分離的樣品應盡可能使目標成分純度提高。這樣既便于尋找合適的溶劑系統(tǒng)，又可有效地提高分離效果。因此，HSCCC在應用于化學成分的分離提純時，應盡可能與其它常用的分離方法互補進行。本實驗用傳統(tǒng)的溶劑回流提取方法，通過HSCCC與傳統(tǒng)的薄層層析制備相結合進行分離純化，首次從該藥材石油醚部位分離得到2種新的化合物，其中豬仔笠的提取物——化合物1是本發(fā)明保護的物質。第二部分豬仔笠的提取物——化合物1生物活性的研究1實驗儀器及材料1.1藥材豬仔笠購自地點福建龍巖；鑒定福建省中醫(yī)藥研究院王振登研究員鑒定。豬仔笠的提取物——化合物1由本發(fā)明的第一部分實驗獲得。1.2儀器紫外可見分光光度計(VARIAN,Cary50);RE-52A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BS210S型微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；電熱干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海國華儀器設備有限公司)；超低溫冰箱(Sanyo);超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL—16G高速冷凍離心機(上海安亭儀器廠)；低速大容量離心機(上海安亭儀器廠)；蒸餾水器(上海亞榮生化儀器廠)；SSB—1超凈工作臺(上海凈化設備廠)。1.3試劑細菌菌株金黃色葡萄球菌(GIM1.55)、大腸桿菌(GIM1.115)、傷寒沙門氏菌(ATCC6539)、枯草芽抱桿菌(0901)，由福建農林大學微生物實驗室提供；普通瓊脂培養(yǎng)基(醫(yī)用)，新華中速濾紙，紅霉素，復方甘草口服溶液(廣西醫(yī)科大學制藥廠)；氨水(25%28%);地塞米松磷酸鈉(福建三愛藥業(yè)有限公司)；鼢紅；石油醚(AR，沸程60-90°C)、無水乙醇(AR)、NaOH、NaCl、NHUC1均為國產(chǎn)分析純。1.4實驗動物昆明小鼠，平均體重為(1822g)，購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心。2實驗方法2.1豬仔笠的提取物——化合物1抑菌活性的研究2.1.1檢測菌懸液的制備將檢測菌接至斜面，37'C培養(yǎng)24h，用震蕩器將菌苔在生理鹽水(已滅菌)中震蕩分散，并用瓊脂培養(yǎng)基將其稀釋到所需的OD值。2丄2濾紙片法測定抑菌活性用打孔器將濾紙片(厚約4mm)打成直徑5mm的圓片，高壓滅菌后待用。用上述制備好的菌懸液浸濕無菌棉簽后，讓棉簽在試管壁上輕輕擠壓，擠掉多余的菌懸液，用棉簽的側面而不是頂端從三個不同角度密涂平皿，每個角度相差約60°，最后沿平皿內緣涂沫一周。取直徑6mm的滅菌濾紙片，每片滴加含量為250mgmL"的化合物1提取液20y1作為實驗樣片，陰性對照樣片滴加20u1無菌水，陽性對照樣片滴加20U1的lOugmL—1紅霉素溶液，50t:烘干，用無菌鑷子取出濾紙片貼在含菌平板上，并輕輕按壓使其充分接觸。置37i:恒溫培養(yǎng)18—24h。測定濾紙片的抑菌圈大小，比較抑菌效果。2丄3試管連續(xù)稀釋法根據(jù)抑菌實驗的結果，選取敏感菌測定各提取物對其的最低抑菌濃度。采用雙倍稀釋法，以吐溫80做為助溶劑，吐溫80的濃度為2%。取小號試管7支，編號。第l步每支管各加1mL肉湯培養(yǎng)基，然后在第1管加1mL藥液，用吸管在第i管吹吸數(shù)次，使藥液與肉湯培養(yǎng)基混勻，取出1mL加于第2管，混均取出1mL加于第3管，如此稀釋至第6管棄去lmL，第7管不加藥液作為對照。第3步每管加菌液50wl，混勻，置37'C溫箱中培養(yǎng)24h。然后從每管中取出培養(yǎng)物20lii接種于普通瓊脂平板上，再繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察結果。以無細菌生長的最高稀釋濃度為該藥液的最低抑菌濃度。平行做3次，以2次或3次相同結果為準，并設立吐溫80對照和無菌水對照。因為中藥液本身的混濁和人為視覺的差異，細菌生長后，使得肉眼無法觀察，或觀察的實驗結果易出現(xiàn)偏差，因此，再從每一管中取培養(yǎng)物20lU，轉種到瓊脂平板培養(yǎng)基上，用L棒涂布，置37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h，以不生長菌落的最高藥物稀釋度為該藥物對該種細菌的最小抑菌濃度(MIC)。2.2化合物l抗炎活性的研究2.2.1供試液的制備從第一部分獲得的石油醚萃取物——化合物1以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)，最后以水定容，配制的濃度為4.680mg'ml/(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)。2.2.2對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響將30只小白鼠隨機分成3組，每組10只；陰性對照組灌生理鹽水，陽性對照組按5mg'kg"經(jīng)皮下注射地塞米松磷酸鈉給藥，實驗組灌石油醚萃取物——化合物l，每日上午給動物喂食前給藥，給藥液體積為lOmL'kg'1，連續(xù)給藥10d。于第10d給藥lh后右耳殼滴二甲苯20ul，致炎后30min脫臼處死小鼠，用脫脂棉輕拭去左右耳殘留藥物，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑為8mm的打孔器分別在兩耳同一部位打下圓耳片，電子天平稱重，求出兩耳重量差，以兩耳重量差作為炎癥腫脹程度的指標進行t檢驗。2.3止咳活性的研究2.3.1供試液的制備豬仔笠的提取物——化合物1以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)，最后以水定容，配制的濃度為4.680mg'mL"(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)。2.3.2實驗分組及給藥方法將30只小白鼠隨機分成3組，每組10只；陰性對照組灌生理鹽水，陽性對照組灌復方甘草口服溶液(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)，實驗組灌豬仔笠的提取物——化合物l，每日上午給動物喂食前灌胃給藥，給藥液體積為10mL'kg—1，連續(xù)給藥10d。2.3.3小鼠氨水引咳法本試驗于末次給藥1h后進行。250mL廣口瓶內放一注有80y1氨水的棉球，用裝有通氣管的塞子塞上，待氨水飽和后，將被測試的小白鼠逐個放入廣口瓶內，記錄小白鼠被放入杯內到出現(xiàn)腹肌收縮張嘴的對間(即第一次咳嗽的時伺)以及1.5min內的咳嗽次數(shù)，觀察記錄氨水引起動物的咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)，每測試一只動物均要更換新的氨水棉球。2.4化痰活性的研究2.4.1供試液的制備豬仔笠的提取物——化合物1以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)，最后以水定容，配制的濃度為4.680mg'mU1(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)。2.4.2標準酚紅曲線的繪制用分析天平準確稱取一定量的酚紅，加5%碳酸氫鈉溶液溶解，配成lmL含100ug，然后順次稀釋成每毫升含酚紅0.050，0.100，0.125，0.250，0.500,1.000,1.250，2.500,5.000，10.000Ug，用分光光度計于546nm處測吸光值A，以酚紅劑量為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制標準曲線。2.4.3氣管段酚紅法取小鼠30只，隨機分成3組，每組10只。陰性對照組灌生理鹽水，按10mL'kg"灌胃蒸餾水，陽性對照組按lg'kg"灌胃氯化銨，實驗組灌豬仔笠的提取物一一化合物l，按10mLkg"灌胃，給藥每日上午給動物喂食前灌胃給藥，連續(xù)給藥10d。末次給藥lh后，按0.5g'k^的劑量分別給每只小白鼠腹腔注射酚紅-生理鹽水，注射酚紅0.5h后，處死小白鼠，小心剝離氣管周圍結締組織，剪下從甲狀軟骨至支氣管分叉處的氣管，放入盛有2mL生理鹽水的試管中，再加0.1mL氫氧化鈉溶液(lmol'L—1)，搖勻，于546nm處測吸光值A。根據(jù)酚紅標準曲線計算酚紅含量，給藥組和陰性對照組之間進行組間t檢驗。校正酚紅含量=酚紅含量(mg)/小鼠體重(kg)化痰率(％)=(給藥組的酚紅含量/模型組的酚紅含量)xioo%3結果與分析3.1抑菌效果3丄1化合物l的抑菌效果供試樣豬仔笠的提取物——化合物1對大腸桿菌，傷寒沙門氏菌，枯草芽孢桿菌抑制作用不明顯，而對金黃葡萄球菌有一定的抑制作用外，抑菌效果見下表表l化合物l的抑菌效果抑菌環(huán)直徑/mm大腸桿菌傷寒沙門氏菌金黃葡萄球菌枯草芽孢桿菌豬仔笠的提取物77108紅霉素溶液17216193丄2化合物1對金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度從化合物1對金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度實驗結果可以看出化合物1對金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度為20mgmL—1，最小抑菌濃度實驗結果見下表表2各提取物對金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表中"-"表示無菌落出現(xiàn)，"+"表示有菌落出現(xiàn)。3.2抗炎效果由表3可以看出，豬仔笠的提取物——化合物1對二甲苯所致的小鼠耳殼腫脹均有極顯著的抑制作用，與陰性對照組比較差異極顯著(PO.01)。表3豬仔笠的提取物對二甲苯所致小鼠耳殼腫脹的影響組別劑量(mg'kg'1)_動物數(shù)(只)腫脹度(mg)生理鹽水^^16.77±5.90豬仔笠的提取物46.8069.16士3.62"地塞米松__^_4.16±0.32**注與陰性對照組比較，**P<0.0133止咳效果由表4可以看出，豬仔笠的提取物"化合物1能延長小白鼠咳嗽潛伏期及減少每分鐘內的咳嗽次數(shù)，與陰性對照組比較差異有顯著性，豬仔笠的提取物——化合物1與陰性對照組比較差異極顯著(po.m)。表4豬仔笠的提取物對濃氨水致咳小鼠的影響_組別劑量(mg'kg—1)咳嗽潛伏期(s)1.5min內的咳嗽次數(shù)~生理鹽水^22.83±0.7538.17±4.88豬仔笠的提取物46.80_2楊±0.89_13.67±1.37**注與生理鹽水比較，*P<0.05,**P<0.013.4化痰效果以酚紅劑量為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制標準曲線，由曲線回歸方程為y=0.1727x-0.0011;化痰實驗結果見表5，豬仔笠的提取物——化合物1對小白鼠具有很強的化痰作用，與陰性對照組比較，差異極顯著，具有較強的化痰活性。_表5豬仔笠的提取物對小鼠氣管酚紅排泌量的影響_組別SS酚紅含量校正酚紅含量化痰率(%)(rag*kg—')(ugm「0(ugm1/1kg—')生理鹽水-0.14±0.047.69土1.79-豬仔笠的提取物46-800.30±0、081464±2、70**186.28氯化銨1000.000.43±0.0721.10±1.16**274.53注與陰性對照組比較，**P<0.014本部分小結與討論4.1抑菌實驗本試驗采用濾紙片法和試管稀釋法，選用常見的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性代表菌，對豬仔笠的提取物"~~化合物1的抑菌活性進行了研究。天然植物在長期的自然選擇過程中，形成了一套精細的抗菌防御系統(tǒng)，表現(xiàn)為抗菌成分豐富多樣，如揮發(fā)油、脂溶性色素、類黃酮化合物、皂武、多酚類化合物和生物堿等。植物體外抑菌作用的強弱與提取物的成分和濃度有密切關系，大多數(shù)植物粗提物濃縮到較高的生藥濃度對，往往變得粘稠，這種提取物成分復雜，常含有多種抗菌或抑菌成分，也有多糖、淀粉、樹脂、蛋白質等無抑菌作用的成分，無抑菌作用的成分往往會影響抑菌效果。本實驗利用萃取將豬仔笠的萃取物進行分段分離，得到豬仔笠的提取物——化合物i，再進行體外抑菌試驗，使得有抑菌或殺菌活性的成分更加集中，用量少，效果更明顯。通過對豬仔笠的提取物——化合物1的體外抑菌試驗研究發(fā)現(xiàn)，豬仔笠的提取物——化合物i對金黃葡萄球菌有較好的抑菌活性，豬仔笠的提取物——化合物1對某些菌也具有一定的抑制效果，含有量比較少但是活性很高的物質。4.2抗炎實驗隨著生命科學的發(fā)展，人們逐漸認識到各種炎癥的發(fā)病機制，開發(fā)抗炎藥物成了藥學領域研究的熱點。而目前抗炎藥物主要來源于副作用大的化學藥物，而中藥在抗炎藥物的研究中，因其藥效好，不良反應少以及來源豐富等優(yōu)勢，越來越受到人們的重視，研究和開發(fā)具有抗炎活性成分的中藥也逐漸成為熱點。本實驗選用常用的炎癥模型對其進行研究，以期從中找到具有抗炎作用的組分應用于臨床。在以血管通透性為主要改變的急性炎癥模型實驗中，豬仔笠的提取物——化合物1能抑制二甲苯所致的小白鼠耳腫脹作用，具有較好的抗炎作用。4.3止咳實驗咳嗽是上呼吸道一種重要的保護性反射，是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見癥狀。有研究表明，咳嗽的產(chǎn)生主要與RARs受體和C-纖維受體接受刺激有關，RARs受體主要對機械剌激敏感，而C-纖維受體則主要對化學刺激敏感，如辣椒素、枸櫞酸等。在動物身上，咳嗽可由機械、化學刺激和電刺激氣管粘膜、迷走神經(jīng)而產(chǎn)生，其中以化學和機械刺激最接近正常生理情況。所以本實驗采用以化學刺激引咳來考察藥物的鎮(zhèn)咳作用。豬仔笠的提取物——化合物1能延長咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，具有良好的鎮(zhèn)咳作用。4.4化痰實驗本實驗采用酚紅氣管排泄法，利用酚紅至小鼠注射后可從氣管排泄的特點，測定氣管酚紅的排泄量，以判斷受試藥物對氣管分泌液量的影響。此法簡便，但用強堿洗出氣管內酚紅能損傷氣管粘膜。實驗結果表明，豬仔笠的提取物——化合物1明顯增加小鼠氣管酚紅排泌量，表明可促進腺體分泌，使痰液黏度下降而易于咳出，從而起到祛痰作用。1權利要求1、一種豬仔笠類黃酮提取物，其分子量為436，分子式為C26H28O6，具有下述結構的類黃酮化合物2、權利要求1自的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，包括如下步驟1)將豬仔笠塊根粉碎，用乙醇回流提取獲得乙醇提取液，將乙醇提取液減壓濃縮得浸膏，浸膏加入水混懸，用石油醚萃取得石油醚萃取液，石油醚萃取液減壓濃縮得石油醚浸膏；2)石油醚浸膏在溶劑體系為正己垸、醋酸乙酯、甲醇、水構成的色譜條件下經(jīng)過制備型HSCCC分離，形成色譜峰形，有組分1和組分2的色譜峰，組分l經(jīng)手工收集后，有黃色油狀物析出；3)黃色油狀物采用展開劑為石油醚和醋酸乙酯的薄層制備，得到黃色方晶的類黃酮化合物。3、根據(jù)權利要求2所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于所述的HSCCC分離的HSCCC溶劑體系以體積比計量范圍為正己烷醋酸乙酯甲醇水二36:36:58:24;周定相為上相；流動相為下相；HSCCC分離流速0.54.0mLniin";轉速6001200r*min";固定相的保留值不低于50%。4、根據(jù)權利要求2或3所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于用50HKF/。乙醇浸沒藥材且液面高出藥材0.5lem，在8095。C和常壓力下回流提取24次，合并乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入215倍量的水混懸，用0.52倍水的石油醚萃取512次，把合并512次萃取得到的石油醚萃取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏。5、根據(jù)權利要求2或3所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于展開劑為石油醚和醋酸乙酯，所述的石油醚與醋酸乙酯以體積比計量為4比1。6、根據(jù)權利要求3所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于所述的HSCCC分離的HSCCC溶劑體系以體積比計量為正己垸醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3;固定相為上相；流動相為下相；HSCCC分離流速2.0mL'min";轉速700r'min-、固定相的保留值不低于50%。7、根據(jù)權利要求4所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于用9095%乙醇在8285。C和常壓力下回流提取三次，合并三次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入35倍的水混懸，用0.51倍水的石油醚萃取810次，合并上述萃取得到的石油醚萃取液，旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏。8、權利要求1所述的豬仔笠類黃酮提取物，在制備抑菌、抗炎、止咳和化痰的藥物中的應用。9、權利要求1所述的豬仔笠類黃酮提取物，在制備防治金黃葡萄球菌的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬仔笠類黃酮提取物及其提取方法和應用，該豬仔笠類黃酮提取物其結構如右，本發(fā)明用傳統(tǒng)的溶劑回流提取方法，通過HSCCC與傳統(tǒng)的薄層層析制備相結合進行分離純化，首次從豬仔笠藥材石油醚部位分離得到新的化合物之一。本發(fā)明的豬仔笠類黃酮提取物具有抑菌、抗炎、止咳和化痰作用。文檔編號A61P31/04GK101671344SQ20091011241公開日2010年3月17日申請日期2009年8月24日優(yōu)先權日2009年8月24日發(fā)明者李凌峰,李宇翔,李清祿,黃美玲申請人:李清祿