本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及篩選低氧適應(yīng)性綿羊的方法。
背景技術(shù)：
：我國(guó)海拔3000m以上的高原占全國(guó)總面積的1/6。在海拔高度5000m以下低空，海拔高度每上升100m，氣壓降低約1KPa。海拔高度3000m的高原大氣氧含量?jī)H為海平面地區(qū)的73％，海拔高度5000m地區(qū)的大氣氧含量?jī)H為海平面地區(qū)的53％。因此，高原地區(qū)的低氣壓與低氧分壓是主要生態(tài)因子，嚴(yán)重地影響著動(dòng)物與人的生存和發(fā)展。在我國(guó)面積最大的牧區(qū)——青藏高原牧區(qū)約有20億畝可利用的高寒草場(chǎng)，其中綿羊業(yè)是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的主要部門(mén)。然而，目前青藏高原的大部分綿羊?yàn)椴叵稻d羊。藏羊體質(zhì)強(qiáng)健，耐粗飼，善游牧，但生長(zhǎng)速度慢、產(chǎn)肉性能極低、繁殖力弱。一些國(guó)內(nèi)外著名肉羊品種，如小尾寒羊、杜泊羊、特克賽爾羊、肉用美利奴羊已在國(guó)內(nèi)許多地區(qū)成功引種、推廣。然而，高原特有的高寒低氧環(huán)境造成引進(jìn)的品種或者引進(jìn)品種與當(dāng)?shù)仄贩N的雜交后代很難適應(yīng)高寒缺氧環(huán)境。血液生理是低氧適應(yīng)性的一個(gè)重要方面，作為血液中氣體的主要載體，紅細(xì)胞特性與低氧適應(yīng)性直接相關(guān)。海拔可以影響紅細(xì)胞特性，血紅蛋白是血液內(nèi)運(yùn)送氧和二氧化碳的載體，將氧由肺運(yùn)送到組織，又將二氧化碳從組織運(yùn)到肺部。所以血紅蛋白量增加有利于氣體運(yùn)輸。紅細(xì)胞的產(chǎn)生是一個(gè)可遺傳的性狀，可用分子標(biāo)記預(yù)測(cè)紅細(xì)胞特性，進(jìn)而可以對(duì)低氧適應(yīng)性綿羊進(jìn)行篩選。綿羊低氧適應(yīng)性分子遺傳標(biāo)記位于18號(hào)染色體上19272.8-19322.8kb，將包括綿羊參考基因組在內(nèi)的含有該區(qū)域的基因型記為參考型。除參考型外，在部分品系或個(gè)體的基因組中，該區(qū)域在測(cè)序中表現(xiàn)出缺失，由此產(chǎn)生的多態(tài)性記為缺失型。與缺失型相比，基因組參考型個(gè)體表現(xiàn)出較高的血紅蛋白濃度和較小的平均細(xì)胞體積，從而有利于在低氧環(huán)境中生存。然而目前分子生物學(xué)上對(duì)大片段插入/缺失的檢測(cè)缺乏有效手段。理論上可用的檢測(cè)方法有：全基因組測(cè)序、Southern印記雜交、免疫熒光原位雜交(FISH)還有近年來(lái)發(fā)展的長(zhǎng)片段PCR技術(shù)和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLAP)。這些檢測(cè)方法對(duì)樣品、技術(shù)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)成本高。另外直接通過(guò)該基因簇中基因序列的差異檢測(cè)也比較困難，原因是該區(qū)域是由多個(gè)高同源性的基因家族組成的基因簇，很難設(shè)計(jì)出特異引物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種篩選低氧適應(yīng)性綿羊的方法，該方法所需樣本量小，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，成本低，大大提高育種和引種的效率。本發(fā)明基于綿羊18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb的大片段丟失變異與綿羊平均血紅蛋白濃度以及平均紅細(xì)胞體積顯著相關(guān)，進(jìn)而與綿羊低氧適應(yīng)性密切相關(guān)。通過(guò)分析得到與18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb的大片段丟失變異高度連鎖(r2>0.6)的314個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)SNP位點(diǎn)預(yù)測(cè)個(gè)體的低氧適應(yīng)性特性，篩選出低氧適應(yīng)性較強(qiáng)的綿羊的品系和雜交個(gè)體?；谏鲜瞿康谋景l(fā)明提供的篩選低氧適應(yīng)性綿羊的方法，包括以下步驟：1)提取待檢測(cè)綿羊的基因組DNA；2)檢測(cè)與綿羊18號(hào)染色體上19272.8-19322.8kb區(qū)域基因的缺失緊密連鎖的SNP位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)；3)通過(guò)SNP位點(diǎn)的分型，將綿羊分為高原型、平原型與雜合型，其中，高原型綿羊具有低氧適應(yīng)性。其中，所述與綿羊18號(hào)染色體上19272.8-19322.8kb區(qū)域基因的缺失緊密連鎖的SNP位點(diǎn)的連鎖系數(shù)r2>0.6?？蛇x地，步驟2)中檢測(cè)SNP位點(diǎn)的方法是等位基因特異性PCR法?？蛇x地，步驟2)中檢測(cè)SNP位點(diǎn)的方法是TaqMan探針?lè)??？蛇x地，所述等位基因特異性PCR法是根據(jù)選取的緊密連鎖SNP位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該一個(gè)或多個(gè)SNP位點(diǎn)的引物，通過(guò)基因克隆、基因測(cè)序判斷SNP位點(diǎn)的分型，篩選低氧適應(yīng)性的綿羊?？蛇x地，所述TaqMan探針?lè)ㄊ歉鶕?jù)選取的緊密連鎖SNP位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針，通過(guò)該探針檢測(cè)SNP位點(diǎn)的分型，篩選低氧適應(yīng)性的綿羊?？蛇x地，所述探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)?？蛇x地，所述探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)是VIC或FAM，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)是TAMRA或MGB?；谙嗤陌l(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述篩選低氧適應(yīng)性綿羊的方法在低氧適應(yīng)性綿羊輔助引種中的應(yīng)用；在低氧適應(yīng)性綿羊雜交選育中的應(yīng)用。從上面所述可以看出，本發(fā)明提供的篩選低氧適應(yīng)性綿羊的方法，通過(guò)分析與18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb的大片段丟失變異高度連鎖(r2>0.6)的SNP位點(diǎn)，判斷該區(qū)域是否存在大片段丟失變異，進(jìn)而預(yù)測(cè)綿羊的低氧適應(yīng)性特性。該方法所需樣本量小，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，成本低，大大提高育種和引種的效率。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。根據(jù)國(guó)際綿羊基因組組織(ISGC)的70只羊的重測(cè)序的數(shù)據(jù)，分析測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了與綿羊OAR3.1版本參考基因組18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb的大片段丟失變異緊密連鎖的314個(gè)SNP位點(diǎn)(見(jiàn)表1)，其中，r2值表示這個(gè)SNP和大片段缺失的連鎖程度。該314個(gè)SNP位點(diǎn)的分型與該區(qū)域是否缺失緊密相關(guān)，可以用于篩選低氧適應(yīng)性綿羊，其中高原型表示具有低氧適應(yīng)性。表1：與18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb的大片段丟失變異緊密連鎖的314個(gè)SNP位點(diǎn)信息本發(fā)明提供的篩選低氧適應(yīng)性綿羊的方法，包括以下步驟：1)提取待檢測(cè)綿羊的基因組DNA；2)檢測(cè)與綿羊18號(hào)染色體上19272.8-19322.8kb區(qū)域基因的缺失緊密連鎖的314個(gè)SNP位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)；3)通過(guò)SNP位點(diǎn)分型，將綿羊分為高原型、平原型與雜合型，其中，高原型綿羊具有低氧適應(yīng)性。選取其中編號(hào)155的SNP19342316位點(diǎn)，進(jìn)行方法有效性驗(yàn)證。實(shí)施例1：TaqMan探針?lè)z測(cè)SNP19342316位點(diǎn)的分型及其預(yù)測(cè)效率驗(yàn)證1、試驗(yàn)動(dòng)物：試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自美國(guó)愛(ài)達(dá)荷州杜布瓦實(shí)驗(yàn)站。共三個(gè)品種哥倫比亞(N＝145)的Polypay(N＝438)、和蘭布萊(N＝414)品種，均為1-5歲的純種母羊。采用相似的飼養(yǎng)管理。2、紅細(xì)胞特性分析：由頸靜脈穿刺，使用EDTA包被的真空采血管收集全血。所有參數(shù)由PhoenixLabs,Inc.按照試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量，所有引用的參考值也由該實(shí)驗(yàn)室提供。直接測(cè)量的指標(biāo)：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC，M/ml，參考范圍：4.0-12.0M/ml)；血紅蛋白含量(HGB，g/dl，參考范圍：9.0-15.0g/dl)；紅細(xì)胞壓積(HCT，％，參考范圍：27.0-45.0％)。三個(gè)派生指標(biāo)：平均紅細(xì)胞體積(MCV，以fL、參考范圍：28.0-40.0fL),計(jì)算公式：MCV(μm3)＝紅細(xì)胞壓積(％)x10/紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(百萬(wàn)/mm3)；平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH，單位pg，參考范圍:8.0-12.0pg)，計(jì)算公式MCH(pg)＝血紅蛋白濃度(g/100ml)x10/紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(百萬(wàn)/mm3)；平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC，單位為％，參考范圍：31.0-35.0％)，計(jì)算公式：MCHC(g/100m)＝血紅蛋白濃度(g/100ml)x100/紅細(xì)胞壓積(％)。3、含有SNP19342316位點(diǎn)的片段的獲得以及分型檢測(cè)：常規(guī)方法提取樣品基因組DNA，使用TaqManH(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)基因分型方法檢測(cè)SNP19342316位點(diǎn)多態(tài)性及分型。根據(jù)SNP19342316位點(diǎn)設(shè)計(jì)如下引物及探針，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考TaqManH(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增引物1：5’-CCGGTTCATCCTTGAGAAACTCTT-3’；擴(kuò)增引物2：5’-CCCCACAGATGTGCTAATGGT-3’；探針1(檢測(cè)A)：5’-CCTCCTCTTCTTCAACC-3’；探針2(檢測(cè)G)：5’-CTCCTCCTCTTCAACC-3’。所述探針1和探針2的5’端分別標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)VIC和FAM，3’端分別標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)TAMRA和MGB。根據(jù)熒光信號(hào)的釋放判斷樣品中的SNP類(lèi)型高原型(AA)，平原型(GG)或者雜合型(AG)。4、SNP19342316位點(diǎn)的分型的預(yù)測(cè)效力驗(yàn)證步驟3檢測(cè)的SNP19342316位點(diǎn)的分型與紅細(xì)胞特性值的關(guān)聯(lián)分析如表2所示：高原型等位基因(A)與正常范圍以外的血紅蛋白增加和細(xì)胞體積降低顯著相關(guān)，而平原型等位基因(G)表現(xiàn)出正常的范圍。結(jié)果表明SNP19342316位點(diǎn)的分型為高原型(AA)的個(gè)體型具有較高的血紅蛋白濃度和較小的紅細(xì)胞體積，因而更適應(yīng)低氧環(huán)境。表明SNP19342316位點(diǎn)作為分子標(biāo)記可對(duì)綿羊紅細(xì)胞特性進(jìn)行有效預(yù)測(cè)，篩選低氧適應(yīng)性綿羊。表2：紅細(xì)胞重要特性值與SNP19342316位點(diǎn)分型的關(guān)系A(chǔ)AAGGG標(biāo)準(zhǔn)化P值紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(％)36.25234.40233.9916.2*10-14平均紅細(xì)胞體積(fl)32.39833.92334.5632.5*10-6實(shí)施例2：等位基因特異性PCR檢測(cè)SNP19342316位點(diǎn)的分型及預(yù)測(cè)效力驗(yàn)證試驗(yàn)動(dòng)物、紅細(xì)胞特性分析同實(shí)施例1。根據(jù)SNP19342316位點(diǎn)設(shè)計(jì)如下等位基因特異性PCR引物組，對(duì)所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增：缺失型(高原型)：5’-TGCAAGACTGGTTCACCCCAGAT-3’5’-CCGGCTTTATGTCAGTGATACGTG-3’產(chǎn)物為330bp。參考型(平原型)：5’-TAGAAGTACTCCTACCTGAACGA-3’5’-CCAAACAAATCCCTGAGCCATTTC-3’產(chǎn)物為719bp。使用TaqManH通用PCR混合物，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR。初始變性95℃10分鐘，之后每個(gè)循環(huán)95℃30秒，64℃30秒，68℃1分鐘，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳及顯像。參考型僅能在引物為參考型引物時(shí)得到條帶，缺失型僅能在引物為缺失型引物時(shí)得到條帶，雜合型兩種引物均有條帶。SNP19342316位點(diǎn)的分型與紅細(xì)胞特性值的關(guān)聯(lián)分析如表3所示：缺失型(高原型)與正常范圍以外的血紅蛋白增加和細(xì)胞體積降低顯著相關(guān)，而參考型(平原型)表現(xiàn)出正常的范圍。結(jié)果表明缺失型個(gè)體具有較高的血紅蛋白濃度和較小的紅細(xì)胞體積，因而更適應(yīng)低氧環(huán)境。19272.8-19322.8kb的大片段缺失標(biāo)記可對(duì)綿羊紅細(xì)胞特性進(jìn)行有效預(yù)測(cè)，進(jìn)而篩選低適氧性綿羊。表3：紅細(xì)胞重要特性值與等位基因特異性PCR檢測(cè)SNP19342316位點(diǎn)分型的關(guān)系缺失型雜合型參考型標(biāo)準(zhǔn)化P值紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(％)36.134.333.91.1*10-13平均紅細(xì)胞體積(fl)32.333.634.36.2*10-6實(shí)施例3：SNP19342316位點(diǎn)的分型在不同種群中的分布從Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了幾個(gè)國(guó)內(nèi)已經(jīng)引進(jìn)主要品系，以及藏羊和生活在克什米爾高原上的張?zhí)寡?。比較研究SNP19342316位點(diǎn)的分型及頻率。如表4所示，藏羊全部都表現(xiàn)出純合AA分型(高原型)，來(lái)自克什米爾張?zhí)沟貐^(qū)海拔4000米左右的張?zhí)寡蚝蛠?lái)自北歐芬蘭高地的芬蘭羊也呈現(xiàn)出很高的A(高原型)頻率(0.996，0.854)。相對(duì)的，來(lái)自歐洲平原地區(qū)的個(gè)體大部分表現(xiàn)出較高比例的GG分型(平原型)。結(jié)果表明高原環(huán)境中生存的綿羊幾乎全部為高原型。表4：SNP19342316位點(diǎn)分型頻率在幾個(gè)主要品種中的分布品系/產(chǎn)地樣本數(shù)AAAGGGA基因頻率原產(chǎn)地澳洲美利奴羊5002480.02西南歐中國(guó)美利奴羊2319130.239西南歐澳洲無(wú)角陶賽特羊108739620.245東歐新西蘭羅姆尼羊24110130.25東歐伊朗薩福克羊55425260.3東歐蘇格蘭特克塞爾羊801840220.475東歐新西蘭特克塞爾羊2461350.521東歐非洲杜泊羊2110920.69非洲芬蘭羊99742140.854北歐張?zhí)寡?927200.966亞洲藏羊3737001亞洲實(shí)施例4：等位基因特異性PCR法和TaqMan探針?lè)z測(cè)世界不同海拔、不同品種羊中的SNP19342316位點(diǎn)分型從NCBI下載了世界綿羊基因組組織測(cè)序的40個(gè)品種的70個(gè)綿羊個(gè)體的～10X基因組重測(cè)序序列。然后利用BWA軟件將所有序列對(duì)應(yīng)到綿羊參考基因組OARv3.1上，通過(guò)統(tǒng)計(jì)該標(biāo)記區(qū)域(18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb)測(cè)序深度評(píng)估此區(qū)域的序列覆蓋度是否約為平均覆蓋度的100％，50％和0％，由此判斷這個(gè)區(qū)域是否是片段存在純合型、片段存在和丟失并存的雜合型，以及片段丟失純合型。結(jié)果如表5所示：除一只東部藏羊外，其他個(gè)體的SNP19342316位點(diǎn)分型均與缺失型相符(GG對(duì)應(yīng)參考型，AA對(duì)應(yīng)缺失型，AG對(duì)應(yīng)雜合型)，說(shuō)明SNP19342316位點(diǎn)的分型與基因缺失有很好的相關(guān)性。另外，該組數(shù)據(jù)獨(dú)立驗(yàn)證了實(shí)施例1中的SNP19342316以及基因缺失多態(tài)性在不同物種中的分布頻率。即，高原品系A(chǔ)和參考型頻率較高。表5：全世界不同品系部分個(gè)體的缺失以及SNP19342316分型比較個(gè)體編號(hào)測(cè)序覆蓋率是否缺失SNP分型原產(chǎn)地1美利奴10參考型GG西南歐2美利奴20.000576參考型GG西南歐3美利奴30.001079參考型GG西南歐4無(wú)角陶賽特羊0.00223參考型GG東歐5杜泊羊10.557122雜合型AG非洲6杜泊羊21.228633缺失型AA非洲7特克塞爾羊1.328273缺失型AA東歐8張?zhí)寡?1.141295缺失型AA亞洲帕米爾高原9張?zhí)寡?1.194676缺失型AA亞洲帕米爾高原10北部藏羊1.460935缺失型AA亞洲青藏高原11東部藏羊0.481583雜合型AA亞洲青藏高原實(shí)施例5：藏羊中的SNP19342316位點(diǎn)分型從西藏阿里高海拔地區(qū)環(huán)境(>4000m)中長(zhǎng)期適應(yīng)生活的藏綿羊隨機(jī)挑選了20只，進(jìn)行10X的基因組重測(cè)序，進(jìn)行同上數(shù)據(jù)處理和分析，結(jié)果20只藏羊的SNP19342316位點(diǎn)全部為AA，即高原型，具有低氧適應(yīng)性。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了本發(fā)明所提供的篩選低氧適應(yīng)性綿羊的方法的有效性。實(shí)施例6：選取其余313個(gè)SNP位點(diǎn)重復(fù)實(shí)施例1-5的實(shí)驗(yàn)，均可準(zhǔn)確篩選低氧適應(yīng)性綿羊，準(zhǔn)確率達(dá)90％以上。實(shí)施例7：選取r2<0.6的SNP位點(diǎn)重復(fù)實(shí)施例1-5的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)篩選低氧適應(yīng)性綿羊的準(zhǔn)確率出現(xiàn)明顯下降。例如，對(duì)于r2＝0.552的SNP位點(diǎn)，準(zhǔn)確率為74％；對(duì)于r2＝0.496的SNP位點(diǎn)，篩選準(zhǔn)確率為51％；對(duì)于r2＝0.33的SNP位點(diǎn)，篩選準(zhǔn)確率下降到43％。因此，利用緊密連鎖SNP位點(diǎn)篩選低氧適應(yīng)性綿羊的準(zhǔn)確率與連鎖系數(shù)r2存在關(guān)聯(lián)性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，只有r2>0.6的SNP位點(diǎn)才能保證與18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb的大片段丟失變異的高度連鎖性，從而保證篩選準(zhǔn)確率。當(dāng)r2<0.6時(shí)，連鎖不平衡關(guān)聯(lián)性逐漸弱化，盡管r2>0.33一般公認(rèn)為仍屬緊密關(guān)聯(lián)，但是0.33<r2<0.6的SNP位點(diǎn)已經(jīng)很難確保與18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb的大片段丟失變異的一致性，難以滿(mǎn)足篩選準(zhǔn)確性的要求。大片段缺失是造成紅細(xì)胞表型變異的基本原因，但是大片段缺失較難檢測(cè)。另外，現(xiàn)在分子生物學(xué)很難找到?jīng)Q定性狀的突變位點(diǎn)，因而，目前找到的大部分分子標(biāo)記都是和未知決定性突變連鎖的SNP位點(diǎn)。本發(fā)明提供的篩選低氧適應(yīng)性綿羊的方法，通過(guò)分析與18號(hào)染色體19272.8-19322.8kb的大片段丟失變異高度連鎖(r2>0.6)的314個(gè)SNP位點(diǎn)，判斷該區(qū)域是否存在大片段丟失變異，進(jìn)而預(yù)測(cè)綿羊的低氧適應(yīng)性特性。該方法所需樣本量小，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，成本低，大大提高育種和引種的效率，方法靈活，可根據(jù)不同樣本選擇不同的SNP位點(diǎn)。并可采用TaqMan探針?lè)ɑ虻任换蛱禺愋訮CR法進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開(kāi)的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，步驟可以以任意順序?qū)崿F(xiàn)，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡(jiǎn)明它們沒(méi)有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3