本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及分子標記物在制備胰腺癌預后評估產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，在西方國家惡性腫瘤死亡率第四位,全球每年約250萬人死于胰腺癌。我國胰腺癌發(fā)病率逐年上升，近20年增長迅速。胰腺癌的治療主要為手術(shù)、化療和放療相結(jié)合的綜合治療，其五年生存率小于5％。由于胰腺的解剖學位置較深，腹部疼痛、體重減輕、黃疸等臨床特異性的癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移。胰腺癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移較早，早期診斷、根治性手術(shù)切除是胰腺癌患者獲得長期存活的唯一希望，但80％以上的患者就診時已經(jīng)失去了根治性切除的機會。因此，提高胰腺癌的早期診斷率，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，提高藥物的治療效果，成為改善胰腺癌患者預后的關(guān)鍵因素。目前臨床上常用的胰腺癌腫瘤學標志物是CA19-9。CA19-9單獨作為診斷胰腺癌的指標尚不精確，敏感性較低，并且在其他消化道腫瘤及良性疾病中也有升高，因此對胰腺癌早期診斷的價值有限。另外，一些基因腫瘤標志物也用于臨床胰腺癌的早期診斷，但始終未能達到診斷的目的。因此，需要更迫切地尋找一些敏感性或特異性更好的標志物用于胰腺癌的早期診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復發(fā)的監(jiān)控。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)胰腺癌的早期診斷，預后評估，復發(fā)監(jiān)控，個體化治療，本發(fā)明的目的之一在于提供一種檢測胰腺癌的分子標記物。本發(fā)明的目的之二是在于提供所述分子標記物在制備胰腺癌預后評估產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之三在于提供所述分子標記物在制備監(jiān)控胰腺癌轉(zhuǎn)移復發(fā)產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之四是在于提供一種胰腺癌預后評估的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種檢測胰腺癌的分子標記物，所述標記物為HCG4P6和/或TOP1P2基因。進一步地，本發(fā)明提供了所述的分子標記物在制備胰腺癌預后評估產(chǎn)品中的應(yīng)用。進一步地，本發(fā)明提供了所述的分子標記物在制備監(jiān)控胰腺癌轉(zhuǎn)移復發(fā)產(chǎn)品中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為芯片或試劑盒。優(yōu)選地，所述芯片為基因芯片。優(yōu)選的，所述基因芯片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于HCG4P6和/或TOP1P2核苷酸的部分或全部序列。進一步地，本發(fā)明提供一種胰腺癌預后評估的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)組織或血液樣品提取總RNA試劑；(2)反轉(zhuǎn)錄試劑；(3)定量PCR試劑。優(yōu)選地，組織或血液樣品提取總RNA試劑包括TRizol、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇和無酶水；所述反轉(zhuǎn)錄試劑包括5xPrimerScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers和RNaseFreedH2O。優(yōu)選地，所述定量PCR試劑包括特異性擴增HCG4P6和/或TOP1P2中引物序列。優(yōu)選地，所述引物序列包括：HCG4P6：SEQIDNO.1和2；TOP1P2：SEQIDNO.3和4。優(yōu)選地，所述定量PCR試劑還包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBRGreen熒光染料。優(yōu)選地，所述試劑盒含有人正常的胰腺組織或細胞的總RNA或DNA。進一步地，本發(fā)明提供了一種評估胰腺癌治療效果的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取受試者的樣品；(2)檢測受試者樣品中HCG4P6和/或TOP1P2基因的表達水平；(3)將測得的HCG4P6和/或TOP1P2基因的表達水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來判斷治療效果。判斷標準如下：治療后HCG4P6和/或TOP1P2表達水平與治療前相比，比值P≤1判斷為治療無效，1<P<1.5判斷為病情改善，1.5＜P判斷為治療顯著。進一步地，本發(fā)明還提供了一種監(jiān)控胰腺癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取受試者的樣品；(2)檢測受試者樣品中HCG4P6和/或TOP1P2基因的表達水平；(3)將測得的HCG4P6和/或TOP1P2基因的表達水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來，判斷轉(zhuǎn)移復發(fā)情況。判斷標準如下：療程結(jié)束后不同時間的HCG4P6和/或TOP1P2表達量與治療后相比，比值≤1判斷為復發(fā)，比值>1判斷為未復發(fā)即無進展生存。優(yōu)選地，所述受試者樣品包括的胰腺癌組織樣品和血液樣品；所述受試者樣品為治療前的或治療后的樣品。優(yōu)選地，所述治療包括施用手術(shù)干涉，化療，放療，藥物治療或其組合。優(yōu)選地，所述的檢測表達水平包括檢測轉(zhuǎn)錄物水平。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了兩種與胰腺癌相關(guān)的基因，分別為HCG4P6和TOP1P2，并且通過單因素Cox回歸分析了HCG4P6和TOP1P2為胰腺癌保護性因素。利用HCG4P6和/或TOP1P2基因檢測胰腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測、預后評估，其精確度大大提高，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點和重要依據(jù)。附圖說明圖1分別為檢測5例胰腺癌患者HCG4P6和TOP1P2表達量與生存時間的關(guān)系。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息中160個胰腺癌患者的數(shù)據(jù)進行胰腺癌的生存分析篩選相關(guān)基因，篩選得到與生存時間相關(guān)HCG4P6和TOP1P2，通過單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)HCG4P6和TOP1P2為保護性因素。進一步通過定量PCR檢測5例胰腺癌患者HCG4P6和TOP1P2基因表達量與生存時間的相關(guān)性。本發(fā)明所述的基因是在本發(fā)明之前的已知基因，均來源于人類基因組。Genebank登錄號：HCG4P6：GeneID:80868；TOP1P2：GeneID:7152。HCG4P6又名HCG4B(HLAcomplexgroup4B，人類白細胞抗原復合體群4b)，是長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNA)，位于6號染色體上。TOP1P2(Topoisomerase(DNA)IPseudogene2，拓撲異構(gòu)酶I假基因2)為假基因，位于22染色體上，屬于反義RNA類。在本發(fā)明中，“預后”是指癌癥患者在通過手術(shù)、化療、藥物治療或其組合處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過程或結(jié)果。預后可以是通過手術(shù)、化療、藥物治療或其組合處理抑制或緩解胰腺癌生長后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態(tài)。預后可以通過檢查標志物來評估，所述的標記物為一個或多個基因。預后評估可以這樣進行：根據(jù)標志物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預后是良好還是不良，或者確定良好預后或不良預后的概率。實施例1基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息進行胰腺癌的生存分析篩選相關(guān)基因1、臨床信息篩選檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌患者臨床信息，截至2015年12月10日，TCGA數(shù)據(jù)庫中總共記載了185例胰腺癌臨床病例。對這些數(shù)據(jù)進行篩選，共有160例患者納入研究。篩選時排除具有其他惡性腫瘤病史、曾接受過放療或化療的患者，同時納入研究的患者需含臨床信息和mRNA數(shù)據(jù)。2、生存期研究樣本統(tǒng)計160例胰腺癌患者生存時間的統(tǒng)計結(jié)果如下表所示:表1160例胰腺癌患者生存時間統(tǒng)計生存期時間t(年)期初進入研究人數(shù)期內(nèi)死亡人數(shù)期內(nèi)失訪人數(shù)t<116027741≤t<25922152≤t<3221023≤t<410224≤t<56015≤t5413、mRNA表達數(shù)據(jù)生存分析研究方案(1)對胰腺癌高通量mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索、數(shù)據(jù)下載及樣本挑選和歸類。由下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過生物信息學分析篩選得出與胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA。(2)用Cytoscape軟件構(gòu)建由mRNAs組成的生物信息網(wǎng)絡(luò)，通過DAVID對生物信息網(wǎng)絡(luò)中與胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA進行GO分析和Pathway分析。4、胰腺癌mRNA表達數(shù)據(jù)的生存分析結(jié)果將胰腺癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載后，去除readcount＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100個mRNA。提取mRNA基因表達量和胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫生存時間數(shù)據(jù)，采用survival包的coxph函數(shù)完成，經(jīng)單因素Cox回歸分析，篩選得到單因素Cox回歸中p值<0.05的mRNA有580個，包括328個風險性mRNA和252個保護性mRNA。Coef值是回歸系數(shù)，HR＞1為風險性因素，HR＜1為保護性因素。為了更好的研究與生存時間相關(guān)的mRNA的功能，我們通過GORILLA和GeneCodis軟件對胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA進行GO功能富集和KEGG通路富集，篩選標準皆為FDR<0.05。其中HCG4P6的p值為0.003641，HR<1，TOP1P2的p值為0.014759，HR<1，均為胰腺癌保護性mRNA。實施例2RT-PCR檢測基因表達含量與生存時間的相關(guān)性1、材料收集2010年10月至2015年12月期間經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院外科手術(shù)切除、并經(jīng)病理學檢查確診的5例胰腺癌患者。患者經(jīng)手術(shù)治療后，并對患者進行跟蹤隨訪，每年抽取患者外周血檢測HCG4P6和TOP1P2基因的表達量變化(第1例患者生存時間>6年，第2例患者生存時間為5年，第3例患者生存時間為5年，第4例患者生存時間3年，第5例患者生存時間2年)。2、方法2.1對組織樣本進行總RNA提取依據(jù)編號分別對5例胰腺癌患者外周血進行總RNA提取，采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：2.1.1裂解紅細胞取抗凝血液，按1:3體積加入預冷紅細胞裂解液(碧云天，貨號C3702)，混勻，室溫靜置10min，4℃，1000r/min，離心1min。小心棄掉上清保留管底細胞沉淀。2.1.2Trizol提取細胞總RNA①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標準：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。2.2RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。2.3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.4Real-TimePCR2.4.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)相對定量分析。采用primerpremier5.0軟件設(shè)計引物，基因序列參照NCBI：NR_001317.3(HCG4P6)和NR_001283.1(TOP1P2)，內(nèi)參選NM_001289745.1(GAPDH)，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下：表2引物序列操作過程如下：表3RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10uM)0.5μL下游引物(10uM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(一)反應(yīng)體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，53℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)。(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。3、實驗結(jié)果實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，分別比較5例患者HCG4P6和TOP1P2在胰腺癌組織中的表達量與生存時間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定，生存時間越長的患者HCG4P6和TOP1P2的表達量相對較高，具體情況見圖1。實施例3試劑盒制備本實施例提供了用于胰腺癌療效評估的試劑盒，該試劑盒包括1、RNA提取試劑包括TRizol、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇和無酶水；2、反轉(zhuǎn)錄試劑包括5xPrimerScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers和RNaseFreedH2O；3、定量PCR試劑包括特異擴增HCG4P6和/或TOP1P2的引物序列如表2所示，具體為：(1)試劑盒包括特異性擴增HCG4P6：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；(2)試劑盒包括特異性擴增TOP1P2：SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；(3)試劑盒包括特異性擴增HCG4P6和TOP1P2：SEQIDNO.1和2；SEQIDNO.3和4。和特異擴增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；還包括胰腺正常組織cDNA：作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應(yīng)體系使用與檢測樣本cDNA相同量。反轉(zhuǎn)錄體系如表4所示。反應(yīng)程序為：37℃孵育15min，85℃滅活5s。表4反轉(zhuǎn)錄體系組分加入量5xPrimerScriptBuffer2μLPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μLOligodTPrimer(50μM)0.5μLRandom6mers(100μM)0.5μLTotalRNA1ulRNaseFreedH2O至10μL定量PCR反應(yīng)體系如表5所示。反應(yīng)程序為：95℃預變性5min，(95℃變性15sec，53℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個循環(huán)，72℃延伸15min。表5定量PCR反應(yīng)體系組分加入量SYBRGreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL實施例4HCG4P6和/或TOP1P2檢測用于胰腺癌療效評估2010年10月至2015年12月從北京協(xié)和醫(yī)院收集10例胰腺癌患者治療前和治療后的血液樣品，利用實施例3所述的試劑盒分別檢測HCG4P6和TOP1P2表達含量，根據(jù)以下公式計算P值：P＝治療后/治療前，P≤1判斷為治療無效，1<P≤1.5判斷為病情改善，1.5＜P判斷為治療顯著，將P值判斷結(jié)果與這10名患者的臨床評價結(jié)果進行比較，考察HCG4P6和/或TOP1P2檢測用于胰腺癌療效評估的效果。結(jié)果如下：1、HCG4P6檢測用于胰腺癌療效評估的結(jié)果由表6可知，試劑盒1用于胰腺癌療效評估的結(jié)果與臨床評價結(jié)果的符合率達90％。表6HCG4P6檢測用于胰腺癌療效評估患者編號P值P值判斷結(jié)果臨床評價結(jié)果11.25病情改善病情改善20.49治療無效果治療無效果31.05病情改善治療無效果41.15病情改善病情改善51.67療效顯著療效顯著61.11病情改善病情改善71.20病情改善病情改善81.52療效顯著療效顯著90.68治療無效果治療無效果100.96治療無效果治療無效果2、TOP1P2檢測用于胰腺癌療效評估的結(jié)果由表7可知，試劑盒2用于胰腺癌療效評估的結(jié)果與臨床評價結(jié)果的符合率達90％。表7TOP1P2檢測評估胰腺癌療效結(jié)果3、HCG4P6和TOP1P2聯(lián)合檢測用于胰腺癌療效評估的結(jié)果由表8可知，試劑盒3用于胰腺癌療效評估的結(jié)果與臨床評價結(jié)果的符合率達100％。表8HCG4P6和TOP1P2聯(lián)合檢測評估胰腺癌療效結(jié)果綜合上述結(jié)果可以看出，HCG4P6和TOP1P2聯(lián)合檢測用于胰腺癌療效評估的準確度高于HCG4P6或TOP1P2單獨檢測用于胰腺癌療效評估。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>北京致成生物醫(yī)學科技有限公司<120>分子標記物在制備胰腺癌預后評估產(chǎn)品中的應(yīng)用<130>p16yxa72<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gggaatggaggcgtagag18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2acaagcgggagtcacaga18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3tgtcagcgttctaccagg18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4agcatcgaaaccgtcaca18<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5aacggatttggtcgtattg19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6ggaagatggtgatgggatt19當前第1頁1 2 3