專利名稱：：楮頭紅多糖在制備抗乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及楮頭紅多糖在制備抗乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。技術(shù)背景-乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)從發(fā)現(xiàn)至今已有四十余年。1963年，Blumberg等發(fā)現(xiàn)澳大利亞血友病患者血清中含有一種能與美國血友病患者血清起反應(yīng)的抗原，稱其為澳大利亞抗原(即乙型肝炎病毒表面抗原，HepatitisBVirusSurfaceAntigen,HBsAg)。1970年Dane等在乙肝病人血清中發(fā)現(xiàn)了42nm大小的HBV顆粒，其外膜成分中含有HBsAg，1986年國際病毒命名委員會正式將HBV歸為嗜肝DNA病毒科。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個世界性的健康問題，呈世界性分布，它不僅可以導(dǎo)致急、慢性HBV感染與75M—鄰y。的原發(fā)性肝癌相關(guān)。全球慢性HBV感染約有3.5億人，我國屬HBV感染的高流行區(qū)。據(jù)我國傳染病報告和疾病監(jiān)測統(tǒng)計，乙肝占急性肝炎病例的25%左右，與HBV感染有關(guān)的肝病死亡率約23/10萬，其中肝癌死亡率約13/10萬，乙肝對人類健康危害最為嚴(yán)重，是我國最重要的公共衛(wèi)生問題之一。由一些數(shù)據(jù)估計，我國慢性無癥狀HBV攜帶者(人30超過1.2億，占全世界HBV感染的1/3，其中慢性乙型肝炎有3000萬人，先、現(xiàn)患率約為2770/10萬，這些患者10%—30%可發(fā)展為肝硬化，一部分可進(jìn)一步發(fā)展為肝癌，累計現(xiàn)行的和既往的，我國已有一半以上人口經(jīng)受HBV感染，所以慢性乙肝的治療是亟待解決的問題。目前臨床上用于治療HBV感染的藥物除干擾素(Interferon,IFN)夕卜，還有少數(shù)天然藥物及眾多化學(xué)合成藥物如核苷類似物阿糖腺苷(adeninearabinside，Ara-A)、拉米夫定(lamivudine)、泛昔洛韋(famciclovir)、阿地凈畐韋(adefovir)、恩他卡韋(ontacavir)等。這些藥物已在實驗室和臨床應(yīng)用中證實能顯著抑制HBVDNA的復(fù)制或抑制HBsAg、HBeAg的表達(dá)與分泌。然而這些藥物卻存在一定的不足，干擾素的缺點主要表現(xiàn)在①價格昂貴；②注射制劑；③對患者的選擇有嚴(yán)格的限制性；④明顯的不良反應(yīng)，如發(fā)熱、血小板減少、暫時性脫發(fā)等；⑤在失代償性肝病患者中應(yīng)用有一定的風(fēng)險。核苷類藥物的不足表現(xiàn)在①需要長期治療；②耐藥性病毒變異的發(fā)生率高；③停藥后發(fā)生ALT反跳，甚至發(fā)生重癥肝炎。上述的種種不足都使得臨床應(yīng)用受到了極大的限制。因此，尋找和開發(fā)無污染、低毒副作用、價格低廉、安全有效的新型抗HBV藥物具有十分重要的理論、經(jīng)濟(jì)和社會意義。隨著天然植物及其提取物或有效成分抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，天然藥物具有對人體低毒副作用，不易產(chǎn)生耐藥性等顯著特點。針對目前病毒性肝炎治療中的困難，尋找與證實有效天然藥物已經(jīng)成為臨床治療病毒性肝炎的希望與重要手段。傳統(tǒng)中草藥品種繁多，已廣泛應(yīng)用于臨床治療慢性乙型肝炎并取得一定療效，積累了豐富的臨床經(jīng)驗，但中草藥抗HBV的作用機(jī)理還有待于深入研究，所以篩選中草藥抗HBV這方面的工作尚有很大的潛力；而且傳統(tǒng)中草藥不良反應(yīng)少，價格低，曰益受到國內(nèi)外研究者的普遍重視，尋求有抗病毒作用的天然藥物是當(dāng)前研究的熱點。目前國內(nèi)外對天3然藥物生物活性與功能的研究已發(fā)展為研究與分析天然藥物的活性部位、活性成分及至活性成分的結(jié)構(gòu)或構(gòu)型，以進(jìn)一步明確藥物的作用機(jī)理，真正實現(xiàn)"天然藥物現(xiàn)代化"這一目標(biāo)。如美國Holk等在天然植物茜草抗HBV作用的深入研究中，發(fā)現(xiàn)其抑制HBsAg、HBeAg表達(dá)的具體有效成分為三種奈-氫醌化合物。日本學(xué)者Nin等研究證明治療肝炎的傳統(tǒng)藥物甘草中起免疫調(diào)節(jié)作用的成分為一種糖類(甘草甜素)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供楮頭紅多糖在制備抗乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用，以及楮頭紅多糖在制備保肝護(hù)肝保健品中的應(yīng)用本發(fā)明所述的楮頭紅多糖，是由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3個單糖組成，所述的鼠李糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為U.6:16.4:28.6,多糖分子量為848180(1]。該多糖未有文獻(xiàn)報道具有抗乙肝病毒作用。本發(fā)明所述的楮頭紅多糖的提取工藝為現(xiàn)有技術(shù)，具體為1)脫脂、除小分子單糖楮頭紅全草蒸餾水洗滌去土，4fTC低溫干燥。稱取干燥過的草藥250g粉碎，用石油醚8(TC回流脫脂2次，之后用95%的乙醇回流除小分子單糖，濾渣揮去酒精備用。2)在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗得出最佳提取工藝溫度為100°C，固液比為1:60，時間為2.5h;提取三次，醇沉?xí)r加入四倍量乙醇靜置過夜；3)除蛋白，用Sevag法脫蛋白氯仿正丁醇=4:1，濃縮液和混合液的體積比為3:1或者直接加入1/25倍的正丁醇，1/5倍的氯仿混合攪拌2030min，充分靜止分層除去白色沉淀，數(shù)次后直至界面無白色沉淀。4)脫色、除雜，除蛋白后的多糖溶液加入0.2%的活性炭進(jìn)行脫色，6(TC保溫30min(此過程中不斷攪拌)，過濾取濾液；將濾液放入-4(TC冰箱過夜，第二天取出自然融化后5000轉(zhuǎn)離心去除不溶物，將上清液反復(fù)凍融直至沒有沉淀離出為止。濾液中加入4倍量的無水乙醇，靜止12h后離心(3000r/min)取沉淀，沉淀依次用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重復(fù)三次，醇沉洗滌后濾渣加適量蒸餾水，充分復(fù)溶后透析，透析在磁力攪拌下進(jìn)行，樣品液與透析液(蒸餾水)體積比為1:20，4h換一次水，透析48h。檢測透析液中離子濃度，透析完畢后將糖溶液放入冷凍干燥機(jī)中干燥，多糖含量在95%以上，純度符合生物活性試驗要求，可直接用于下述的抗病毒活性試驗，樣品也可干燥后密封保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的優(yōu)點是1、楮頭紅多糖目前未有報道具有抗乙肝病毒作用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)楮頭紅多糖能作為抗乙肝病毒藥物，此藥物其最大優(yōu)點是天然產(chǎn)物，與現(xiàn)有抗病毒藥相比，毒副小，無不良反應(yīng)，且還有抗氧化、提高機(jī)體免疫力等作用，可長期使用；2、與直接使用中草藥相比，楮頭紅多糖作為具體化學(xué)組分的物質(zhì)直接作為抗病毒的藥效成分，用藥量少，無其它非藥用組分，因而能減少其它成分可能對肌體的傷害(副作用)，臨床用藥簡單；3、楮頭紅中多糖含量高(15-17%),開發(fā)價值高，生產(chǎn)方便，工藝簡單。具體實施方式-下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明天然藥用植物多糖的提取常常采用水、鹽、酸、堿和酶來提取，得到的提取液用乙醇沉淀回收，在這一過程中一部分雜質(zhì)(如色素、單糖、寡糖)得以去除，所得多糖再經(jīng)過去蛋白、脫色可得到粗多糖。影響多糖提取的因素有很多，如提取溶劑、溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)等。不同的藥材提取多糖的工藝大體相似，但影響因子會有所差別，故需要進(jìn)行提取工藝研究，以獲取較高提取率。本發(fā)明根據(jù)本課題組之前研究的多糖的提4取工藝{2]，利用經(jīng)典水提醇沉的方法提取楮頭紅多糖。第一部分楮頭紅多糖的提取分離1111材料與方法i.i材料l丄i主要儀器和設(shè)備表l-i主要儀器和設(shè)備儀器名稱生產(chǎn)廠家1600分光光度計北京瑞牙分析儀器廠RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠磁力攪拌器上海淀久中藥機(jī)械廠電熱干燥箱上海陽光實驗儀器有限公司HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋上海國華儀器設(shè)備有限公司粉碎機(jī)上海淀久中藥機(jī)械廠高速冷凍離心機(jī)上海安亭儀器廠電熱鼓風(fēng)干燥箱上海陽光實驗儀器有限公司BS210S型微量分析天平北京塞多利斯天平有限公司超聲清洗儀(0.22pm)昆山市超聲儀器有限公司超低溫冰箱(EVT-13-85)Sanyo蒸鎦水器上海亞榮生化儀器廠冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司25cn^—次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶GreinerLabortechniklnc'Germany2ml凍存管GreinerLabortechniklnc'Germany可調(diào)式移液器上海雷勃分析儀器有限公司酸度計上海天達(dá)儀器有限公司低速大容量離心機(jī)上海安亭儀器廠1.1.2主要材料和試劑表1-2主要材料和試劑名稱屬性楮頭紅購自三明和漳州的天然藥用植物，經(jīng)福建中醫(yī)研究院鑒定透析袋分子截留量3500石油醚AR，沸程609(TC95%乙醇ARAR乙醚AR丙酮AR98%濃硫酸AR苯酚AR氯仿AR三氯乙酸AR正丁醇AR乙酸乙酯AR碘AR活性碳新華中速濾紙快速1.2方法1.2.1楮頭紅多糖的提取分離1.2.1.1材料的預(yù)處理楮頭紅全草蒸餾水洗滌去土，4(TC低溫干燥。稱取干燥過的草藥250g粉碎，用石油醚80'C回流脫脂2次，之后用95%的乙醇回流除小分子單糖，濾渣揮去酒精備用。1.2.1.2楮頭紅粗多糖的提取在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗得出最佳提取工藝。1.2.1.3除蛋白用Sevag法脫蛋白氯仿正丁醇=4:1,濃縮液和混合液的體積比為3:i或者直接加入l/25倍的正丁醇，1/5倍的氯仿混合攪拌20~30min，充分靜止分層除去白色沉淀，數(shù)次后直至界面無白色沉淀。1.2.1.4脫色、除雜除蛋白后的多糖溶液加入0.2%的活性炭進(jìn)行脫色，6(TC保溫30min(此過程中不斷攪拌)，過濾取濾液；將濾液放入-40'C冰箱過夜，第二天取出自然融化后5000轉(zhuǎn)離心去除不溶物，將上清液反復(fù)凍融直至沒有沉淀離出為止。1.2.2.5分離濾液中加入4倍量的無水乙醉，靜止12h后離心(3000r/min)取沉淀，沉淀依次用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重復(fù)三次。醇沉洗滌后濾渣加適量蒸餾水，充分復(fù)溶后透析，透析在磁力攪拌下進(jìn)行，樣品液與透析液(蒸餾水)體積比為1:20，4h換一次水，透析48h。檢測透析液中離子濃度，透析完畢后將糖溶液放入冷凍干燥機(jī)中干燥，干燥后樣品密封保存?zhèn)溆谩?.2.3楮頭紅多糖含量測定方法楮頭紅多糖含量測定采用硫酸-苯酚法。2結(jié)果與分析2.1多糖的提取工藝經(jīng)正交試驗得出最佳提取工藝溫度為100。C，固液比為l:60，時間為2.511;提取三次，醇沉?xí)r加入四倍量乙醇靜置過夜；2.2多糖的精制從各植物中提取的粗多糖經(jīng)除蛋白、脫色、透析等精制處理，精品經(jīng)平行測定5次，取平均值，計算含量。結(jié)果楮頭紅多糖純度295%可用于生物活性試驗。2.3多糖的分子結(jié)構(gòu)[11經(jīng)精制后的多糖再進(jìn)行糖柱純化，可得到純度為98%以上的多糖，用于分子結(jié)構(gòu)分析。經(jīng)分析楮頭紅多糖的理化特征和分子結(jié)構(gòu)信息純化多糖為白色絮狀物；易溶于熱水冷水，不溶于高濃度的乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、異丙醇；經(jīng)元素分析、紅外和紫外綜合分析表明多糖中沒有N、S元素存在，^l酸基分析表明不含硫酸根，應(yīng)為不含硫的非氨基糖，分子量為848180。經(jīng)化學(xué)定性和NMR譜分析多糖含有糖醛酸,經(jīng)薄層和氣相色譜分析，多糖由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3個單糖組成，鼠李糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為11.6:16.4:28.6,是一種雜多糖。經(jīng)NMR等分析，多糖主鏈以P—型糖苷鍵連接為主，少量a—型糖苷鍵，其具有螺旋空間結(jié)構(gòu)。第二部分楮頭紅多糖體外抗乙肝病毒研究本試驗采用目前應(yīng)用最廣泛的體外抗乙肝病毒藥物篩選模型HepG2.2.2.15細(xì)胞模型，從楮頭紅中提取分離得到的多糖與HepG2.2.2.15細(xì)胞作用，取其細(xì)胞上清液，分別測定其乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的滴度變化，來判斷該藥物是否有效，并采用MTT法測定各部分的細(xì)胞毒性。綜合這二個指標(biāo)，對楮頭紅多糖進(jìn)行體外抗乙肝藥效學(xué)試驗，并選用臨床上已證實的具有抗乙肝病毒作用的阿昔洛韋(ACV)作為陽性對照藥物，以評價多糖抗乙肝病毒的效果。l.實驗材料1.1細(xì)胞株乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(HepG2)的2.2.15細(xì)胞系，美國McmrrtSinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)并保藏。弓l進(jìn)后自進(jìn)行傳代培養(yǎng)。置5。/。C02培養(yǎng)箱，37。C培養(yǎng)。培養(yǎng)基為DMEM，添加10%的胎牛血清，加入200mg/ml的G418。1，2試驗藥物楮頭紅各個提取部位及多糖樣品(純度)、陽性對照藥物阿昔洛韋(ACV)用DMSO適量溶解后，DMEM稀釋配制成各濃度(表中劑量為終濃度，為配置時濃度的1/2)，4'C冰箱保存?zhèn)溆?臨用前經(jīng)0.22pm濾膜濾過)。1.3主要試劑表2-l主要試劑名稱生產(chǎn)廠家MTT(Thiazolylblue)Duchefa產(chǎn)品DMEM培養(yǎng)基GIBCO公司胎牛血清GIBCO公司0.25%胰蛋白酶Amresco公司L-谷氨酰胺Amresco分裝G418Promega分裝青霉素、鏈霉素華北制藥廠產(chǎn)品二甲基亞砜Sigma公司HBsAgELISA檢測試劑盒上?？迫A生物工程公司HBeAgELISA檢測試劑盒上?？迫A生物工程公司聚乙二醇PEG(8000)Sigma公司分裝1.4儀器和設(shè)備7表2-2主要儀器和設(shè)備儀器名稱生產(chǎn)廠家超凈工作臺蘇凈集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司水套式C02培養(yǎng)箱德國MEMMERT公司熒光倒置顯微鏡德國Leica公司酶標(biāo)測試儀Perkin-ElmerCorporation.AmericaHH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋上海國華儀器設(shè)備有限公司高壓蒸汽滅菌鍋上海醫(yī)療器械制造廠高速冷凍離心機(jī)上海安亭儀器廠電熱鼓風(fēng)干燥箱上海陽光實驗儀器有限公司BS210S型微量分析天平北京塞多利斯天平有限公司微孔濾膜(0.22nm)天津市瑞森特儀器儀表商行超低溫冰箱(EVT-13-85)Sanyo96孔細(xì)胞培養(yǎng)板GreinerLabortechniklnc-Germany24孔細(xì)胞培養(yǎng)板GreinerLabortechniklnc-Germany250112—次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶GreinerLabortechniklnc.Germany2ml凍存管GreinerLabortechniklnc.Germany可調(diào)式移液器上海雷勃分析儀器有限公司酸度計上海天達(dá)儀器有限公司低速大容量離心機(jī)上海安亭儀器廠1.5主要試劑的配制1.5.1DMEM培養(yǎng)基配制每升DMEM培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入DMEM培養(yǎng)基干粉13.39克NaHC033.7克HEPES3.5克充分?jǐn)嚢枞芙夂?，定容至lOOOml，用5%NaHC03調(diào)PH值至7.2，微孔濾膜(0.22膽Q)無菌過濾后4'C貯存。1.5.2血清購得的胎牛血清56'C滅活30min，分裝后-2(TC貯存。1.5.3化02"/。EDTA溶液EDTA.4Na200mg無Ca2+、Mg"的PBS加至1L用5%NaHC03或1NHCL調(diào)PH值至7.2，高壓消毒滅菌(121'C;15min),分裝小瓶于4"C貯存。1.5.40.04mol/L鹽酸異丙醇異丙醇300ml濃鹽酸lml混勻后分裝小瓶于4'C貯存。81.5.53%L-谷氨酰胺溶液(100倍濃度)谷氨酰胺2.922克去離子水加至100ml充分?jǐn)嚢枞芙夂?，微孔濾膜(0.22&!11)無菌過濾，分裝小瓶，后-20'C貯存。1.5.6G418溶液(20000ug/ml，100倍濃度)G418100mg生理鹽水5ml充分溶解后，過濾除菌，于4'C貯存。1.5.7青霉素、鏈霉素溶液(IOO倍濃度)青、鏈霉素1.0xl06IU生理鹽水加至100ml過濾除菌，分裝小瓶，-201:貯存，用時每100ml溶液加此溶液lml。1.5.8MTT溶液<5mg/ml)MTT5mg培養(yǎng)液(無血清、酚紅)或生理鹽水lml微孔濾膜(0.22jxm)無菌過濾，于4i:避光保存，可使用2周，若暫不用，先凍存。1.5.9凍存液二甲基亞砜(DMSO)—份培養(yǎng)液九份現(xiàn)用，或配制后放入普通冰箱冰盒內(nèi)保存，使用前于室溫下水浴溶解。2.實驗方法2.1細(xì)胞的復(fù)蘇基本步驟調(diào)配37-C"4(TC的溫水；從液氮罐中取出HepG2.2.2.15細(xì)胞凍存管，立即投入37'C^4(TC的溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解，融解過程在l-2min內(nèi)完成；將細(xì)胞凍存懸液移入離心管，加入約5mi培養(yǎng)液，輕輕吹勻；將細(xì)胞懸液800r-1000r/min離心5min，棄上清液；給細(xì)胞沉淀加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸打勻，將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶，加足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，置于37'C，5%002細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2.2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)HepG2.2.2.15細(xì)胞置于5。/。C02,37。C培養(yǎng)。培養(yǎng)基為DMEM，添加10%的胎牛血清，3。/。L-谷氨酰胺P/。，G418200ug/ml，青霉素100u7ml，鏈霉素100u/ml。2.2.15細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，先用EDTA消化10-30秒，再用0.25y。胰酶37'C消化3-10min,加培養(yǎng)液吹打，h3或1:4傳代，8天長滿，采用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)，配制成10S個/ml接種細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔板每孔0.1ml;24孔板每孔lml，5%C02，37。C培養(yǎng)24小時進(jìn)行實驗。2.3細(xì)胞計數(shù)方法一般用血細(xì)胞計數(shù)板，按白細(xì)胞計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)。取待稀釋的細(xì)胞懸液lml加生理鹽水做5倍稀釋，用10x10的倍數(shù)進(jìn)行計數(shù)，中央為紅細(xì)胞計數(shù)用，西角大格為白細(xì)胞計數(shù)用，計數(shù)時僅統(tǒng)計完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞按一個細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，在一個方格中，如果有細(xì)胞位于線上，一般計上線不計下線，計左線不計右線，計數(shù)誤差不超過±5%，計數(shù)后需計算每ffll懸液中的細(xì)胞數(shù)，由于計數(shù)板中的每一方格的面積為O.lcm2，高為0.01cm，體積為0.0001em3。每ml細(xì)胞數(shù)按式1計算每ml細(xì)胞數(shù)-(n/4)x10000x5(1)式中n為四大格細(xì)胞總數(shù)2.4MTT比色法測細(xì)胞存活率HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，每孔80pl培養(yǎng)液；加入20plMTT，繼續(xù)培養(yǎng)3-4h;吸去10(Hil培養(yǎng)液，加入等量0.04-0.lmol/L鹽酸異丙醇溶液，室溫下約10min(或?qū)⑵桨逯糜谖⑿驼鹗幤髡鹗?，使結(jié)晶物溶解；在酶標(biāo)儀上測定光吸收，測定波長為570nm。2.5MTT法測藥物毒性將HepG2.2.2.15細(xì)胞按l()S個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，0.1ml/孔，次日用培養(yǎng)液將待測藥物分別配成幾種不同的濃度，加入細(xì)胞孔，每孔濃度加3孔，(Umi/孔，并設(shè)無藥細(xì)胞對照及陽性對照藥。加藥后培養(yǎng)4天，棄上清用MTT染色，每孔加lmg/ml的MTT無血清培養(yǎng)液0.1ml，孵育4小時，棄上清，加入0.04mol/L鹽酸異丙醇0.1ml溶解后，用570nm波長比色測定OD值，實驗重復(fù)3次。2.6測HBsAg、HBeAg分泌規(guī)律將HepG2.2.2.15細(xì)胞l()S/ml接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔l.Oml，共10孔，第3、5、8、11、13夭收集上清25(Hil，培養(yǎng)液補足原量至第13天，培養(yǎng)上清于-2(TC凍存，最后集中按試劑盒說明書，用ELISA法測定HBsAg、HBeAg。2.7藥物對HBV抑制試驗將1^02.2.2.15細(xì)胞按10"ml接種于24孔板，每孔l.Oml，次日棄培養(yǎng)、液，以待測藥物的HepG2.2.2.15組胞的半數(shù)毒性濃度為起始濃度用培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，另設(shè)無藥對照及陽性對照藥，培養(yǎng)于37t:、5%(:02培養(yǎng)箱中。每4天收取上清，并換加原濃度藥液繼續(xù)培養(yǎng)，將收集的上清-20'C凍存，于第12天收集完，集中用ELISA法測定HBsAg、HBeAg，實驗重復(fù)3次。2.8ELISA法測冊sAg、HBeAg(1)將試劑盒各組分從盒中取出，平衡至室溫U825'C)。(2)濃縮洗滌液配制前充分搖勻如有晶體應(yīng)充分融解，濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水按l:19稀釋后使用。(3)將微孔板條周定于支架，按序編號。(4)每孔加入待測標(biāo)本50pl，設(shè)陰、陽對照各2孔，每孔加入陰、陽對照各50Ml，并設(shè)空白對照一孔；(5)每孔加入酶標(biāo)記抗體50ni(除空白對照外)、充分混勻后封板，置于37'C環(huán)境中孵育30min;(6)手工洗板；棄去孔內(nèi)液體，洗滌液貯滿各孔，靜置5秒后甩干，重復(fù)5次后拍干；(7)每孔加顯色劑A液、B液各50W，充分混勻，封板，置37-C環(huán)境中孵育15min;(8)每孔加入終止液50pl，混勻；(9)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm，先用空白空校零。然后讀取各孔OD值。(陰性對照OD值低于0.05作為0.05計算，高于0.05按實際OD值計算。)2.9數(shù)據(jù)分析2.9.1MTT法測藥物毒性后可得10細(xì)跑左、法重~、給藥組o^Kt-空白對照ODII細(xì)胞存活率")=細(xì)胞對照0灘—空白對照0灘(2)根據(jù)Red-Meuench法計算半數(shù)有毒濃度TC5o可得50-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率TCjo=顛log(5+:,么:,力、^xC(3)式中b——1og〈50y。藥物濃度A——log>50%藥物濃度C~~A-B2.9.2采用ELISA法，顯色反應(yīng)完成后用自動酶標(biāo)儀讀取OD值，計算抑制率，以抑制率大于50%為有抑制作用。根據(jù)測定數(shù)據(jù)計算藥物抑制抗原百分率[公式(4)];藥物抑制抗原半數(shù)有效濃度ICsc[公式(5)]，即HBsAg和HBeAg抑制率為50%時的藥物濃度；選擇治療指數(shù)TI[公式(6)]，TI大于1以上者為有效，在12之間說明藥物有效，但有一定毒性；大于2則效果較好，毒性較小；指數(shù)越大，則療效越好，安全范圍越大。統(tǒng)計學(xué)處理，采用t檢驗作組間均數(shù)比較，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析由SPSS11.5軟件處理，PO.05表示差異有顯著性。藥物對抗原，摔私)=:::_::^藤W『^,i50-<50%抑制百分率""、IC50=顛10妙+>50%抑制百分率—<黑抑制百分率xC。)式中b——1<^<50%藥物濃度A——1<^>50%藥物濃度C——A-B治療指數(shù)(Ti)=fii§§§(6)半數(shù)有效濃度3.結(jié)果分析3.1HepG2.2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的規(guī)律在試驗方法所述的培養(yǎng)條件下，本試驗所用的HepG2.2.2.15細(xì)胞于第3天開始測到有HBsAg、HBeAg分泌，在第8天達(dá)到高峰，以后逐漸減弱，持續(xù)到第13天。3.2陽性藥物(ACV)的體外抗乙肝病毒試驗結(jié)果3.2.1陽性藥物(ACV)對HepG2.2.2.15細(xì)胞的毒性不同濃度ACV處理培養(yǎng)后，MTT試驗結(jié)果顯示對HepG2.2.2.15細(xì)胞生長有抑制作用，且其作用具有一定的濃度依賴性，濃度越大，抑制作用越明顯。在濃度為0.3125mg/ml時的細(xì)胞抑制率為3.51%，此濃度下的細(xì)胞存活率為96.49%(>95%)，由此可知ACV的TCo為0.3125mg/mi。根據(jù)公式〈3)可得TCso為4.56mg/mi。ACV的細(xì)胞毒性測定結(jié)果見表2-3。表2-3ACV在HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中的毒性11分組OT^，n倌八土"抑制率O)TC50(mg/ml)TC0(mg/ml)細(xì)胞對照組1.25±0.04空白對照組0.11±0.03ACV(mg/ml)10.00.28±0.0485.095.000.48±0.0666.674.560.31252.500.64±0.0453.511.250.91±0.0228.950.6251.07±0.0315.790.3121.20±0.033.510.1561.24±0.040.093.2.2陽性藥物(ACV)抑制H印G2.2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的作用不同濃度ACV處理培養(yǎng)4天和8天后收集細(xì)胞上清液，ELISA法測HBsAg、HBeAg水平顯示ACV對HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且隨著ACV濃度的增加，其抑制作用增強(qiáng)，抑制率增加，顯示出一定的量效關(guān)系。并且隨著培養(yǎng)時間的推移抑制作用也逐漸增強(qiáng)。不同濃度ACV在HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBsAg、HBeAg的抑制作用結(jié)果見表2-4和2-5表2-4ACV在HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBsAg的抑制作用分組第4天第8天抑制率(％)OD柳值(^)抑制率(％)細(xì)胞對照組1.13±0.031.54±0.02空白對照組0.03±0.010.05±0.01ACV(mg/ml)10.00.15±0.0189.010.17±0.0291.955.000.25±0.0280.000.3歸.0283.222.500.36±0.0370.000.45±0.0273.151.250.52±0.0455.460.61±0.0462.420.6250.66±0.0242.7353.700.3120.73±0.0336.360.94±0.0540.270.1560.85±0.0325.451.12±0.0228.19表2-5ACV在HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBeAg的抑制作用12分組第4天第8天OD450值(由)抑制率(％)OD45。值(出)抑制率(％)細(xì)胞對照組0.58±0.020.76±0.03空白對照組0.04±0.010.05±0.01ACV(mg/ml)10.00.10±0.0288.89O.ll士O.Ol91.545.0074.070.19±0.{)480.282.500.21±0.0268.520.25±0.0271.831.250.28±0.0155.56O息O.Ol64.790.6250.34±0.0544.440.39±0.0452.110.3120.42±0.0429.630.51±0.0535.210.1560.49±0.0316.670.59±0.0423.943.2.3陽性藥物(ACV)體外抗乙肝病的治療指數(shù)(TI)根據(jù)公式(5)，我們可以得到ACV在第8天抑制HepG2.2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的時的ICso分別為0.58mg/ml和0.49mg/ml。根據(jù)公式(6)可以得到ACV對HBsAg、HBeAg的治療指數(shù)TI分別為7.86和9.31。具體結(jié)果見表2-6。表2-6ACV在H印G2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBsAg和HBeAg的IC5o和TITC50(mg/ml)HBsAgHBeAgIC50(mg/ml)TIIC50(mg/ml)TI4.560.587.860.499.313.6楮頭紅多糖的體外抗乙肝病毒作用3.6.1楮頭紅多糖對1^02.2.2.15細(xì)胞的毒性不同濃度楮頭紅多糖處理組培養(yǎng)后，MTT試驗結(jié)果顯示對HepG2.2.2.15細(xì)胞生長有抑制作用，且其作用具有一定的濃度依賴性，濃度越大，抑制作用越明顯。在濃度為3.12mg/mi時的細(xì)胞抑制率為1.52%，此濃度下的細(xì)胞存活率為98.48%(>95%)，由此可知楮頭紅多糖的TCo為3.12mg/ml。根據(jù)公式1-2可得TC5C)為45.41mg/ml。楮頭紅多糖的細(xì)胞毒性測定結(jié)果見表2-7。表2-7楮頭紅多糖在11卬02.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中的毒性分組OD^倌(；士"抑制率(％)TC50(mg/ml)TC0(mg/ml)細(xì)胞對照組1.50±0.08空白對照組0.18±0.02SWP(mg/ml)1000.22士0.0496.9750,00.55±0.0371.9745,413.1225.00.99±0.0438.6312.51.29±0.0615.916.251.40±0.047.573.121.48±0.031.521.561.62±0.05-9.093.6.2楮頭紅多糖抑制H印G2.2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的作用不同濃度楮頭紅多糖處理培養(yǎng)4天和8天后收集細(xì)胞上清液，ELISA法測HBsAg、HBeAg水平顯示楮頭紅多糖對HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且隨著楮頭紅多糖濃度的增加，其抑制作用增強(qiáng)，抑制率增加，顯示出一定的量效關(guān)系。并且隨著培養(yǎng)時間的推移抑制作用也逐漸增強(qiáng)。不同濃度楮頭紅多糖在HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBsAg、HBeAg的抑制作用結(jié)果見表2-8和2-9表2-8楮頭紅多糖在HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBsAg的抑制作用分組第4天第8天OD450值。土S)抑制率(％)OD45。值(X土"抑制率(％)細(xì)胞對照組0.97±0.041.63空白對照組0.02±0,010.05SWP(mg/ml)1000.24±0.0276.840.13±0.0394.9450.00.37±0.0363.160.27士0.0586.0825.00.43±0,0156.840.39±0.0378.4812.50.56±0.0243.160,51±0.0570.896.250.67±0.0331.580.73±0.0456.963.120.74±0.0524.211.06±0.0636.081.560.86±0.0411.581.23±0.0425.32表2-9楮頭紅多糖在HepG2.2.2.i5細(xì)胞培養(yǎng)中對HBeAg的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>病毒性肝炎抗病毒藥物的開發(fā)和評價中的重要環(huán)節(jié)之一就是建立一種方便有效的體內(nèi)外模型。HBV-DNA體外轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.2.15能表達(dá)的全部病毒標(biāo)記包括HBsAg、HBeAg和HBV-DNA等，伺對在該細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解物中證實有完整乙型肝炎病Dane毒顆粒存在。該細(xì)胞系的建立為研究體外抗HBV藥物的初步篩選提供了理想的模型。HBsAg和HBeAg檢測簡便、經(jīng)濟(jì)、快速，其表達(dá)水平的高低可反映病毒復(fù)制情況；HBV-DNA則是觀察病毒感染復(fù)制的最靈敏、最直接的金標(biāo)準(zhǔn)。因此，HepG2.2.2.15是應(yīng)用最為廣泛的體外抗HBV藥物篩選的理想模型。利用細(xì)胞模型進(jìn)行藥物活性篩選時，首先必須確定藥物對細(xì)胞的毒性。目前實驗室常用的細(xì)胞毒性檢測方法有MTT法、臺盼藍(lán)染色法、細(xì)胞形態(tài)觀察法等。MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。MTT法的原理是在一定濃度下(在培養(yǎng)液中的終濃度為0.5mg/ml)，細(xì)胞可攝取MTT，并被線粒體脫氫酶(主要是琥珀酸脫氫酶)氧化為藍(lán)紫色甲臜顆粒，各孔顆粒產(chǎn)生量與活細(xì)胞數(shù)成正比，該顆粒可用溶解液將其溶解，然后進(jìn)行比色定量比較。但MTT反應(yīng)需要4h，不適于檢測藥物的急性毒性作用；而且結(jié)果需進(jìn)行比色測定，亦不適用于原藥顏色較深的藥物。實驗中容易產(chǎn)生誤差的因素有MTT法中形成的不溶性的結(jié)晶ibrmazan溶解不徹底；MTT作用后去上清操作時有可能帶走小部分的formazan，故有時重復(fù)性略差?；谄潇`敏度高、操作簡便且經(jīng)濟(jì)的特點，本試驗亦釆用了MTT法迸行細(xì)胞毒性檢測，結(jié)果顯示楮頭紅多糖HepG2.2.2.15細(xì)胞的最大無毒濃度(TCo)分別為3.12mg/ml;半數(shù)有毒濃度(TC5o)分別為45.41mg/ml，毒性較小。本研究選用阿昔洛韋作為陽性對照藥，阿昔洛韋是目前國內(nèi)外臨床治療乙型肝炎較為有效的藥物。阿昔洛韋作用的靶位，是抑制HBV聚合酶，從而導(dǎo)致抑制HBV-DNA合成，中止DNA鏈的延伸，抑制病毒復(fù)制和繁殖。阿昔洛韋進(jìn)入體內(nèi)后轉(zhuǎn)化為三磷酸，作用于聚合酶反轉(zhuǎn)錄區(qū)，抑制聚合酶活性，從而抑制前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA負(fù)鏈，阻斷新合成HBV-DNA的鏈化，限制HBV的復(fù)制。Ying等研究認(rèn)為，阿昔洛韋對HepG2.2.2.15細(xì)胞內(nèi)的HBV-DNA復(fù)制有明顯的抑制作用，有效濃度范圍0.008pg/ml-5ng/ml，其中濃度為5pg/ml時抑制作用最明顯。徐偉等研究發(fā)現(xiàn)，阿昔洛韋(lmg/ml)在體外培養(yǎng)的HepG2.2.2.15細(xì)胞中具有直接抑制細(xì)胞抗原分泌的作用并達(dá)到有效抑制率(>50%)。本文結(jié)果顯示，阿昔洛韋在L25mg/ml時對HBsAg和HBeAg分泌的抑制率均達(dá)到50%以上。以上結(jié)果與國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果基本一致，證實了本研究中方法和技術(shù)的可信性和可靠性。藥物作用指標(biāo)的選擇與分析在藥物研究中起關(guān)鍵作用。HBsAg和HBeAg為HBV分泌至HepG2丄2.15細(xì)胞細(xì)胞上清液中的可溶性蛋白質(zhì)，可間接反映HBV的復(fù)制清況，且檢驗簡便、經(jīng)濟(jì)，故一直被作為抗HBV藥物研究的重要指標(biāo)。對HBsAg、HBeAg的檢測方法有對流免疫電泳、反相對血凝抑制、放射免疫技術(shù)及ELISA技術(shù)。與前三種方法相比，ELISA技術(shù)操作簡便、快速、無放射線污染，且結(jié)果清晰，具有高度特異性、敏感性和可重復(fù)性，已被廣泛應(yīng)用于HBV抗原的檢測。本試驗也采用此技術(shù)分析了楮頭紅各個部位萃取物在HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBsAg、HBeAg的抑制作用，結(jié)果顯示楮頭紅多糖在無毒濃度下設(shè)定的7個濃度中，除最低濃度外，其它各濃度組與細(xì)胞對照組相比均顯示明顯的抑制作用，且隨著楮頭紅多糖濃度的增加，其抑制作用增強(qiáng)，抑制率增加，顯示出一定的量效關(guān)系。目前臨床上用于評價藥物的治療效果指標(biāo)為治療指數(shù)(TI)，當(dāng)TK1時為藥物無效，當(dāng)KTK2時藥物低效有毒，當(dāng)TI>2時藥物有效低毒。由此可知，楮頭紅多糖對HBsAg、HBeAg的治療指數(shù)有效低毒(TI分別為11.89和3.11);陽性對照藥物阿昔洛韋對HBsAg、HBeAg的治療指數(shù)有效低毒(TI分別為7.86和9.31)。綜上所述，楮頭紅多糖在HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBsAg、HBeAg均有一定的抑制作用，但本研究結(jié)果僅是揭示了楮頭紅多糖在HepG22.2.15這一細(xì)胞模型上對HBsAg、HBeAg的抑制作用，而在HBV臨床感染中，受感染肝細(xì)胞HBV-DNA的復(fù)制、HBsAg及HBeAg合成均受到機(jī)體免疫功能狀態(tài)及多種病理狀態(tài)的影響，其變化比體外細(xì)胞水平研究要復(fù)雜得多。因此，要進(jìn)一步證實楮頭紅多糖抗病毒作用還須結(jié)合體內(nèi)實驗來確定，其作用機(jī)制也有待于進(jìn)一步研究?？偨Y(jié)1、優(yōu)化的天然藥用植物多糖水提醇沉工藝簡便，合理，可行。水提最佳工藝條為溫度為100。C，固液比為l:60，時間為2.5h;提取三次，醇沉?xí)r加入四倍量乙醇靜置過夜。2、楮頭紅對HepG2.2.2.15細(xì)胞抑制作用的有效成分之一為多糖，這種多糖可以抑制HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的復(fù)制，具有一定的體外抗HBV活性。本研究為進(jìn)一步深入研究植物的抗乙肝病毒生物活性奠定了實驗基礎(chǔ)，亦為高效低毒的抗藥物篩選、臨床應(yīng)用提供了一個新的選擇。3、多糖抗HBV作用還須進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)實驗來確定，其抗HBV的作用機(jī)制也有待于更深入的研究。第三部分楮頭紅多糖的體內(nèi)抗病毒作用應(yīng)用實例I楮頭紅多糖的抗鴨乙型肝炎病毒作用鴨乙型肝炎病毒(DHBV)與人乙型肝炎病毒(HBV)同屬嗜肝DNA病毒科，兩者的病毒大分子結(jié)構(gòu)與復(fù)制有很多相似之處。先天感染DHBV的鴨因其病毒血癥持續(xù)時間較長且較穩(wěn)定，無明顯的自然轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象，是研究人類乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、病毒復(fù)制過程及篩選有效治療藥物的理想動物模型3。楮頭紅多糖是由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3個單糖組成，鼠李糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為11.6:16.4:28.6，分子量為848180[1]。由藥用植物楮頭紅經(jīng)人工提取、加工而成。具有抑制HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的復(fù)制，具有一定的體外抗HBV活性和提高免疫力、抗氧化及抗補體結(jié)合等作用。我們采用先天感染鴨乙型肝炎病毒(duckHepatitisBvirus,DHBV)的龍巖麻鴨為模型，以作者實驗室提取加工的楮頭紅多糖為實驗藥物，研究了其體內(nèi)抗乙肝病毒的作用。1材料1.1動物1日齡龍巖麻鴨50只，雄性，體重(50土5)g，購自福建閩侯上街浦口孵化場，常規(guī)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(2025)°<:,相對濕度60%~80%,定時通風(fēng)換氣，每日約12h光照。詞料:寶鼎501小鴨飼料，由穗屏企業(yè)有限公司飼料廠生產(chǎn)。1.2藥物楮頭紅純化多糖為白色絮狀物；易溶于熱水冷水，不溶于高濃度的乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、異丙醇；經(jīng)元素分析、紅外和紫外綜合分析表明多糖中沒有N、S元素存在，硫酸基分析表明不含硫酸根，應(yīng)為不含硫的非氨基糖，分子量為848180。多糖由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3個單糖組成，鼠李糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為11.6:16.4:28.6，是一種雜多糖[1]。經(jīng)NMR等分析，多糖主鏈以P—型糖苷鍵連接為主，少量(x—型糖苷鍵，其具有螺旋空間結(jié)構(gòu)，檢測其純度為95.1%。拉米呋啶(國藥準(zhǔn)字H20070532)，由中國蘇州葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司生產(chǎn)。1.3主要試劑缺口翻譯平移試劑盒，購自美國PromegaCO公司;a-32P-dCTP購自北京市亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司；NC膜，購自Amersham公司;DHBV質(zhì)粒，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶病研究所病毒室保存；SephadexG-50，，購自Pharmacia公司；鄰孔雜交點樣器，美國Bio-rad公司產(chǎn)品。2方法2.1動物篩選與分組1日齡龍巖麻鴨購回后適應(yīng)性喂養(yǎng)2d，于4日齡脛靜脈取血，離心，收集血清，斑點雜交法[4]檢測DHBVDNA，第13天出結(jié)果，篩選出先天自然感染鴨。將DHBVDNA陽性鴨隨機(jī)分為3組模型對照組、拉米呋啶組和多糖組，每組10只。2.2給藥方法楮頭紅多糖組和拉米呋啶組每天按50mg'kg'1劑量口服給藥，給藥17體積為1mL/次，模型組以生理鹽水代替。開始給藥時鴨體重115125g/只。每5d稱體重1次，按體重調(diào)整給藥量，連續(xù)給藥10d。血樣采集為13日齡用藥前(To)、用藥第5天(T5)、用藥第IO天(Tn))及停藥后第3天(P3)，自鴨脛靜脈取血，分離血清，-701:凍存待檢。2.3鴨血清DHBVDNA的檢測采用DHBVDNADotBlot法測定[5。取上述鴨血清，每批同時點膜，測定鴨血清中DHBVDNA水平，觀察其動態(tài)變化。按缺口翻譯試劑盒說明書方法,用"P標(biāo)記DHBVDNA探針，將40jiL血清點于硝酸纖維膜上，然后雜交，放射自顯影，在酶標(biāo)檢測儀上測定OD值(濾光片波長為490nm)，計算血清DHBVDNA密度。2.4統(tǒng)計學(xué)處理用PEMS3.1對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析及Ridit分析。3結(jié)果3.1楮頭紅多糖對鴨血清DHBVDNA的抑制作用各組用藥后不同時間點光密度值與同組給藥前光密度值的比較，結(jié)果見表3-l。楮頭紅多糖組在給藥后第5天，鴨血清DHBVDNA水平開始下降，第10天繼續(xù)下降，與To值比較，差異非常顯著(P<0.01)。拉米呋啶組在給藥后第5天鴨血清DHBVDNA水平明顯下降，與給藥前自身比較，差異非常顯著(PO.0i)。_表3-1楮頭紅多糖對DHBVDNA的抑制作用(x士s,n=10)_OD柳值組別T0T5T10P3—禾莫型)^fl組230±006205±006190±031186±022拉米呋啶組2.23±0.10.36±0.162'4)0.26±0,102'4)1.53±0.33多糖組2.24±0.060.76±0.16")0.55±0.202'4)0,65±0.13注藥物組給藥不同時間與給藥前(To)比較^<0.05，2)P<0.01;與模型組相同時間比較3)P<0.05，4)P<0.01實驗結(jié)果顯示，陽性藥物拉米呋啶灌胃50mg'kg"11,連續(xù)10d給藥，可顯著抑制血清DHBVDNA，停藥3d(P3)DHBVDNA顯著屈升，與臨床結(jié)果相吻合，說明本次實驗的有效性。受試藥物楮頭紅多糖lOd療程各時點血清DHBVDNA變化差異也有顯著性意義(PO.Ol)，停藥3d(P3)DHBVDNA基本不變，提示楮頭紅多糖在鴨體內(nèi)對DHBVDNA有明顯抑制作用，且反彈較小。應(yīng)用實例n楮頭紅多糖在鴨體內(nèi)抑制鴨乙型肝炎病毒感染的實驗研究楮頭紅多糖是由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3個單糖組成，鼠李糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為11.6:16.4:28.6，分子量為848180〖1〗。由藥用植物楮頭紅經(jīng)人工提取、加工而成。具有抑制HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的復(fù)制，具有一定的體外抗HBV活性和提高免疫力、抗氧化及抗補體結(jié)合等作用。為進(jìn)一步研究楮頭紅多糖體內(nèi)抗乙肝病毒的作用，本實驗采用鴨乙型肝炎病毒感染模型，研究楮頭紅多糖對鴨乙型肝炎病毒的抑制作用，現(xiàn)報道如下。1實驗材料1.1病毒鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強(qiáng)陽性血清采自上海麻鴨，-70°C保存。1.2動物1日齡福建閩侯上街浦口孵化場。1.3藥物拉米呋定(中國蘇州葛蘭素史克制藥有限公司，批號H20070532);楮頭紅多糖，由本課題組提供，為白色絮狀物；易溶于熱水冷水，不溶于高濃度的乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、異丙醇；純度達(dá)95%以上。1.4試劑a-32P-dCTP購自北京亞輝生物技術(shù)工程公司。缺口翻譯藥盒購自普洛麥格公司(PromegaCo.);SephadexG-50，F(xiàn)icollPVP購自瑞典Pharmacia公司;SDS西德Merck公司產(chǎn)品;魚精DNA、牛血清白蛋白為中國科學(xué)院生物物理所產(chǎn)品;硝酸纖維素膜045pn為Amersham公司產(chǎn)品。2實驗方法及結(jié)果2.1復(fù)制鴨乙型肝炎病毒感染模型取1日齡北京鴨40只，隨機(jī)分成5組:模型對照組、陽性對照組、楮頭紅多糖高、中、低劑量組。每組8只。每只經(jīng)腿脛靜脈注射0.2ml龍巖麻鴨DHBV-DNA強(qiáng)陽性鴨血清。2.2藥物治療在感染后7d自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，為治療前樣本(To)，-70'0保存待檢。DHBV感染雛鴨7d后進(jìn)行藥物治療試驗，楮頭紅多糖高、中、低劑量組分別給予楮頭紅多糖50、100和150mg/kg,陽性對照組給予拉米呋定50mg/kg,模型對照組給予生理鹽水。灌胃給藥，每日2次，連續(xù)H)d，在用藥第5天(T5)，第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，-7(TC保存待檢。2.3DHBV-DNA的測定參照文獻(xiàn)5,鴨血清樣品用32P-DHBVDNA探針作斑點雜交，X射線底片上得到放射自顯影像，以酶標(biāo)儀于490mn處測定其OD值，半定量計算DNA水平。2.4結(jié)果處理實驗數(shù)據(jù)用x士s表示，統(tǒng)計采用t檢驗。2.5結(jié)果雛鴨感染乙肝病毒后DHBV-DNA全部陽性，楮頭紅多糖lOOmg/kg、150mg/kg對DHBV-DNA有明顯抑制作用(P<0.01或P<0.05)，且楮頭紅多糖在停藥后未見明顯反跳現(xiàn)象。陽性藥拉米夫定在用藥期間可顯著抑制鴨DHBV-DNA(P<0.05),但停藥后出現(xiàn)病毒重新復(fù)制的"反跳"現(xiàn)象(P0.05)。結(jié)果見表3-1、3-2。表3-2楮頭紅多糖對鴨血清DHBV-DNA水平的影響(x±s,n=8)劑量_DHBVDNA的OD值_組別(mg/kg)TGT5T1()P3模型對照組一0.718±0.06O.733±0.O5O.7O5±0.O7多糖低劑量組500.713±0.030.657±0.050.656±0.050.732±0.07多糖中劑量組1000.653±0.060,599±0.050.571土0.05②0.650±0.07多糖高劑量組1500.700±謹(jǐn)0.523±0.060.520士0.07②0.613±011陽性對照組500.738土0.060.544±0.060.518±0.060.831±0.03'比較,P<0.05，②P0.01表3-3楮頭紅多糖對鴨血清DHBV-DNA水平抑制率的影響(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>DHBV與人HBV兩者的分子結(jié)構(gòu)和發(fā)病機(jī)制存在許多相似之處。治療慢性乙型肝炎遇到的最大困難是產(chǎn)生免疫耐受的患者對任何藥物療效均不佳。聞玉梅教授利用DHBV感染1日齡幼鴨建立免疫耐受動物模型，其病毒血癥持續(xù)時間較長且較穩(wěn)定，近年來，鴨乙型肝炎動物模型已經(jīng)成為國內(nèi)外公認(rèn)的用于篩選抗HBV藥物、評價療效和研究其發(fā)病機(jī)制的模型。乙型肝炎一直是感染率高且危害嚴(yán)重的傳染病之一，目前對乙型肝炎病毒引起的t曼性肝病尚無理想的治療方法。臨床常用的兩類抗病毒藥為千擾素和核苷類藥物。干擾素ct治療的有效率較低以及難以耐受的副作用限制了其臨床應(yīng)用，核苷類代表藥物拉米夫定同樣因為需要較長的療程及耐藥性問題而難以成為理想的治療藥物。因此，尋找療效確切、長期服用安全且價格低廉的藥物是亟待解決的問題。本實驗觀察了楮頭紅多糖抗DHBV-DNA的作用。實驗結(jié)果表明，楮頭紅多糖100mg/kg、150mg/kg對DHBV-DNA有明顯抑制作用，且在停藥后未見明顯反跳現(xiàn)象。關(guān)于楮頭紅多糖抗病毒的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。[參考文獻(xiàn)][1]朱慶銀.楮頭紅多糖的提取分離、分子結(jié)構(gòu)及其生物活性研究福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文.2007[2].李清祿，朱慶銀，何海斌，林茹等.楮頭紅多糖的純化分離及其活性初步研究[J].第六屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會論文集，中國植物學(xué)會藥用植物及植物藥專業(yè)委員會，長春，2006.[3]陶鵬黃愛龍乙型肝炎病毒感染模型研究新進(jìn)展J.中華肝臟病雜志，2003，11(11):701-702.[4]陳淵卿，顧健人，蔣惠秋,等.斑點雜交試驗直接檢測血清中乙型肝炎病毒DNAJ.中華傳染病雜志，1983,1(2):63.〖5]徐慶，宋蕓娟,李麗亞，等.荔枝核總黃酮的抗鴨乙型肝炎病毒作用J.世界華人消化雜志，2005,13(17):2082-2085.20權(quán)利要求1、一種楮頭紅多糖在制備抗乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用。2、一種楮頭紅多糖在制備保肝護(hù)肝保健品中的應(yīng)用。3、由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3個單糖組成的且鼠李糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為11.6:16.4:28.6以及多糖分子量為848180的楮頭紅多糖在制備抗乙肝病毒的藥物和保肝護(hù)肝保健品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開楮頭紅多糖在制備抗乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用，楮頭紅多糖純化后為白色絮狀物，易溶于熱水冷水，不溶于高濃度的乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、異丙醇；多糖由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3個單糖組成，鼠李糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為11.6∶16.4∶28.6，是一種雜多糖，分子量為848180。體外生物活性實驗表明，楮頭紅多糖具有抑制HepG2.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的復(fù)制，具有一定的體外抗HBV活性作用；體內(nèi)活性實驗表明，楮頭紅多糖在鴨體內(nèi)對DHBVDNA有明顯抑制作用，且反彈較小，可用于制備抗乙肝病毒的藥物。文檔編號A61K31/715GK101664418SQ20091011241公開日2010年3月10日申請日期2009年8月24日優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日發(fā)明者李凌峰,李宇翔,李清祿,蔡向陽申請人:李清祿